CC BY
36
DOI: 10.21055/0370-1069-2021-3-83-88
УДК 616.98:579.842.15
Г.В. Куклина, С.С. Ипатов, Д.В. Печенкин, А.В. Еремкин, А.А. Кытманов, М.Ю. Дубровин,
А.С. Горшков
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГИБРИДОМ-ПРОДУЦЕНТОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ШИГАПОДОБНЫМ ТОКСИНАМ I И II ТИПОВ
Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Киров,
Российская Федерация
Цель - получить и охарактеризовать гибридомы-продуценты моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов. Материалы и методы. В работе использованы препараты шигаподобных токсинов I и II типов, полученные в филиале ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Киров); мыши линии BALB/c; клетки миеломы SP2/0-Ag14. Гибридизацию спленоцитов иммунных мышей и миеломных клеток проводили по методике G. Kohler и C. Milstein в модификации De St. Fazekas и D. Scheidegger с использованием 50 % полиэтилен-гликоля. Гибридные клеточные линии, продуцирующие специфические моноклональные антитела, клонировали методом лимитирующих разведений. Изучение ростовых и секреторных свойств гибридом проводили при культивировании in vitro и in vivo. Специфическую активность иммунных сывороток, культуральных и асцитических жидкостей гибридом исследовали методом непрямого иммуноферментного анализа. Моноклональные антитела из асцитических жидкостей выделяли осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой ионообменной хроматографией. Результаты и обсуждение. Получена панель из 8 гибридом-продуцентов моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов. Гибридомы характеризуются стабильностью пролиферативной и антителопродуцирующей активности на протяжении десяти пассажей in vitro и трех пассажей in vivo (срок наблюдения). Полученные моноклональные антитела могут быть использованы для детекции иммунофермент-ным методом шигаподобных токсинов I и II типов. При этом минимальная выявляемая концентрация искомых аналитов в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа составила 1 нг/мл. Показана возможность выявления шигаподобных токсинов без типовой дифференциации при использовании в иммуноферментном анализе поли-рецепторной смеси моноклональных антител для сенсибилизации планшета и полиспецифичной смеси иммуно-пероксидазных конъюгатов.
Ключевые слова: шигаподобные токсины, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ.
Корреспондирующий автор: Печенкин Денис Валериевич, e-mail: 23527@mil.ru.
Для цитирования: Куклина ПВ., Ипатов С.С., Печенкин Д.В., Еремкин А.В., Кытманов А.А., Дубровин М.Ю., Горшков А.С. Получение и характеристика гибридом-продуцентов моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 3:83-88. DOI: 10.21055/03701069-2021-3-83-88.
Поступила 23.09.2020. Отправлена на доработку 20.10.2020. Принята к публ. 30.10.2020.
G.V. Kuklina, S.S. Ipatov, D.V. Pechenkin, А.У Eremkin, А.Л. Kytmanov, M.Yu. Dubrovin, A.S. Gorshkov
Obtaining and Characterization of Hybridomas Producing Monoclonal Antibodies to Shiga-Like Toxins of I and II Types
Affiliated Branch of the Federal State Budgetary Institution "48th Central Research Institute" of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Kirov, Russian Federation
Abstract. Objective - obtaining and characterization of hybrid cell lines producing monoclonal antibodies against I and II types of shiga-like toxins. Materials and methods. Shiga-like toxins obtained in "48th Central Research Institute" of Ministry of Defense of Russian Federation (Kirov), BALB/c mice, myeloma cells SP2/0-Ag14 were used in research. Immune splenocytes and SP2/0-Ag14 myeloma cells were fused according to G. Kohler and C. Milstein method in De St. Fazekas and D. Scheidegger modification using 50 % polyethylene glycol. Hybrid cell lines producing specific monoclonal antibodies were cloned by limited dilutions. Hybridomas growth and producing properties were studied in vitro and in vivo. Specific activity of immune sera, culture and ascitic fluids were studied by indirect ELISA. Monoclonal antibodies from ascitic fluids were precipitated by saturated ammonium sulfate, followed by ion exchange chromatog-raphy. Results and discussion. 8 hybridomas producing monoclonal antibodies against I and II types shiga-like toxins were obtained. Hybridomas are characterized by stable proliferation and antibody-producing activity during 10 passages in vitro and 3 passages in vivo (observation period). Obtained monoclonal antibodies can be used for ELISA detection of I and II types shiga-like toxins. Minimum detectable concentration of shiga-like toxins in sandwich ELISA is 1 ng/ml. The possibility of detecting shiga-like toxins without typical differentiation was shown when using in the enzyme immunoassay a polyreceptor mixture of monoclonal antibodies for sensitizing the plate and a polyspecific mixture of immunoperoxidase conjugates.
