CC BY
31
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
DOI: 10.23868/202003004
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА С ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ HIF-2a
М.К. Живень1, 2, И.С. Захарова1, 2, А.И. Шевченко1, 2, Е.А. Елисафенко1, 2, К.Е. Орищенко1, С.М. Закиян1, 2
1 Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
2 Национальный медицинский исследовательский центр им. академика Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия
GENERATION AND CHARACTERiZATiON OF HUMAN EMRYONiC STEM CELLS WiTH INCREASED EXPRESSION OF HIF-2a
M.K. Zhiven1, 2, I.S. Zakharova1, 2, A.I. Shevchenko1, 2, E.A. Elisaphenko1, 2, К.Е. Orishchenko1, S.M. Zakian1, 2
11nstitute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the RAS, Novosibirsk, Russia 2 E.N. Meshalkin National Medical Research Center, Novosibirsk, Russia
e-mail: [email protected]
Факторы, индуцируемые гипоксией (HIFs), являются ДНК-связывающими транскрипционными факторами, которые играют ключевую роль в адаптивной реакции на гипоксические условия. HIFs стабилизируются при гипоксии, но деградируют при нормальной концентрации кислорода.
Субъединица HIF-2a вовлечена в механизмы регуляции транскрипционных факторов, контролирующих процессы самообновления в плюрипотентных стволовых клетках человека, эмбрионального развития сердечно-сосудистой системы, а также ангиогенеза путем активации каскада ангиогенных факторов в физиологических и патологических процессах. На сегодняшний день модуляция экспрессии HIF-2a рассматривается в качестве перспективной стратегии терапевтической коррекции ишемических и онкологических заболеваний. Однако выбор оптимальных методов эффективной регуляции HIF-2a остается нерешенной задачей. Целью исследования является получение эмбриональных стволовых клеток человека с повышенной экспрессией HIF-2a при нормальной концентрации кислорода за счет сайленсинга INT6, регулятора HIF-2a. Генетически модифицированные эмбриональные стволовые клетки человека с повышенной экспрессией HIF-2a были получены в условиях нормального содержания кислорода с помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9, направленной на формирование делеции участка гена INT6 — ингибитора HIF-2a. Исследование генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток человека может внести вклад в понимание связи гипоксии и плюрипотентности, а получение дифференцированных эндоте-лиальных производных плюрипотентных стволовых клеток с повышенной экспрессией HIF-2a и усиленным регенеративным потенциалом стать основой для разработки перспективных стратегий борьбы с ишемическими заболеваниями.
Ключевые слова: плюрипотентные стволовые клетки человека, факторы, индуцируемые гипоксией (HIFs), INT6, ангиоге-нез, CRISPR/Cas9, геномная инженерия.
Hypoxia-induced factors (HIFs) are DNA-binding transcription factors that play an important role in the adaptive response to hypoxic conditions. HIFs are stabilized in hypoxia, but degraded in normoxia.
The HIF-2a subunit is involved in regulation of transcription factors, controlling the self-renewal of human pluripotent stem cells, embryonic development of the cardiovascular system and the regulation of angiogenesis by transcriptional activation of angiogenic cascades in physiological and pathological processes. Currently, modulation of HIF-2a expression is considered as a promising strategy for the treatment of ischemic and cancer diseases. However, the problem of choosing the optimal methods of effective regulation of HIF-2a remains. The aim of this study is to obtain human embryonic stem cells with increased expression of HIF-2a at normal oxygen concentration due to silencing of INT6, the regulator of HIF-2a. In this study, we obtained genetically modified human embryonic stem cells with increased expression of HIF-2a under atmospheric oxygen conditions. The approach used is based on a CRISPR/Cas9-mediated deletion of a part of the INT6 gene, an HIF-2a inhibitor. A study of the resulting genetically modified human embryonic stem cells will contribute to an understanding of the connection between hypoxia and pluripotency. Obtaining endothelial derivatives of pluripotent stem cells with increased expression of HIF-2a and enhanced regenerative potential may become the basis for the development of promising strategies for treatment of ischemic diseases.
Keywords: human pluripotent stem cells, hypoxia-induc-ible factors (HIFs), INT6, angiogenesis, CRISPR/Cas9, genome engineering.
Введение
В организме человека большинство клеток и тканей в норме функционируют при концентрации кислорода менее 10%, и для регуляции гомеостатического баланса кислорода в процессе эволюции сформировались специальные механизмы. Ключевыми регуляторами клеточного ответа на понижение физиологического содержания кислорода (гипоксию) являются транскрипционные факторы НРэ, индуцируемые гипоксией [1, 2]. НРэ регулируют адаптивный ответ на недостаток кислорода путем активации ряда генов-мишеней [3-5].
На сегодняшний день установлено, что И1Р играет важную роль в таких процессах, как обмен веществ, регулирование рН, доставка кислорода, метаболизм глюкозы,
функционирование митохондрий, пролиферация клеток, синтез внеклеточного матрикса, мобилизация клеток при воспалении [1, 6, 7], а также в поддержании плюрипо-тентности, самообновлении эмбриональных стволовых клеток, васкуло- и ангиогенезе.
Известно, что в области ишемических поражений в условиях недостатка кислорода, т. е. патологической гипоксии, повышается уровень белка И1Р, который, будучи транскрипционным фактором, связывается с регулятор-ными областями генов-мишеней и повышает их транскрипцию, что приводит к усилению продукции ангиогенных цитокинов и, как следствие, усилению ангиогенеза [8-12].
