CC BY
62
Том 150, кн. 2
Естественные науки
2008
УДК 581.143.6
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОРФОГЕННОЙ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ
глаоруяим тлтлтсим (ь.) олеят^
Е.А. Гумерова, Д.Б. Утина, Н.И. Румянцева Аннотация
Получена морфогенная суспензионная культура гречихи татарской. Установлено, что пролиферативная активность суспензионной культуры в 7-9 раз превышает проли-феративную активность каллусной культуры, из которой она была получена. Изучено влияние начальной плотности культивирования на характер роста культуры и изменение рН среды культивирования. Проведена оценка морфогенной способности суспензионной культуры на средах М8б/г и КХб/г. Морфогенный отклик на 12-е сутки составлял 60% на среде М8б/г в отличие от 6.4 % на среде ИХб/г.
Ключевые слова: Гречиха татарская Fagopyrum (Мапсит, суспензионная культура, проэмбриональные клеточные комплексы, соматический эмбриогенез.
Введение
Гречиха татарская - ценная пищевая культура, характерная для стран Центральной и Юго-Восточной Азии. В настоящее время эта культура вызывает повышенный интерес у селекционеров [1-3], поскольку в отличие от гречихи посевной она является самоопылителем, имеет короткий вегетационный период, устойчива к стрессовым воздействиям окружающей среды [4]. Тем не менее, приёмы культивирования клеток и регенерации растений для гречихи татарской разработаны слабо.
Ранее нами были разработаны способы получения морфогенных каллусных культур гречихи татарской [5, 6]. По сравнению с каллусной суспензионная культура обладает рядом преимуществ: быстрая пролиферация клеток, нарастание биомассы, выделение в среду культивирования вторичных соединений (белков, полисахаридов, фенольных соединений и др.) Последняя особенность позволяет изучать вклад секретируемых соединений в процессы дифференциации культивируемых клеток.
В связи с этим целью работы было получение суспензионной культуры гречихи татарской и изучение её пролиферативной и морфогенной активности.
Материалы и методы
В качестве первичного экспланта при получении суспензионной культуры использовали морфогенный каллус гречихи татарской, полученный из незрелых зародышей и поддерживаемый на агаризованной среде ИХ следующего состава (мг/л): макро- и микросоли по В5 [7], тиамин - 2.0, пиридоксин - 1.0,
никотиновая кислота - 1.0, мезоинозит - 100.0, гидролизат казеина - 2000.0, 2,4-Д - 2.0, НУК - 0.5, ИУК - 0.5, кинетин - 0.2, сахароза - 25000.0, 0.8%-ный агар, рН 5.5-5.6. Кусочки каллуса массой от 200 до 600 мг переносили в 20 мл жидкой среды аналогичного состава и культивировали в конических колбах объемом 100 мл в темноте на качалке (130 об/мин). Для дальнейших пересадок из образовавшейся культуры, используя соответствующее сито, отбирали фракцию проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) размером не больше 1.5 мм, которую промывали свежей средой для удаления одиночных клеток. Длительность пассажа составляла 14 дней.
Для опытов использовали два варианта начальной плотности культивирования: 150 мг/20 мл и 300 мг/20 мл среды (в дальнейшем - плотность I и плотность II). К моменту проведения опытов возраст суспензионной культуры составлял 6 мес.
В ходе пассажа каждые два дня снимали следующие показания: рН среды культивирования, сырой и сухой вес культуры. Перед измерением рН среду культивирования из каждой колбы центрифугировали 1 ч при скорости 4000 об/мин. Полученный осадок возвращали в соответствующую колбу. Сырой вес культуры определяли по разнице в весе колбы с биомассой и пустой колбы. Для определения сухого веса биомассу в соответствующей колбе высушивали при 60 °С до постоянного веса.