Key words: shiga-like toxins, monoclonal antibodies, and enzyme linked immunosorbent assay.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Denis V. Pechenkin, e-mail: 23527@mil.ru.
Citation: Kuklina G.V., Ipatov S.S., Pechenkin D.V., Eremkin A.V., Kytmanov A.A., Dubrovin M.Yu., Gorschkov A.S. Obtaining and Characterization of Hybridomas Producing Monoclonal Antibodies to Shiga-Like Toxins of I and II Types. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; 3:83-88. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2021-3-83-88.
Received 23.09.2020. Revised 20.10.2020. Accepted 30.10.2020.
Kuklina G.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5429-6295 Ipatov S.S., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2881-4730 Pechenkin D.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8277-3573 Eremkin A.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3133-1921
Одной из наиболее значимых групп бактериальных токсинов является семейство шигаподоб-ных токсинов (Stx), которое включает шигеллезный токсин, продуцируемый Shigella dysenteriae, а также шигаподобные токсины I и II типов (Stxl и Stx2). Основными природными продуцентами Stxl и Stx2 являются шигатоксинпродуцирующие штаммы Escherichia coli (STEC) [1].
Представители семейства Stx имеют сходную молекулярную структуру, для которой характерно наличие одной субъединицы А (~32 кДа) и пяти субъединиц В (~7,7 кДа каждая). В субъединице А выделяют также связанные между собой дисульфидной связью фрагменты А1 и А2, которые разделяются после проникновения в клетку-мишень, после чего фрагмент А1 блокирует синтез белка в клетке [2].
Клинически для инфекционного процесса, вызванного STEC, характерно развитие диареи с явлениями геморрагического колита [3, 4]. Примерно в 5 % случаев колиту сопутствует системный гемолиз, что приводит к развитию гемолитико-уремического синдрома. Особенно высокий уровень летальности при этом наблюдается у новорожденных детей [5]. Отмечено, что наиболее часто гемолитико-уремический синдром ассоциирован с продукцией шигаподобного токсина второго типа - Stx2, что обусловливает актуальность разработки средств лабораторной диагностики Stx2 и шигаподобных токсинов в целом [6].
Вспышки заболеваний, вызываемых STEC, происходят регулярно. Как правило, частой причиной вспышек является кишечная палочка серотипа О157. В то же время наиболее известной является вспышка 2011 г. в Европе, вызванная кишечной палочкой серотипа 0104:H4. По данным Всемирной организации здравоохранения, в результате этой вспышки погибло 53 человека [7, 8].
На современном этапе развития средств диагностики шигаподобных токсинов значительное место занимают иммунохимические средства. Они представлены как на зарубежном, так и на отечественном рынке. Фирма R-Biopharm AG (Германия) производит и реализует наборы мультиплексного иммуно-хроматографического анализа для одновременного выявления Stxl, Stx2 и специфического антигена O157 - RIDA®QUICK Verotoxin/O157 Combi. Этот же производитель предлагает набор RIDASCREEN® Verotoxin для иммуноферментного полуколичественного выявления шигаподобных токсинов.
Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации разработаны и утвержде-
Kytmanov A.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0277-2226 Dubrovin M.Y., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9171-1603 Gorshkov A.S., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5164-3645
ны к применению методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых E. coli, продуцирующих шигаподобные токсины -инфекции в пищевых продуктах, - МУК 4.2.2963-11. Данные МУК предусматривают использование диагностических наборов для латекс-агглютинации производства ФБУН ГНЦ ПМБ (Россия) и иммунох-роматографических наборов DUOPATH®Verotoxins (Merck Millipore, США).
Таким образом, наиболее востребованными средствами диагностики шигаподобных токсинов на сегодняшний день являются иммунохимические наборы реагентов. Для создания современных средств иммунодиагностики оптимальным вариантом является использование моноклональных антител (МКАТ). Главным источником МКАТ по-прежнему остаются гибридные клеточные линии.
В рамках настоящей работы проведен комплекс исследований по получению гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к шигаподобным токсинам I и II типов, и исследование возможности использования МКАТ в иммунохимических тестах, предназначенных для выявления Stxl и Stx2.
Материалы и методы
В работе использованы препараты шигапо-добных токсинов, полученные из культураль-ных жидкостей культур E. coli следующих штаммов: рекомбинантный - продуцент Stxl; RKI № 112027 (серотип 0104:Н4) - продуцент Stx2. Специфическую активность препаратов шигаподоб-ных токсинов контролировали в иммунофермент-ном тесте RIDASCREEN®Verotoxin (R-B^ham AG, Германия) и в иммунохроматографическом экспресс-тесте DUOPATH®Verotoxin (Merck Millipore, США). Концентрацию белка во всех случаях определяли по методу Лоури [9].
Гибридизацию спленоцитов иммунизированных животных с клетками миеломы Sр2/0-Ag14 проводили на четвертые сутки после заключительной иммунизации с использованием 50 % раствора по-лиэтиленгликоля ПЭГ 1450 (Sigma-Aldrich, США) [10, 11].
Исследование специфической активности гипериммунных сывороток, культуральных и асцити-ческих жидкостей проводили методом непрямого ИФА [12]. Планшеты NUNC™ (Thermo Scientific, Дания) для постановки ИФА сенсибилизировали шигаподобными токсинами в концентрации 10 мкг/мл. Сыворотки для исследования готовили путем последовательных двукратных разведений
от 1:1000 до 1:512000, культуральные жидкости -от 1:50 до 1:6400, асцитические жидкости - от 1:10000 до 1:10240000. Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов мыши (Sigma-Aldrich, США) применяли в рабочем разведении. Для выявления продуктов реакции использовали субстратно-индикаторную смесь на основе ортофе-нилендиамина (Sigma-Aldrich, США). Результаты реакции учитывали путем определения оптической плотности субстратно-индикаторной смеси на планшетном фотометре.
Для получения асцитических жидкостей мышам линии BALB/c интраперитонеально вводили по 0,5 мл минерального масла Pristane (Sigma-Aldrich, США), а через 14 суток - 2 млн гибридных клеток.
Иммуноглобулины из асцитических жидкостей выделяли осаждением насыщенным раствором сульфата аммония с последующей очисткой ионообменной хроматографией на DEAE Toyopearl (Tosoh Bioscience, США).
Синтез иммунопероксидазных конъюгатов (ИПК) осуществляли методом периодатного окисления [13].
Для определения минимальных выявляемых концентраций (чувствительности ИФА) использовали последовательные двукратные разведения препаратов шигаподобных токсинов от 128 до 1 нг/мл. Для выполнения сэндвич-варианта ИФА иммунологические планшеты сенсибилизировали различными МКАТ в концентрации 20 мкг/мл. Для сенсибилизации планшета также использовали коммерческие МКАТ к В-субъединицам Stx1 и Stx2 (MyBioSource, США, кат. № MBS146695, MBS146696). На следующем этапе в планшеты вносили приготовленные разведения шигаподобных токсинов, а затем синтезированные ИПК в рабочем разведении. Далее постановку ИФА осуществляли, как описано выше.