Результаты исследований клеточного ответа на гипоксию имеют важное биомедицинское значение:
в 2019 г. Уильяму Кэлину, Питеру Рэтклиффу и Греггу Семензе была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине «за открытие механизмов, посредством которых клетки воспринимают доступность кислорода и адаптируются к ней», в частности, за открытие и изучение транскрипционного фактора И!Р [13].
развитие онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний часто протекает в условиях гипоксии [3, 14], поэтому изучение структуры и механизмов сигнального пути И!Р имеет важное клиническое значение [15]. Было показано, что рост большинства типов опухолей сопровождается рядом процессов, таких как инвазия, метастазирование, ангиогенез, которые в основном регулируются генами-мишенями Н!Рэ [15]. С другой стороны, на модели ишемии задних конечностей у мышей было обнаружено, что индукция ангиогенеза за счет активации Н!Рэ является одной из возможных стратегий лечения ишемических заболеваний [6].
И!Р представляет собой гетеродимер, в состав которого входит одна из изоформ кислород-регулируемой субъединицы Н!Р-а (Н!Р-1а, Н!Р-2а или Н!Р-3а) и конститутивно экспрессирующаяся субъединица Н!Р-1 р [6]. При нормальной концентрации кислорода происходит гидроксилирование аминокислотных остатков пролина Н!Р-а в результате активности фермента пролилги-дроксилазы. Для работы этих ферментов необходимы кислород, ионы двухвалентного железа и 2-оксоглутарат в качестве кофактора процесса гидроксилирования [16]. Модифицированная субъединица Н!Р-а, взаимодействуя с белком Гиппеля-Линдау, подвергается убиквитинирова-нию и деградирует в протеасомах. В условиях гипоксии не происходит гидроксилирования и протеасомной деградации белка Н!Р-а, он перемещается в ядро, образует димер с субъединицей Н!Р-1 р, и этот комплекс взаимодействует со специфическими последовательностями ДНК, активируя транскрипцию определенных генов.
Для Н!Р-2а субъединицы известна кислород-независимая регуляция с помощью белка !г^6/е!Р3е [17]. Взаимодействие !г^6/е!Р3е и Н!Р-2а приводит к деградации Н!Р-2а, в то время как нарушение взаимодействия с !г^6/е!Р3е — к стабилизации белка Н!Р-2а и усилению экспрессии мРНК гена И!Г-2а. Было доказано, что сайлен-синг !г^6/е!Р3е замедляет деградацию Н!Р-2а и стабилизированный белок Н!Р-2а связывается с участком последовательности ДНК в промоторном регионе гена Ч!Г-2а, повышая уровень собственной экспрессии по принцину положительной обратной связи [18]. В ряде работ нокаут !г^6/е!Р3е рассматривают в качестве перспективного способа терапевтического ангиогенеза [19].
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека с повышенной экспрессией Ч!Г-2а в условиях атмосферного содержания кислорода (около 21%) могут стать удобной моделью для изучения сигнального пути Н!Р, а их эндотелиальные производные с предполагаемым повышенным ангиогенным потенциалом — основой для разработки перспективных подходов к реваскуляриза-ции ишемических поражений.
Целью данного исследования является получение эмбриональных стволовых клеток человека с повышенной экспрессией Ч!Г-2а при нормальной концентрации кислорода за счет сайленсинга ¡N16, регулятора И!Г-2а.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Модуляцию экспрессии Н!Р-2а в линиях ЭСК человека НиЕБ9 [20] и ЕБМ04 [21, 22] проводили методом
CRISPR/Cas9 для целевого выключения гена INT6, белковый продукт которого является ингибитором HIF-2a, что позволяет стабилизировать HIF-2a в условиях нормальной концентрации кислорода (21% O2). Эффект сайленсинга INT6 сравнивали с эффектом активации HIFs в условиях псевдогипоксии (обработка клеток известными веществами-миметиками гипоксии: хлоридом кобальта (CoCl2) и диметилоксалилглицином (DMOG), а также в условиях реальной гипоксии при культивировании в инкубаторе с пониженным содержанием кислорода (5%). Экспрессию генов INT6, HIF-2a и HIF-1a оценивали с помощью цифровой ПЦР в каплях.
Культивирование ЭСК человека
Клеточные линии ЭСК культивировали на подложке митотически инактивированных эмбриональных фибро-бластов мыши в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 атмосферной концентрации О2 (около 21 %) в среде Knockout DMEM (Thermo Fisher Scientific, США), содержащей 15% эмбриональной сыворотки телят (FBS, Thermo Fisher Scientific, США), 10 нг/мл ßFGF (Peprotech, США), 1 х раствор Glutamax (Thermo Fisher Scientific, США), 1 х раствор заменимых аминокислот (Lonza, Швеция), 0,1 мМ 2-мер-каптоэтанола (Merck, Германия) и 1 х раствор антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Lonza, Швеция). При достижении субконфлюэнтного монослоя (плотность монослоя 80-95%) клетки пассировали с использованием TrypLE™ Express (Thermo Fisher Scientific, США) и 10 мкМ Rock-ингибитора Y-2 7632 (StemRD, США).