Для определения морфогенной активности суспензионной культуры использовали агаризованные (0.8%) безгормональные среды КХб/г и MS&i- (состав (мг/л): макро- и микросоли по MS [8], тиамин - 2.0, пиридоксин - 1.0, никотиновая кислота - 1.0, мезоинозит - 100.0, сахароза - 30000.0, рН 5.5-5.6). Для опыта отбирали ПЭКК размером не более 1.5 мм, отмытые от одиночных клеток соответствующей средой. Чашки Петри с высаженными ПЭКК культивировали на свету (5000 лк). Морфогенную активность культуры определяли как выраженную в процентах долю ПЭКК, образовавших соматические зародыши, корни или антоцианы.
Каждый опыт проводили в трех биологических повторностях. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием пакета статистического анализа программы Microsoft Office Excel 2003. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения при доверительной вероятности 95%.
Результаты и обсуждение
Как было показано ранее [9], морфогенный каллус гречихи татарской сохраняет морфологию, диплоидное число хромосом и способность к соматическому эмбриогенезу и геммогенезу в течение длительного времени культивирования (несколько лет). Он состоит из проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) и участков мягкого каллуса. В ходе циклического развития исходные ПЭКК разрыхляются, давая начало молодым ПЭКК и мягкому рыхлому неморфогенному каллусу. По нашим наблюдениям полученная из каллуса суспензионная культура в ходе пассажа развивалась аналогично - происходило образование новых ПЭКК и суспензии отдельных клеток (рис. 1).
продолжительность культивирования, сут.
-•— 150 мг/20 мл —О— 300 мг/20 мл
продолжительность культивирования, сут.
-•—150 мг/ 20 мл —О— 300 мг/20 мл
Рис. 2. Изменение биомассы суспензионной культуры F. tataricum в ходе пассажа при разной начальной плотности культивирования 150 мг/20 мл и 300 мг/ 20 мл: а) по сухому весу, б) по сырому весу
В ходе пассажа среда культивирования постепенно изменяла свой цвет от прозрачной до фиолетово-коричневой, что может свидетельствовать о секреции в среду культивирования фенольных соединений, синтез которых характерен для представителей рода Fagopyrum [10], и наблюдается в каллусных культурах гречихи татарской [11]. Активный синтез фенольных соединений может являться следствием высокой плотности культивирования клеток, поскольку их секреция в большей степени проявлялась при плотности II.
Из литературных данных известно, что продукция фенолов может рассматриваться как адаптивный механизм, позволяющий клеткам противостоять таким стрессорам как УФ-радиация, низкие температуры, патогены и вирусы [12, 13], тем не менее синтез и накопление фенольных соединений в культуре in vitro можно расценивать неоднозначно. С одной стороны, известно, что фенолы уча-
0,5
0,4
5 £
0,3
0,2
8 Я
0,1
а)
6 8 10 12 14 16
продолжительность культивирования, сут.
-150 мг/20 мл -О— 300 мг/20 мл
0,035
« 0,03 8
ё ^ 0,025
§ ^
1| § 0,02
2 у
г |
¡3 я 0,015 а
И 0,01
0,005
0 2 4 6 8 10 12 14 16
продолжительность культивирования, сут.
ф 150 мг/20 мл —О— 300 мг/20 мл
Рис. 3. Скорость изменения биомассы суспензионной культуры F. tataricum в ходе пассажа при различной начальной плотности культивирования 150 мг/20 мл и 300 мг/20 мл: а) по сырому весу, б) по сухому весу
ствуют в регуляции морфогенетических процессов. Например, было показано, что морфогенные суспензионные культуры хлопка аккумулируют значительно больше фенольных соединений в среде культивирования по сравнению с немор-фогенными [14], при этом спектр фенольных соединений в морфогенных и не-морфогенных суспензиях значительно различался. В работе Рейс с соавторами было показано, что добавление флороглюцинола не только усиливает индукцию соматического эмбриогенеза, но и способствует нормальному развитию соматических зародышей Feijoa sellowiana [15]. Однако накопление клетками фе-нольных соединений и выделение их в среду культивирования в критических количествах связано с развитием с окислительного стресса и угнетением роста культуры [16, 17].
0
0
2
4
0
продолжительность культивирования, сут.