Работы с лабораторными животными проводились в соответствии с международными этическими нормами, законодательством Российской Федерации и нормативными документами учреждения.
Результаты и обсуждение
С целью получения гибридом-продуцентов мо-ноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов иммунизацию мышей линии BALB/c проводили путем подкожного введения возрастающих доз препаратов анатоксинов (Stx1, Stx2). Иммунизация линейных мышей шигаподобными анатоксинами обеспечила титры специфических антител в крови опытных животных на уровне 1:64000 и 1:128000. Животных с максимальным уровнем сероконверсии использовали в качестве источника иммунных спле-ноцитов в опытах по гибридизации.
Всего проведено по два эксперимента по гибридизации для каждого типа токсина. В результате опытов по слиянию иммунных спленоцитов и мие-ломных клеток получены 15 популяций гибридных
клеток, продуцирующих антитела к шигаподобному токсину I типа, и 18 популяций - к шигаподобному токсину II типа. С целью отбора наиболее перспективных для клонирования растущих гибридных клеток оценивали их морфологию, пролиферативную активность, а также способность сохранять высокий уровень синтеза специфических антител. По результатам ИФА наиболее выраженный уровень продукции МКАТ к Stxl в титрах от 1:400 до 1:1600 отмечен у гибридных клеточных линий 368D5, 383D5, 383F4, 384A10, а к Stx2 - у 361D6, 363B3, 365E11, 366E6. Клонирование культур гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений из расчета одна клетка на лунку. Клонирование повторяли не менее двух раз, отбирая на каждой стадии клоны с наибольшей пролиферативной активностью и устойчивым синтезом специфических антител. В результате клонирований от 95 до 100 % клеток в популяциях стабильно продуцировали антитела к шигаподоб-ным токсинам.
Таким образом, в результате проведенных гибридизаций и последующих клонирований получены гибридомы-продуценты моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов. Гибридные клетки размножали путем пассирования в культу-ральных планшетах и культуральных флаконах возрастающего объема. При этом минимальная посевная концентрация клеток составила 100 и 200 тыс. в 1 мл, а антителопродуцирующая активность на протяжении десяти пассажей in vitro сохранялась на уровне титров антител в ИФА от 1:400 до 1:1600 (табл. 1). Пролиферирующие in vitro гибридные клетки вводили внутрибрюшинно мышам линии BALB/c. В результате получены асцитические жидкости, характеризующиеся титрами специфических антител в ИФА от 1:640000 до 1:5120000. Следует отметить, что на протяжении трех пассажей in vivo (количество проведенных нами исследований) гибридные клетки стабильно синтезировали антитела.
В серии экспериментов по определению чувствительности сэндвич-варианта ИФА при выявлении шигаподобных токсинов I и II типов использованы все возможные сочетания МКАТ для сенсибилизации планшета и в составе ИПК. Как видно из данных табл. 2, результат ИФА отрицателен при одновременном использовании МКАТ, продуцируемых гибридомой 383F4, в сенситине и конъюгате. Остальные сочетания МКАТ к шигаподобному токсину I типа позволяют выявлять методом ИФА Stx1 в концентрациях от 1 до 32 нг/мл. При этом наибольшую чувствительность анализа обеспечивают пары МКАТ «сенситин - конъюгат»: 383F4-384A10, 384A10-383F4, 384А10-384А10. При использовании в качестве антител захвата коммерческих МКАТ к В-субъединице шигаподобного токсина I типа (MyBioSource, США) получены результаты чувствительности ИФА того же порядка.