Эксперименты по культивированию ЭСК в условиях пониженного содержания кислорода (5% О2) проводили в мультигазовом инкубаторе BINDER CB150 (BINDER, Германия) при 37°С, 5% СО2.
Культивирование ЭСК человека в условиях
псевдогипоксии (с использованием
веществ-миметиков гипоксии)
По литературным данным известно, что применение CoCl2 и DMOG способствует повышению экспрессии и стабилизации HIFs, имитируя гипоксическое состояние в клетке. CoCl2 хелатирует ионы Fe2+, которые являются кофактором, необходимым для работы пролил-гидроксилаз [23-27]. Нарушение гидроксилирования пролиновых остатков белка HIF-1a препятствует его деградации и приводит к стабилизации белка HIF-1a, как при гипоксии. Помимо стабилизации белка HIF-1a при обработке клеток CoCl2 достоверно повышается уровень экспрессии мРНК гена HIF-1a [25]. DMOG, действие которого направлено на ингибирование пролилгидроксилаз, стабилизацирует HIF-1a и HIF-2a [28, 29]. Таким образом, с помощью веществ-миме-тиков гипоксии можно смоделировать гипоксию при культивировании в условиях нормального содержания кислорода (около 21%).
Клеточные линии ЭСК обрабатывали веществами-миметиками гипоксии CoCl2 и DMOG в концентрациях 50 мкМ и 250 мкМ соответственно в течение трех последовательных пассажей.
Конструирование векторов и их доставка
Для экспрессии Cas9 и направляющих РНК использовали вектор pSpCas9(BB)-2A-GFP(pX458) (https:// www.addgene.org/48138/) по ранее описанному протоколу [30]. Выбор последовательностей направляющих РНК и оценку нецелевых (off-target) взаимодействий
Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов, необходимые для синтеза направляющих РНК системы СП!ЭРП/Са89
Направляющая РНК Последовательность (5'-3')
INT6 sgRNA № 1 5'-TCACTCGCGCCCTAACGCAA-3'
5'-TTGCGTTAGGGCGCGAGTGA-3'
INT6 sgRNA № 2 5'-GCATCGCGCACTTTTTGGAT-3'
5'-ATCCAAAAAGTGCGCGATGC-3'
Таблица 2. Последовательности праймеров и зондов для проведения цифровой ПЦР в каплях
Праймеры
Последовательность (5'-3')
TFRC_F TFRC_R TFRC_Probe
HIF-2a_F HIF-2a_R HIF-2a_Probe
HIF-1 a_F HIF-1 a_R HIF-1 a_Probe
INT6_F INT6_R INT6 Probe
5'-GTCGCTGGTCAGTTCGTGATT-3~ 5'-AGCAGTTGGCTGTTGTACCTCTC-3' HEX-CCCATGATGTTGAATTGAACCTGG-BHQ1
5'-TCATGCGACTGGCAATCAGC-3' 5'-GTCACCACGGCAATGAAACC-3' Probe: FAM-CTCTCCTCAGTTTGCTCTGAAA-BHQ1
5'-CCACAGGACAGTACAGGATG-3~ 5'-TCAAGTCGTGCTGAATAATACC-3' FAM-TGAGTTTCAACCCAGACATATCC-BH Q1
5'-GACACATTGTCTGAATTGCATTAAGAT-3~ 5'-CACTTCAGTCTCTTCAGCAGAGAAC-3' FAM-TGATTGAAGAAAACAAACAGAGACCAGTGAATGA-BH Q1
проводили при помощи MIT CRISPR Design Tool (http:// crispr.mit.edu). Последовательности олигонуклеотидов указаны в табл. 1. Синтезированные олигонуклеотиды клонировали в вектор по сайтам рестрикции BbsI. Последовательность направляющих РНК в составе векторных конструкций верифицировали реакцией секвенирования плазмидной ДНК в ЦКП «Геномика» СО РАН. Генетические конструкции доставляли в клетки методом нуклеофекции на приборе Neon® Transfection System (Invitrogen Life Technologies, США). Отбор GFP-позитивных клеток выполняли через 48 ч. после нукле-офекции на проточном цитофлуориметре S3 (Bio-Rad, США) согласно рекомендациям производителя.
Оценка пролиферации клеток
с помощью XTT-анализа
Клетки предварительно культивировали в 96-луноч-ном планшете в течение 24 ч. Пролиферацию ЭСК оценивали с использованием XTT-теста по протоколу фирмы-производителя (Roche, США) через 4 ч. после добавления реагентов на сканирующем спектрофотометре Perkin Elmer (2030 Multilabel Reader Victor X3, Финляндия) при длине волны 490 нм. Полученные значения коэффициента поглощения отражали количество жизнеспособных клеток в каждой лунке. Эксперимент проводили в двух технических и трех биологических повторностях.
Выделение РНК и ДНК из клеток, синтез кДНК
РНК и ДНК из клеток выделяли с помощью лизи-рующего реагента TRIzol Reagent® (Thermo Fisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали Random Hexamer Primer (500 мкг/мл, Promega, США) и M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen, США).