Рис. 4. Изменение рН культуральной среды в ходе пассажа при различных начальных плотностях культивирования 150 мг/20 мл и 300 мг/20 мл
Как видно из рис. 2, при увеличении начальной плотности культивирования в 2 раза (с 150 до 300 мг/20 мл) максимальный прирост биомассы по сырому весу увеличивается также в 2 раза, а по сухому весу только на 20%. При этом при начальной плотности I к концу пассажа сырой вес культуры начинает снижаться, а сухой вес продолжает увеличиваться. Противоположную картину можно наблюдать при плотности культивирования 300 мг/20 мл - при постоянном увеличении сырого веса биомассы происходит падение сухого веса. Такой характер роста культур можно объяснить ростом клеток растяжением, при котором в первую очередь увеличивается вакуолизация клеток. Это приводит к увеличению оводненности клеток стареющих ПЭКК. Еще одной причиной может служить увеличение фракции одиночных сильновакуолизированных клеток при плотности II по сравнению с долей таких клеток при плотности I. В пользу этого предположения говорят и данные по скорости изменения биомассы по сырому и сухому весу (рис. 3).
Следует отметить, что за пассаж при начальной плотности культивирования I биомасса увеличивается в 14 раз, а при плотности культивирования II - в 18 раз, что в 7-9 раз превышает пролиферативную активность каллусной культуры, которая являлась предшественником исследуемой клеточной суспензии [9].
Анализ значений рН среды культивирования в ходе пассажа показал (рис. 4), что в первые двое суток происходит падение рН с 5.45 (значение рН среды культивирования после автоклавирования) до 5.09. Подкисление, а затем под-щелачивание среды наблюдается при обеих плотностях культивирования. Следует отметить, что этот процесс происходит с разной скоростью: среда культивирования при плотности II имеет значение рН ~ 6.5 уже на 6-е сутки, тогда как при плотности культивирования I это значение наблюдается только к концу пассажа. Явление подкисления среды в начале культивирования описано для многих культур [18, 19]. Падение значений рН происходит в течение первых двух суток, иногда даже первых нескольких часов культивирования [16]. Это объясняется тем, что в среде, содержащей одновременно ионы N0- и NH+,
соматические зародыши
m с
о
в ■
о
а
s
id «
m И
0 я
1
ч
о
а
70 60 50 40 30 20 10 0
70 60 50 40 30 20 10 0
а)
Î
8 сут
10 сут
□ MS б/г □ RX6^ корни
12 сут
б)
8 сут
10 сут СМвб/г □ RX6^
12 сут
антоцианы
S
id ¡4 m И
о
я
I
ч
о
а
70 60 50 40 30 20 10 0
8 сут
i
10 сут СМвб/г □ RXб/г
в)
Ï
12 сут
Рис. 5. Морфогенная способность суспензионной культуры К. tataricum на 8-й, 10-й и 12-й день культивирования на безгормональных средах М8б/г и ИХб/г: а) соматические зародыши, б) корни, в) антоцианы
в первую очередь происходит поглощение ионов NH+, что вызывает выброс протонов и подкисление среды. При истощении в среде источника ионов аммония клетки начинают использовать ионы NO- . При этом в среду выделяются
OH- -ионы, и значение рН повышается [20]. Имеется ряд исследований, в которых показано, что значение, до которого падает рН, практически не зависит от исходного значения рН среды культивирования [21-23].
Морфогенная способность суспензионной культуры гречихи татарской оценивалась на безгормональных средах RX6/i., М8б/г (рис. 5). Образование первых соматических зародышей наблюдали на 5-й день на среде М8б/г. Тенденция к образованию соматических зародышей преимущественно на среде М8б/г сохранялась и при дальнейшем культивировании. На 12-й день на этой среде 59.6% высаженных ПЭКК образовали соматические зародыши, а разница в морфоге-нетическом отклике между двумя средами составляла более 50%. Для среды RX№ было характерно образование антоцианов и разрыхление ПЭКК (рис. 6). Такая разница в морфогенетическом отклике на средах М8б/г и КХб/г, скорее всего, связана с наличием в составе среды RX6/i- гидролизата казеина, который необходим для роста каллуса [24], но, по-видимому, ингибирует развитие соматических зародышей. Образование на ПЭКК корней было характерно для обеих сред. Небольшое преимущество по количеству (~ 5%) и длине корней наблюдалось у ПЭКК на среде М8б/г.