Результаты исследования чувствительности сэндвич-варианта ИФА при выявлении шигапо-
Таблица 1 / Table 1
Характеристики гибридом-продуцентов моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов Features of hybridomas producing monoclonal antibodies to shiga-like toxins of I and II types
Наименование гибридомы-продуцента МКАТ Hybridoma-producer of monoclonal antibodies (MCAb) Специфичность МКАТ MCAb specificity Минимальная посевная концентрация, тыс. клеток в 1 мл Minimum inoculum concentration, thous. of cells per 1 ml Титр МКАТ в культуральной жидкости MCAb titer in culture liquid Титр МКАТ в асцитической жидкости MCAb titer in ascitic liquid
368D5 Stxl 100 1:1600 1:5120000
383D5 200 1:400 1:1280000
383F4 200 1:400 1:1280000
384A10 200 1:800 1:1280000
361D6 Stx2 200 1:800 1:2560000
363B3 100 1:1600 1:5120000
365E11 200 1:800 1:2560000
366E6 200 1:400 1:640000
Таблица 2 / Table 2
Чувствительность иммуноферментного анализа при выявлении шигаподобного токсина I типа Sensitivity of ELISA when detecting shiga-like toxin of type I
Минимальная выявляемая концентрация шигаподобного токсина I типа в ИФА при использовании ИПК на основе антител, нг/мл (n=7)
Антитела, используемые для сенсибилизации планшета Antibodies used for plate sensibilization Minimum detected concentration of shiga-like toxin (type I) in ELISA using antibody-based immunoperoxidase conjugates, ng/ml (n=7)
МКАТ368D5 МКАТ383D5 МКАТ383F4 МКАТ384A10
MCAb 368D5 MCAb 383D5 MCAb 383F4 MCAb384A10
МКАТ 368D5 32 8 2 4
MCAb 368D5
МКАТ 383D5 16 16 2 2
MCAb 383D5
МКАТ 383F4 2 2 1
MCAb 383F4
МКАТ 384A10 2 2 1 1
MCAb 384A10
1В 8 8 4 8
Примечание: в таблице приведены медианы минимальных выявляемых концентраций; «—» - результат ИФА отрицательный; 1В - МКАТ МуВ^оигсе (США) к В-субъединице шигаподобного токсина I типа.
Note: the table shows the medians of the minimum detectable concentrations; "—" - the ELISA result is negative; 1B - MCAb MyBioSource (USA) to the B-subunit of type I shiga-like toxin.
добного токсина II типа представлены в табл. 3. Использование различных сочетаний МКАТ в сенси-тине и составе ИПК, в том числе использование для сенсибилизации планшета антител к В-субъединице шигаподобного токсина II типа (МуВю8оигсе, США), обеспечивает выявление в ИФА Stx2 в концентрациях от 1 до 16 нг/мл. При этом максимальная чувствительность проведенного анализа получена с использованием МКАТ 365Е11 как в сенситине, так и в составе ИПК.
На заключительном этапе исследований представлялось необходимым оценить возможность использования МКАТ, продуцируемых полученными гибридными клеточными линиями, для выявления шигаподобных токсинов обоих типов (без дифференциации) при выполнении одной постановки им-
муноферментного анализа. Для этого иммунологический планшет сенсибилизировали равновесной по концентрации белка смесью МКАТ 384А10 (к Stxl) и МКАТ 365Е11 (к Stx2). Процедуру сэндвич-варианта анализа выполняли так, как описано выше, в качестве аналитов использовали различные разведения шигаподобных токсинов обоих типов. Для выявления связавшихся токсинов применяли равнообъем-ную смесь иммунопероксидазных конъюгатов, взятых в разведениях, в два раза превышающих рабочие. В постановке ИФА использованы ИПК на основе МКАТ 383F4 (к Stxl) и на основе МКАТ 365Е11 (к Stx2). Результаты данного эксперимента подтвердили возможность одновременного выявления ши-гаподобных токсинов I и II типов в концентрациях 1 нг/мл и выше в одной постановке ИФА.