Оценка экспрессии генов HIF-1a, HIF-2a,
INT6 с помощью цифровой ПЦР в каплях
Цифровую ПЦР в каплях проводили на базе ЦКП клеточных технологий ФИЦ ИЦиГ СО РАН с применением стандартного протокола фирмы-производителя ddPCR™ Total Guide bulletin 6407, набора ddPCR™ Supermix for Probes (10026235) и оборудования: ddPCR™ Foil Heat Seal, DG8™ Cartridges for QX100™/QX200™ Droplet Generator (186-4008), Droplet Generator DG8™ Gasket (186-3009), ddPCR™ Plate Kit (10023379), QX100™ Droplet Generator, QX100™ Droplet Reader, PX1™ PCR Plate Sealer, амплификатора Т100™ Thermal Cycler (все материалы, реактивы и оборудование фирмы BIORAD, США). Последовательности праймеров и зондов указаны в табл. 2. Зонды подбирали с помощью онлайн программы PrimerQuest tool (eu.idtdna.com). Для нормирования использовали TFRC в качестве референсного гена, экспрессия которого стабильна в гипоксических и нормоксическихусловиях.
Иммунофлуоресцентый анализ
Плюрипотентность ЭСК оценивали с помощью имму-нофлуоресцентного окрашивания антителами на маркеры TRA1 -60, OCT 4, и SOX2 по ранее описанному протоколу [31]. Образцы анализировали на инвертированном флуоресцентном микроскопе Nikon Ti-E в программе NIS-AR (Nikon, Япония).
Электрофорез в полиакриламидном
геле и Вестерн блот-гибридизация
Для электрофореза в полиакриамидном геле использовали метод Лэммли с модификациями. После электрофореза белки переносили на мембрану и детектировали при помощи первичных антиген-специфичных (HIF-2A: ab199, Abcam; HIF-1A: 458400, Life Technologies; INT6:
36766, Abcam) и вторичных антител (132222, Jackson ImmunoResearch Laboratories, IN С, 132960 Jackson ImmunoResearc Laboratori, INC), конъюгированных с пероксидазой. Количественный анализ данных Ве стерн-блота проводили в программе ImageJ.
Статистический анализ
Для обработки результатов qRT-PCR использовали 2-AACT метод [32], для статистической оценки достоверности различий — однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), а также критерий Пирсона в программе Microsoft Excel 14.0.6023.1000. Обработку и анализ результатов цифровой ПЦР в каплях проводили в программе Quanta Soft™ Software Version 1.7.4.0917.
Результаты
Получение эмбриональных стволовых клеток человека с делецией участка INT6 c помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9
Для нокаута гена INT6 применили систему редактирования генома CRISPR/Cas9 с целью формирования делеции размером 220 п. н., включающей промоторную область и участок первого экзона с захватом точки начала транскрипции. Данный метод позволяет эффективно остановить транскрипцию гена. В результате сортинга GFP-позитивных клеток и последующего механического субклонирования было получено 43 субклона ЭСК линий HuES9 и ESM04. После первичного скрининга субклонов было выявлено 2 субклона H8 и Н9 линии HuES9 и 1 субклон Е12 линии ESM04 с делецией участка одного аллеля INT6 размером 218, 219 и 226 п. н. соответственно (рис. 1А, Б). По результатам секвенирования было обнаружено, что субклоны являются гетерозиготными по целевой делеции. Во втором аллеле гена IN T6 в субклонах также детектировали участки с делецией размером 7 п. н. (H9), 2 п. н. (Е12) и 8 п. н. (Н8) в промоторной обасти (рис. 1В).
Характеристика полученных линий эмбриональных стволовых клеток человека с делецией участка гена INT6
Полученные генетически модифицированные субклоны демонстрировали наличие характерных маркеров плюрипотентности (рис. 1Г), а также нормальный пролиферативный потенциал, достоверно не отличающийся от пролиферативного потенциала контрольных клеточных линий без делеции и клеточных линий, культивируемых в условиях гипоксии и в присутствии веществ-миметиков гипоксии (рис. 2А, табл. 3).
Оценка уровня экспрессии и количества белкового продукта гена INT6
Для оценки функциональной эффективности делеции гена INT6 на модуляцию экспрессии HIF-2a в полученных субклонах ЭСК и эффекта воздействия гипоксических и псевдогипоксических условий на экспрессию HIF-1a и HIF-2a использовали цифровую ПЦР в каплях. Было показано, что уровень экспрессии INT6 достоверно снижен в полученных субклонах с делецией данного гена по сравнению с контрольными образцами исходных линий (рис. 2Б).
При оценке содержания белкового продукта INT6 в исследуемых клеточных линиях с помощью Вестерн-блот анализа (рис. 2В) было обнаружено
снижение количества белкового продукта у субклонов Н9 и Е12 с делецией N6. Кроме того, у субклона Е12 наблюдали появление дополнительного бэнда, что может свидетельствовать о протеасомной деградации данного белка [34]. Было выявлено увеличение количества белкового продукта 11\1Т6 в ЭСК, культивируемых в условиях гипоксии, для линии ИиЕ89 и, напротив, снижение количества белка данного гена в клетках при обработке веществом-миметиком гипоксии ОМОЭ. Для линии ЕБМ04 было показано снижение количества белка 1\1Т6 в клетках, культивируемых в условиях гипоксии и в присутствии миметиков гипоксии (рис. 2В). результаты Вестерн-блот анализа согласуются с результатами, полученными с помощью цифровой ПЦР в каплях: делеция участка гена INT6 приводила к снижению количества белкового продукта данного гена в полученных субклонах.