Таким образом, была получена морфогенная суспензионная культура гречихи татарской с высокой пролиферативной активностью и высокой регенера-ционной способностью, которая может быть использована в работах по генетической трансформации и как модель для изучения процессов регуляции морфогенеза in vitro.
Summary
E.A. Gumerova, D.B. Utina, N.I. Rumyantseva. Establishment and Characterization of Morphogenic Suspension Culture of Tatar Buckwheat Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.
The morphogenic suspension culture of tatar buckwheat was obtained. It was established that the proliferative activity of suspension culture 7-9 times exceeds the proliferative activity of callus culture, from which it was obtained. The effect of the initial cell density on growth of culture and a change of pH medium were studied. The estimation of morphogenic ability of suspension culture was carried out on the non-hormone media MS and RX. Morphogenic response on 12th day of culture on MS medium was 60% in contrast to 6.4% on RX medium.
Key words: tatar buckwheat Fagopyrum tataricum, suspension culture, proembryogenic cell complexes, somatic embryogenesis.
Литература
1. Samimy C. Barrier to interspecific crossing of Fagopyrun esculentum with Fagopyrum tataricum: I. Site of pollen-tube arrest. II. Organogenesis from immature embryos of
F. tataricum // Euphytica. - 1991. - V. 54, No 3. - P. 215-219.
2. Adachi T., Yamaguchi A., Miike Y., Hoffman F. Plant regeneration from protoplasts of common buckwheat (Fagopyrum esculentum) // Plant Cell Rep. - 1989. - V. 8, No 4. -P. 247-250.
3. Woo S.-H., ParkM.-H., Cho S.-W., Kim T.-S., ChungK.-Y., Adachi T, Jon S.-K. Over-comining breeding barriers and embryo rescue enhancement of interspecific hybrids in genus Fagopyrum // J. Agr. Sci. - 2006. - V. 23, No 1. - P. 21-26.
4. Adachi T. Is it possible to overcome the low yield of buckwheat by means of biotechnology? // Proc. 3rd Int. Symp. on Buckwheat, Pulawy, Poland. - 1986. - P. 108-116.
5. Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э., Сальников В.В., Гумерова Е.А., Лозовая В.В. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи // Физиол. раст. - 1989. - Т. 36, Вып. 1. - С. 187-194.
6. Лукина Ю.А., Румянцева Н.И. Каллусогенез и морфогенез в культуре незрелых зародышей различных видов рода Fagopyrum (Polygonaceae) // Бот. журн. - 1999. -Т. 84, № 3. - С. 74-79.
7. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Plant cell cultures. I. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells // Exp. Cell Res. - 1968. - V. 50, No 1. -P. 151-158.
8. Murashige Y., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol Plant. - 1962. - V. 15, No 3. - P. 473-497.
9. Румянцева Н.И., Валиева А.И., Самохвалова Н.А., Мухитов А.Р., Агеева М.В., Лозовая В.В. Особенности лигнификации клеточных стенок каллусов гречихи, различающихся по способности к морфогенезу // Цитология. - 1998. - Т. 40, № 10. -С. 835-842.
10. Oomah B.D., Campbell C.G., Mazza G. Effects of cultivar and environment on phenolic acids in buckwheat // Euphytica. - 1996. - V. 90, No 1. - P. 73-77.
11. Lozovaya V., Gorshkova T., Yablokova E., Zabotina O., Ageeva M., Rumyantseva N., Kolesnichenko E., Waranyuwat A., Widholm J. Callus cell wall phenolics and plant regeneration ability // J. Plant Physiol. - 1996. - V. 148, No 6. - P. 711-717.