Таблица 3 / Table 3
Чувствительность иммуноферментного анализа при выявлении шигаподобного токсина II типа Sensitivity of ELISA when detecting shiga-like-toxin of type II
Минимальная выявляемая концентрация шигаподобного токсина II типа в ИФА при использовании ИПК на основе антител, нг/мл (n=7)
Антитела, используемые для сенсибилизации планшета Antibodies used for plate sensibilization Minimum detected concentration of shiga-like toxin (type II) in ELISA using antibody-based immunoperoxidase conjugates, ng/ml (n=7)
MKАT361D6 MKАT363B3 MKАT365E11 MKАT366E6
MCAb 361D6 MCAb 363B3 MCAb 365E11 MCAb366E6
МКАТ 361D6 4 4 4 8
MCAb 361D6
МКАТ 363B3 4 16 4 8
MCAb 363B3
МКАТ 365E11 4 2 1 4
MCAb 365E11
МКАТ 366E6 4 4 2 4
MCAb366E6
2B 2 8 4 4
Примечание: в таблице приведены медианы минимальных выявляемых концентраций; 2В - МКАТ МуВ^оигсе (США) к В-субъединице шигаподобного токсина II типа.
Note: the table shows the medians of the minimum detectable concentrations; 2B - MCAb MyBioSource (USA) to the B-subunit of type II shiga-like toxin.
В результате проведенных исследований получены по четыре гибридомы, продуцирующие моно-клональные антитела к шигаподобным токсинам I и II типов и сохраняющие стабильность основных свойств на протяжении десяти пассажей in vitro и трех пассажей in vivo. Получены моноклональные антитела, позволяющие в сэндвич-варианте иммуно-ферментного анализа выявлять шигаподобные токсины I и II типов в концентрации 1 нг/мл и более.
Показана возможность выявления шигаподоб-ных токсинов без типовой дифференциации при использовании в ИФА полирецепторной смеси МКАТ для сенсибилизации планшета и полиспецифичной смеси иммунопероксидазных конъюгатов.
Гибридомы-продуценты и моноклональные антитела планируется использовать для изготовления иммунохимических наборов реагентов для выявления шигаподобных токсинов I и II типов.
Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
Список литературы
1. Melton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx) classification, structure, and function. Microbiol. Spectr. 2014; 2(4):EHEC-0024-2013. DOI: 10.1128/microbiolspec.EHEC-0024-2013.
2. Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L., Wool I.G. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993; 90(20):9581-5. DOI: 0.1073/ pnas.90.20.9581.
3. Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J. Anim. Sci. 2007; 85(13):E45-E62.DOI: 10.2527/jas.2006-508.
4. Paletta A.C.C., Castro V.S., Conte-Junior C.A. Shiga toxin-producing and enteroaggregative Echerichia coli in animal, foods and humans: pathogenicity mechanisms, detection methods, and epidemiology. Curr. Microbiol. 2020; 77(4):612-20. DOI: 10.1007/ s00284-019-01842-1.
5. Taylor С.М. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr. Nephrol. 2008; 23(9):1425-31. DOI: 10.1007/s00467-008-0820-3.
6. Joseph A., Cointe A., Kurkdjian P.M., Rafat C., Hertig A. Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome: а narrative review. Toxins (Basel). 2020; 12(2):67. DOI: 10.3390/toxins 2020067.
7. E. coli: Rapid Responce in a crisis. European Food Safety Authority. [Электронный ресурс]. URL: www.efsa.europa.eu/en/ press/news/120711 (дата обращения 10.07.2020).
8. Онищенко Г.Г., Дятлов И.А., Светоч Э.А., Воложанцев Н.В., Баннов В.А., Карцев Н.Н., Борзенков В.Н., Фурсова Н.К., Шемякин И.Г., Богун А.Г., Кисличкина А.А., Попова А.В., Мякинина В.П., Теймуразов М.Г., Полосенко О.В., Кафтырева Л.А., Макарова М.А., Матвеева З.Н., Гречанинова Т. А., Григорьева Н.С., Кича Е.В., Забалуева Г.В., Кутасова Т.Б., Коржаев Ю.Н., Башкетова Н.С., Бушманова О.Н., Сталевская А.В., Чхинджерия И.Г., Жебрун А.Б. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсинпродуцирующих Escherichia coli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году. Вестник РАМН. 2015; 1:70-81. DOI: 10.15690/vramn.v70i1.1234.