Оценка уровня экспрессии генов И!Р-2а
и И!Р-1а в полученных генетически
модифицированных линиях ЭСК человека
Оценка уровня экспрессии генов HIF-2а и HIF-1а методом цифровой ПЦР в каплях показала, что в генетически модифицированных субклонах Н9 и Е12 с делецией участка гена INT6 детектируется достоверно повышенный по сравнению с исходными линиями уровень экспрессии НIF-2а (рис. 2Г). При культивировании ЭСК в присутствии вещества-миметика гипоксии ОМОЭ повышался уровень экспрессии как НIF-2а, так и HIF-1а; при культивирование в условиях гипоксического инкубатора с 5% кислорода, а также с добавлением вещества СоС12 повышался уровень экспрессии НIF-1а (рис. 2Г). Таким образом, впервые было доказано, что делеция гена INT6 в субклонах ЭСК достоверно способствует повышению уровня экспрессии НIF-2а.
Обсуждение
Развитие эмбрионов млекопитающих происходит в условиях пониженного по сравнению с атмосферным содержания кислорода — 1-5% [35]. Гипоксия играет существенную роль в поддержании плюрипотентности и самообновления ЭСК и индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток (ИПСК) человека [36, 37]. Культивирование плюрипотентных клеток при 5% О2 препятствует спонтанной дифференцировке, уменьшает частоту хромосомных аберраций, стабилизирует эпигенетическое состояние [38-41]. Гипоксия повышает эффективность направленной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в определенные типы клеток, позволяет поддерживать мультипотентность про-гениторных клеток [42-49], способствует репрограм-мированию соматических клеток к плюрипотентному состоянию [50].
Клетки, в которых активированы Н!Б-опосредованные сигнальные пути, помимо их способности поддержать плюрипотентность и эффективность дифференцировки, обладают повышенным регенеративным потенциалом, что очень важно для биомедицины, поэтому ведется разработка способов активировать Н!Б вне зависимости от процентного содержания кислорода в окружающей среде при культивировании.
В нашей работе впервые были получены генетически модифицированные ЭСК человека с повышенной экспрессией HIF-2а в условиях культивирования при нормальном содержании кислорода (около 21%) в результате делеции участка промотора и первого экзона одного аллеля гена INT6, белковый продукт которого является
Рис. 1. Получение ЭСК человека, нокаутных по гену N76: А — первичный скрининг полученных генетически модифицированных ЭСК человека, рамкой выделены продукты аллеля с делецией N76 в субклонах Н8, Н9, Е12, В2 (контрольный субклон ИПСК с делецией N76, ранее полученный в лаборатории [33]), контроль — НиЕБ9 без делеции; Б — секвенограмма участка с целевой делецией (А, п. н.) одного из аллелей N76 в субклонах Н9, Е12, Н8; В — секвенограмма участка с делецией (А, п. н.) второго аллеля N76 в субклонах Н9, Е12, Н8; Г — субклоны Н9 и Е12 генетически модифицированных ЭСК человека линий НиЕБ9 и ЕБМ04: иммуноцитохимическая реакция с антителами к маркерам плюрипотентности — ТЯД1-60 (зеленый), ОС Т 4, БОХ2 (красный). Ядра клеток докрашены ОДР! (синий сигнал). Масштабный отрезок — 100 мкм
Таблица 3. Достоверность различий пролиферативного потенциала в исследуемых линиях ЭСК человека
Линии ЭСК человека Р Линии ЭСК человека Р
HuES9 и HuES9 DMOG 0,729 ЕБМ04 и ЕБМ04 ОМОЭ 0,979
HuES9 и HuES9 LOW O2 0,790 ЕБМ04 и ЕБМ04 LOWOa 0,978
HuES9 и HuES9 CoCl2 0,797 ЕБМ04 и ЕБМ04 СоС12 0,912
HuES9 и H9 0,704 ЕБМ04 и Е12 0,322
А
5 -
18
4 а -& §
m %
5 §
¿1
>< ¡2
S -
I s -& §
m %
S §
I з
X
HuES9 HuES9 HuES9 HuES9
H9
ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12
ÇO
о a CD
ср
ср
>
1,1
0,s
0,4
0,2
ÇO
1,8
.
HuES9 HuES9 HuES9 HuES9
É
H9
1,4
О
a
CD р
р
>
1,2
0,8 0,6
I*
li
ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12
о CD * H
С 2
CD ±= СО
£
" 3
¥ o. s c
о
о m о CD * H
5 z
CD
1,6 1,4 1,2
£ £ ? S.
с о
0,8 0,6 0,4 0,2
HuES9 HuES9 HuES9 HuES9
H9
ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12
LOW O2 DMOG CoCL
LOW O2 DMOG CoCl2
Б
LOW O2 DMOG CoCl2
LOW O2 DMOG CoCl2
В
LOW O2 DMOG CoCl2
LOW O2 DMOG CoCl2
48 кДА 42 кДА
INT6 p-ACTIN
о a CD
m ll.
î 3:
р
>
0 a
CD ^
m ll.
1 *
CD m
о р
>
HuES9 HuES9 HuES9 HuES9 LOW O2 DMOG CoCl2
H9
ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12
10 9
5 7
6 5 4 3 2 1 0
HuES9 HuES9 HuES9 HuES9
i
H9
о a CD
m UL
* ь
н е
1 в о
р >
■ Ш тш Я
HuES9 HuES9 HuES9 HuES9 LOW O2 DMOG CoCl2 H9
0 a
CD ^
m ll.