12. Dixon R.A., Paiva N.L. Stress-induced phenylpropanoid metabolism // Plant Cell. - 1995. -V. 7, No 7. - P. 1085-1097.
13. Solecka D., Kacperska A. Phenylpropanoid deficiency affects the course of plant acclimation to cold // Physiol Plant. - 2003. - V. 119, No 2. - P. 253-262.
14. Kouakou T., Pierre Waffo-Teguo P., Kouadio Y.J., Valls J., Richard T., DecenditA., Merillon J.-M. Phenolic compounds and somatic embryogenesis in cotton (Gossypium hirsutum L.) // Plant Cell Tiss. Organ Cult. - 2007. - V. 90, No 1. - P. 25-29.
15. Reis E., BatistaM.T., Canhoto J.M. Effect and analysis of phenolic compounds during somatic embryogenesis induction in Feijoa sellowiana Berg. // Protoplasma. - 2008. -V. 232, No 3-4. - P. 193-202.
16. Dordas C., Brown P.H. Boron deficiency affects cell viability, phenolic leakage and oxidative burst in rose cell cultures // Plant and Soil. - 2005. - V. 268, No 1. - P. 293-301.
17. Bolwell G.P., Butt V.S., Davies D.R., Zimmerlin A. The origin of the oxidative burst in plants // Free Radical Res. - 1995. - V. 23, No 6. - P. 517-532.
18. Skirvin R.M., Chu M.C., Mann M.L., Young H., Sullivan J., Fermanian T. Stability of tissue culture medium pH as a function of autoclaving, time, and cultured plant material // Plant Cell Reports. - 1986. - V. 5, No 4. - P. 292-294.
19. Chung J.-P., Chang T.-L., ChiA.Y.-M., Shii C. T. Triploid banana cell growth phases and the correlation of medium pH changes with somatic embryogenesis in embryogenic cell suspension culture // Plant Cell Tiss. Organ Cult. - 2006. - V. 87, No 3. - P. 305-314.
20. Thorpe T., Stasolla C., Yeung E.C., Klerk G.-J. de, Roberts A., George E.F. The components of plant tissue culture media II. Organic additions, osmotic and pH effects, and support systems // Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Ed. V. 1: The Background / Ed. by E.F. George, M.A. Hall, G.-J. de Klerk. - Springer, 2008. - P. 115-173.
21. Pasqua G., Manes F., Monacelli B., Natale L., Anselmi S. Effects of the culture medium pH and ion uptake in in vitro vegetative organogenesis in thin cell layers of tobacco // Plant Sci. - 2002. - V. 162, No 6. - P. 947-955.
22. Zhang W., Furusaki S. Regulation of anthocyanin synthesis in suspension cultures of strawberry cell by pH // Biotechnol. Lett. - 1997. - V. 19, No 11. - P. 1057-1061.
23. ShangX.M., Huang J.Y., Haigler C.H., Trolinder N.L. Buffer capacity of cotton cells and effects of extracellular pH on growth and somatic embryogenesis in cotton cell suspensions // In Vitro Cell. Dev. Biol. - 1991. - V. 27, No 3. - P. 147-152.
24. Костюкова Ю.А. Особенности каллусогенеза и морфогенеза в культуре тканей различных видов гречихи: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Казань: КИББ КазНЦ РАН, 1999. - 20 с.
Поступила в редакцию 21.02.08
Гумерова Елена Азатовна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.
E-mail: gumerova@mail.knc.ru
Утина Дарья Борисовна - сотрудник лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.
E-mail: evrica_decada@list.ru
Румянцева Наталья Ивановна - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией физиологии и генетики культивируемых клеток Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.
E-mail: rumyantseva@mail.knc.ru
Рис. 1. Суспензионная культура F. tataricum на 8-й день культивирования: черная стрелка - ПЭКК, белая стрелка - суспензия одиночных клеток. Ув. 40
Рис. 6. Морфогенная способность суспензионной культуры F. tataricum: а) соматический эмбриогенез на среде М8б/г, б) образование антоцианов и разрастание ПЭКК на среде ИХб/г. Ув. 12.5