9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1):265-75.
10. De StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods. 1980; 35(1-2):1-21. DOI: 10.1016/0022-1759(80)90146-5.
11. Kohler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256(5517):495-7. DOI: 10.1038/256495a0.
12. К йэтти Д., редактор. Антитела. Методы: Кн. 2: пер. с англ. М.: Мир; 1991. 384 с.
13. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12): 1084-91. DOI: 10.1177/22.12.1084.
References
1. Melton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx) classification, structure, and function. Microbiol. Spectr. 2014; 2(4):EHEC-0024-2013. DOI: 10.1128/microbiolspec.EHEC-0024-2013.
2. Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L., Wool I.G. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993; 90(20):9581-5. DOI: 0.1073/ pnas.90.20.9581.
3. Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J. Anim. Sci. 2007; 85(13):E45-E62.DOI: 10.2527/jas.2006-508.
4. Paletta A.C.C., Castro V.S., Conte-Junior C.A. Shiga toxin-producing and enteroaggregative Echerichia coli in animal, foods and humans: pathogenicity mechanisms, detection methods, and epidemiology. Curr. Microbiol. 2020; 77(4):612-20. DOI: 10.1007/ s00284-019-01842-1.
5. Taylor C.M. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome.
Pediatr. Nephrol. 2008; 23(9):1425-31. DOI: 10.1007/s00467-008-0820-3.
6. Joseph A., Cointe A., Kurkdjian P.M., Rafat C., Hertig A. Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome: a narrative review. Toxins (Basel). 2020; 12(2):67. DOI: 10.3390/toxins 12020067.
7. E. coli: Rapid Responce in a crisis. European Food Safety Authority. (Cited 10 Jul 2020). [Internet]. Available from: www.efsa. europa.eu/en/press/news/1207l 1.
8. Onishenko G., Dyatlov I., Svetoch N., Volozhantsev N.V., Bannov V.A., Kartsev N.N., Borzenkov V.N., Fursova N.K., Shemyakin I.G., Bogun A.G., Kislichkina A.A., Popova A.V., Myakinina V.P., Teimurazov M.G., Polosenko O.V., Kaftyreva L.A., Makarova M.A., Matveeva Z.N., Grechaninova T.A., Grigor'eva N.S., Kicha E.V., Zabalueva G.V., Kutasova T.B., Korzhaev Yu.N., Bashketova N.S., Bushmanova O.N., Stalevskaya A.V., Chkhinzheria I.G., Zhebrun A.B. [Molecular genetic characteristics of shiga-toxins released during a food outbreak in St. Petersburg in 2013]. Vestnik Rossiiskoj Akademii Meditsinskikh Nauk [Bulletin of the Russian Academy of Medical Sciences]. 2015; 1:70-81. DOI: 10.15690/ vramn.v70i1.1234.
9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193H):265-75.
10. De StGroth S.F., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods. 1980;
35(1-2):1-21. DOI: 10.1016/0022-1759(80)90146-5.
11. Kohler G., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256(5517):495-7. DOI: 10.1038/256495a0.
12. Ketty D, editor. [Antibodies. Methods: Book 2. Translated from English]. Moscow: "Mir"; 1991. Vol. 2. 384 p.
13. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12): 1084-91. DOI: 10.1177/22.12.1084.
Authors:
Kuklina G.V., Ipatov S.S., Pechenkin D.V., Eremkin Ä.V., Kytmanov Ä.A., Dubrovin M.Yu., Gorshkov A.S. Affiliated Branch of the Federal State Budgetary Institution "48th Central Research Institute" of the Ministry of Defense of the Russian Federation. Kirov, Russian Federation. E-mail: 23527@mil.ru.
Об авторах:
Куклина Г.В., Ипатов С.С., Печенкин Д.В., Еремкин А.В., Кытманов А.А., Дубровин М.Ю., Горшков А.С. Филиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации. Российская Федерация, Киров. E-mail: 23527@mil.ru.