1 1
CD m
о р
>
I ■
I
ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12
4,5 4 3,5 3 2,S 2 1,5 1 0,5 0
li-
I
ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12
LOW O2 DMOG CoCl2
Г
LOW O2 DMOG CoCl2
LOW O2 DMOG CoCl2
LOW O2 DMOG CoCl2
Рис. 2. Характеристика полученных генетически модифицированных ЭСК человека: А — оценка пролиферации линий ЭСК человека методом XTT-анализа: HuES9, ESM04 — исходные линии ЭСК; Н9 и Е12 — субклоны с делецией INT6; HuES9 DMOG, HuES9 CoCl2, ESM04 DMOG, ESM04 CoCl2—линии ЭСК, культивируемые в условиях псевдогипоксии; ESM04 Low O2, HuES9 Low O2 — линии ЭСК, культивируемые в условиях реальной гипоксии (5% O2); Б — анализ экспрессии гена INT6 c помощью цифровой ПЦР в каплях; В — уровень белкового продукта INT6 в исследуемых линиях ЭСК человека, р<0,05 (n=2, значения для независимых биологических повторов — среднее ± стандартное отклонение среднего), белки детектировали с помощью антител к INT6 и р-актину; Г — экспрессия генов HIF-2a, HIF-1 а, цифровая ПЦР в каплях, *р<0,05 по сравнению с исходными линиями ЭСК (n=3, значения для независимых биологических повторов, M±s)
ингибитором HIF-2a. Известно, что INT6 — это ключевой компонент фактора инициации трансляции эукариот 3 (EIF3e), который играет важную роль во многих клеточных процессах, включая формирование рибосомального комплекса, протеасомную деградацию белков и пролиферацию. Таким образом, биаллельное нарушение экспрессии данного гена может быть потенциальным препятствием для реализации этого подхода, направленного на повышение активности HIF-2a, в качестве терапевтического метода лечения ишемических заболеваний [51]. Отсутствие протяженной делеции во втором аллеле приводит к неполному нокауту мРНК и белка INT6, благодаря чему, возможно, полученные гетерозиготные клоны ЭСК демонстрируют нормальную жизнеспособность, про-лиферативную активность и сохраняют маркеры плюри-потентности. Тем не менее, разработка терапевтически применимых способов усиления ангиогенеза на основе данного подхода требует дополнительных исследований.
Нами был проведен сравнительный анализ эффекта действия делеции участка гена INT6 на HIF-2a с действием миметиков гипоксии CoCl2 и DMOG, а также с эффектом культивирования исходных ЭСК в условиях СО2-инкубатора при 5% кислорода. Уровень экспрессии HIF-2a в генетически модифицированных субклонах ЭСК H9 и E1 2 линий HuES9 и ESM04 соответственно с делецией участка INT6 был повышен, так же как при длительном культивировании ЭСК в условиях гипоксии [40, 52, 53]. При культивировании контрольных линий ЭСК (HuES9 и ESM04) в условиях гипоксического инкубатора при 5% О2, а также в случае обработки хлоридом кобальта был обнаружен эффект, характерный для
ЛИТЕРАТУРА:
1. Cassavaugh J., Lounsbury K.M. Hypoxia-mediated biological control. J. Cell. Biochem. 2011; 112(3): 735-44.
2. Semenza G.L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell 2012; 148(3): 399-408.
3. Semenza G.L. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 2003; 3(10): 721-32.
4. Semenza G.L. Oxygen Sensing, Hypoxia-Inducible Factors, and Disease Pathophysiology. Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2014; 9(1): 47-71.
5. Manalo D.J., Rowan A., Lavoie T. et al. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1. Blood 2005; 105(2): 659-69.
6. Hashimoto T., Shibasaki F. Hypoxia-inducible factor as an angiogenic master switch. Front. Pediatr. 2015; 3: 33.
7. Slemc L., Kunej T. Transcription factor HIF1A: downstream targets, associated pathways, polymorphic hypoxia response element (HRE) sites, and initiative for standardization of reporting in scientific literature. Tumour Biol. 2016; 37(11): 51-61.
8. Dong X., Sun B., Zhao X. et al. Expression of relative-protein of hypoxia-inducible factor-1a in vasculogenesis of mouse embryo. J. Biol. Res. 2014; 21(1): 4.
9. Greijer A.E., van der Groep P., Kemming D. et al. Up-regulation of gene expression by hypoxia is mediated predominantly by hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1). J. Pathol. 2005; 206(3): 291-304.
10. Zimna A., Kurpisz M. Hypoxia-Inducible Factor-1 in Physiological and Pathophysiological Angiogenesis: Applications and Therapies. Biomed. Res. Int. 2015; 2015: 549412.
11. Schellinge I.N., Cordasic N., Panesar J. et al. Hypoxia inducible factor stabilization improves defective ischemia-induced angiogenesis in a rodent model of chronic kidney disease. Kidney Int. 2017; 91(3): 616-27.
12. Tang N., Wang L., Esko J. et al. Loss of HIF-1alpha in endothelial cells disrupts a hypoxia-driven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis. Cancer Cell 2004; 6(5): 485-95.
13. Kaelin Jr.W.G., Ratcliffe Sir P.J., Semenza G.L. Press release: The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2019, https://www.nobelprize.org/ prizes/medicine/2019/press-release/.
14. Vink A., Schoneveld A.H., Lamers D. et al. HIF-1 alpha expression is associated with an atheromatous inflammatory plaque phenotype and upregulated in activated macrophages. Atherosclerosis 2007; 195(2): 69-75.
15. Talks K.L., Turley H., Gatter K.C. et al. The expression and distribution of the hypoxia-inducible factors HIF-1 alpha and HIF-2alpha in normal human tissues, cancers, and tumor-associated macrophages. Am. J. Pathol. 2000; 157(2): 411-21.
стадии адаптации к гипоксии — достоверное повышение экспрессии HIF-1 а, а не HIF-2а. Несмотря на то, что культивирование в экспериментальных условиях инкубатора с 5% О2 проводили на протяжении трех пассажей, по-видимому, этого было недостаточно для начала экспрессии HIF-2а. Действие СоС12 направлено именно на Н!Б-1а, тогда как обработка веществом-миметиком гипоксии ОМОЭ не только повышает экспрессию HIF-1а в обеих линиях ЭСК, но и приводит к повышению экспрессии HIF-2а. Это согласуется с данными о том, что ОМОЭ одновременно стабилизирует в клетках Н!Б-1а и Н!Б-2а [54].
Полученные нами генетически модифицированные ЭСК человека с повышенной экспрессией HIF-2а, с одной стороны, могут стать объектами для изучения механизмов связи гипоксии и плюрипотентности, с другой стороны, благодаря способности дифференцироваться в эндотелиальные производные с повышенным ангиогенным потенциалом, могут стать основой для разработки нового способа реваскуляризации при ише-мических поражениях.
Вклад авторов
Авторы Ж.К. Живень и И.С. Захарова внесли равный вклад в работу.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Бюджетного проекта ИЦиГСО РАН № 0324-2019-0042. В работе использовалось оборудование НМИЦ им. Е.Н. Мешалкина.
16. Duscher D., Januszyk M., Maan Z.N. et al. Comparison of the Hydroxylase Inhibitor Dimethyloxalylglycine and the Iron Chelator Deferoxamine in Diabetic and Aged Wound Healing. Plast. Reconstr. Surg. 2017; 139(3): 695-706.
17. Chen L., Uchida K., Endler A. Mammalian tumor suppressor Int6 specifically targets hypoxia inducible factor 2 alpha for degradation by hypoxia- and pVHL-independent regulation. J. Biol. Chem. 2007; 282(17): 12707-16.
18. Chen L., Uchida K., Endler A. et al. Mammalian tumor suppressor INT6 specifically targets hypoxia inducible factor 2 alpha for degradation by hypoxia-and pVHL-independent regulation. J. Biol. Chem. 2007; 282(17): 12707-16.
19. Hashimoto T., Chen L., Kimura H. et al. Silencing of eIF3e promotes blood perfusion recovery after limb ischemia through stabilization of hypoxia-inducible factor 2a activity. J. Vasc. Surg. 2016; 64(1): 219-26.
20. Cowan C.A., Klimanskaya I., McMahon J. et al. Derivation of Embryonic Stem-Cell Lines from Human Blastocysts. N. Engl. J. Med. 2004; 350(13): 1353-6.
21. Lagarkova M.A., Volchkov P.Y., Lyakisheva A.V. Diverse epigen-etic profile of novel human embryonic stem cell lines. Cell Cycle 2006; 5(4): 416-20.
22. Prokhorovich M.A., Lagar'kova M.A., Shilov A.G. Cultures of hESM human embryonic stem cells: Chromosomal aberrations and karyotype stability. Bull. Exp. Biol. Med. 2007; 144(1): 126-9.
23. Linden T., Katschinski D., Eckhardt M. The antimycotic ciclopirox olamine induces HIF-1 alpha stability, VEGF expression, and angiogenesis. FASEB J. 2003; 17(6): 761-3.
24. Yang L., Shen L., Li G. Silencing of hypoxia inducible factor-1 a gene attenuated angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm in apolipopro-tein E-deficient mice. Atherosclerosis 2016; 252: 40-9.
25. Chu C.Y., Jin Y.T., Zhang W. et al. CA IX is upregulated in CoCl2-induced hypoxia and associated with cell invasive potential and a poor prognosis of breast cancer. Int. J. Oncol. 2016; 48(1): 271-80.
26. Wang G.L., Semenza G.L. Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia. J. Biol. Chem. 1993; 268(29): 21513-8.
27. Gunshin H., Mackenzie B., Berger U.V. et al. Cloning and characterization of a mammalian proton-coupled metal-ion transporter. Nature 1997; 388(6641): 482-8.
28. Taniguchi C.M., Miao Y.R., Diep A.N. et al. PHD inhibition mitigates and protects against radiation-induced gastrointestinal toxicity via HIF2. Sci. Transl. Med. 2014; 6(236): 236-64.
29. Yuan Q., Bleiziffer O., Boos A.M. et al. PHDs inhibitor DMOG promotes the vascularization process in the AV loop by HIF-1a up-regulation and the preliminary discussion on its kinetics in rat. BMC Biotechnol. 2014; 14(1): 112.
30. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339(6121): 819-23.
31. Медведев С.П., Шевченко А.И., Сухих Г.Т. и соавт. Протокол иммунофлуоресцентного окрашивания. В: Власов В.В., редактор. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. 1-e издание. Новосибирск: Издательство СО РАН; 2011: 133-7. [Medvedev S.P., Shevchenko A.I., Sukhoi G.T. et al. Immunofluorescence staining protocol. In: Vlasov V.V., editor. Induced pluripotent stem cells. 1st ed. Novosibirsk: Publishing house of SB RAS; 2011: 133-7].
32. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ДДСТ method. Methods 2001; 25(4): 402-8.
33. Живень М.К., Захарова И.С., Смирнова А.М. и соавт. CRISPR/ Cas9-опосредованное получение генетически модифицированной линии плюрипотентных стволовых клеток человека, экспрессирующих HIF — фактор, индуцируемый гипоксией. В: Деев Р.В., Павлов И.П., ред. Материалы Международного конгресса CRISPR-2018; 2018 сент. 10-14; Новосибирск; Гены и Клетки 2018, приложение 2. стр. 30. [Zhiven M.K., Zakharova I.S., Smirnova A.M. et al. CRISPR/Cas9-mediated obtaining of genetically modified human pluripotent stem cells expressing HIF- hypoxia inducible factor. In: Deev R.V., Pavlov I.P., editors. Materials of the CRISPR-2018 International Congress; 2018 Sep 10-14; Novosibirsk; Genes & Cells 2018, appendix 2. p. 30].
34. Singh M., Chaudhry P., Parent S. et al. Ubiquitin-Proteasomal Degradation of COX-2 in TGF-p Stimulated Human Endometrial Cells Is Mediated Through Endoplasmic Reticulum Mannosidase I. Endocrinology 2012; 153(1): 426-37.
35. Dunwoodie S.L. The Role of Hypoxia in Development of the Mammalian Embryo. Developmental Cell 2009; 17(6): 755-73.
36. Jauniaux E., Watson A., Ozturk O. In-vivo measurement of intrauterine gases and acid-base values early in human pregnancy. Hum. Reprod. 1999; 14(11): 2901-4.
37. Rodesch F., Simon P., Donner C. Oxygen measurements in endo-metrial and trophoblastic tissues during early pregnancy. Obstet. Gynecol. 1992; 80(2): 283-5.
38. Ezashi T., Das P., Roberts R.M. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. PNAS USA 2005; 102(13): 4783-8.
39. Forsyth N.R., Musio A., Vezzoni P.W. Physiologic Oxygen Enhances Human Embryonic Stem Cell Clonal Recovery and Reduces Chromosomal Abnormalities. Cloning Stem Cells 2006; 8(1): 16-23.
40. Forristal C.E., Wright K.L., Hanley N.A. Hypoxia inducible factors regulate pluripotency and proliferation in human embryonic stem cells cultured at reduced oxygen tensions. Reproduction 2010; 139(1): 85-97.
41. Lengner C.J., Gimelbrant A.A., Erwin J.A. et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell 2010; 141(5): 872-83.
42. Mutoh T., Sanosaka T., Ito K. Oxygen levels epigenetically regulate fate switching of neural precursor cells via hypoxia-inducible factor 1 a-Notch signal interaction in the developing brain. Stem Cells 2012; 30(3): 561-9.
43. Studer L., Csete M., Lee S.H. et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J. Neurosci. 2000; 20(19): 7377-83.
44. Ross H.H., Sandhu M.S., Cheung T.F. et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp. Neurol. 2012; 235(1): 238-45.
45. Morrison S.J., Csete M., Groves A.K. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 2000; 20(19): 7370-6.
46. Behbahan I.S., Duan Y., Lam A. et al. New Approaches in the Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells toward Hepatocytes. Stem Cell Reviews and Reports 2011; 7(3): 748-59.
47. Si-Tayeb K., Noto F.K., Nagaoka M. et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatol-ogy 2010; 51(1): 297-305.
48. Bae D., Mondragon-Teran P., Hernandez D. et al. Hypoxia enhances the generation of retinal progenitor cells from human induced pluripotent and embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 2012; 21(8): 1344-55.
49. Salvagiotto G., Burton S., Daigh C.A. A defined, feeder-free, serumfree system to generate In Vitro hematopoietic progenitors and differentiated blood cells from hESCs and hiPSCs. PLoS One 2011; 6(3): e17829.
50. Yoshida Y., Takahashi K., Okita K. Hypoxia Enhances the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 2009; 5(3): 237-41.
51. Sesen J., Casaos J., Scotland S.J et al. The Bad, the Good and eIF3e/ INT6. Front. Biosci. 2017; 22: 1-20.
52. Petruzzelli R., Christensen D.R., Parry K.L. HIF-2a Regulates NANOG Expression in Human Embryonic Stem Cells following Hypoxia and Reoxygenation through the Interaction with an Oct-Sox Cis Regulatory Element. PLoS One 2014; 9(10): e108309.
53. Sugimoto K., Matsuura T., Nakazono A. Effects of hypoxia inducible factors on pluripotency in human iPS cells. Microsc. Res. Tech. 2018; 81(7): 749-54.
54. Zhdanov A.V., Okkelman I.A., Collins W.J. A novel effect of DMOG on cell metabolism: direct inhibition of mitochondrial function precedes HIF target gene expression. Biochim. Biophys. Acta 2015; 1847(10): 1254-66.
Поступила: 06.02.2020
