CC BY
72УДК 634.72
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ АВТОПОЛИПЛОИДОВ RIBES RUBRUM L.
И.Э. БУЧЕНКОВ1, А.Г. ЧЕРНЕЦКАЯ2
1 Международный экологический университет им. А.Д. Сахарова, г. Минск, Республика Беларусь, butchenkow@mail. ru 2Полесский государственный университет, г. Пинск, Республика Беларусь, chrysanthemum@list. ru
Введение. Большое значение для увеличения наследственной изменчивости при получении исходного селекционного материала имеет метод автополиплоидии, который вызывает глубокие и разносторонние изменения признаков и свойств растений. Практика доказывает, что хозяйственно полезные признаки, которые на диплоидном уровне проявились не достаточно, при переходе на новый уровень плоидности могут реализоваться в большей степени, изменяя норму реакции и обусловливая биологические преимущества.
Исследования по экспериментальной полиплоидии, выясняющие специфику автополиплоидов в сравнении с исходными диплоидами, создают основу для рационального использования генофонда растений в качестве исходного материала для селекции. В связи с этим, автополиплоидию следует рассматривать как один из важных приемов селекции, позволяющий получать новый исходный генофонд [7].
С середины прошлого века индуцированная автополиплоидия все интенсивнее внедряется в практику и является результативной у ряда сельскохозяйственных культур. В последнее время отчетливо осознается, что селекция на уровне диплоидов в пределах одного вида заходит в тупик. Трудно только лишь на диплоидном уровне создать что-либо новое, резко отличающееся от родительских форм. Перевод селекционного процесса на полиплоидный уровень открывает возможность получения новых и усиление желательных признаков [6].
Первые попытки экспериментального получения автополиплоидов в семействе Grossulariaceae Dumort. были проведены Е.В. Великановой (1937) в ЦГЛ им. И.В. Мичурина. В период с 40-х по 60-е гг. прошлого века колхицинированием индуцированы автотетраплоиды (2п(4х)=32) разных видов смородины и крыжовника.
В 70-80-е гг. прошлого века получен ряд автополиплоидов, которые успешно используются в селекционной работе и в настоящее время [1].
В последние годы, используя метод экспериментальной автополиплоидии, получены тетрапло-идные формы различных дикорастущих видов и культурных сортов смородины черной, смородины красной, смородины золотистой, крыжовника. Из созданного материала отобраны формы, устойчивые к грибным и вирусным заболеваниям, почковому клещу, с повышенной зимостойкостью. В процессе селекционной доработки выделены конкурентоспособные формы, сочетающие устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды с высокой продуктивностью и хорошим качеством плодов [2].
Исследования показывают, что, несмотря на пониженную плодовитость, автотетраплоиды легко поддаются селекционному улучшению. Четырехкратное увеличение одних и тех же хромосомных наборов резко ограничивает возможность морфологического и физиологического проявления ядерных изъянов, что позволяет получать высокопродуктивные формы [5].
Дальнейшее успешное развитие работ по автополиплоидии с культурой Ribes возможно только при совершенствовании методов экспериментального получения полиплоидных форм, среди которых наиболее важным является изучение эффективности действия различных полиплоидизиру-ющих факторов как отдельно, так и взятых совместно с ростовыми веществами типа стимуляторов роста.
Культура смородины удовлетворяет большинству требований, предъявляемым к растениям, колхицинирование которых наиболее перспективно: является истинным диплоидом (2n=16), эволюционирует только на диплоидном уровне, способна к вегетативному размножению. Последняя особенность позволяет закрепить все, вызванные полиплоидией, наследственные изменения.
Материалы и методы исследования. Исследования проводили с 1998 по 2009 гг. на агробиологической станции БГПУ им. М. Танка, а с 2009 по 2013 гг. на опытном поле ПолесГУ. Объекты исследования: сорта смородины красной - Красная Андрейченко, Ненаглядная, Голландская крас-
ная (агробиостанция БГПУ им. М. Танка); Ионкер ван Тетс, Прыгажуня, Натали (опытное поле ПолесГУ).
С целью получения автотетраплоидных форм смородины красной проводили обработку верхушечных почек в фазе начала распускания 0,1; 0,5; 1,0; 1,5% растворами колхицина в воде и глицерине при экспозициях 24, 36, 48 ч. В каждом варианте по каждому сорту обрабатывали по 40 - 60 почек. Использовали два способа нанесения растворов - наложение желатиновых капсул и на-капывание на верхушечную меристему. После обработки почки промывали 0,001% раствором ге-тероауксина, а после развития побегов их отчеренковывали и укореняли в условиях искусственного тумана.
В связи с тем, что большой ежегодный объем колхицинированного материала не позволял проводить цитологическую оценку всех опытных растений, в конце первого вегетационного периода отбор тетраплоидов осуществляли по морфологическим признакам. В группу «потенциальных тетраплоидов» отбирали растения с увеличенными размерами вегетативных органов и резко измененной по форме листовой пластинкой. Побеги без изменений и сильно угнетенные выбраковывали.
На следующий год вегетации «морфологических полиплоидов» проводили отбор автотетрап-лоидных форм по результатам цитологического анализа. Подсчет хромосом в клетках кончиков корешков осуществляли на окрашенных давленых препаратах [3].
Результаты исследований и их обсуждение. Всего в 48 вариантах опыта обработано 14510 почек. На основе морфологического анализа было отобрано 489 растений (3,37% от обработанных почек), а на основе цитологического анализа - 54 растения (0,37% от обработанных почек) (табл.1).
Таблица 1 - Оценка приемов полиплоидизации смородины красной
Отобрано
Полиплои-дизирующий Метод нанесения Концентрация раствора, % Экспозиция, Обработано почек, тетраплоидов на основе анализа, шт.
раствор час шт. морфологического цитологического
колхицин 24 298 - -
в воде 0,1 36 302 - -
48 300 11 -
24 301 11 -
накапывание на 0,2 36 299 12 -
верхушечную 48 300 14 1
меристему 24 306 15 1
1,0 36 308 29 6
48 303 17 2
24 301 14 1
1,5 36 305 12 -
48 307 11 -
24 302 - -
0,1 36 300 - -
48 301 11 -
24 306 12 1
наложение 0,5 36 305 17 2
желатиновых 48 303 11 1
капсул 24 300 14 2
1,0 36 301 25 10
48 300 16 1
24 306 11 -
1,5 36 302 13 1
48 301 11 -
24 304 — -
0,1 36 302 - -
48 300 11 -
24 300 - -
накапывание на 0,5 36 48 302 300 12 13 1 1
верхушечную меристему 1,0 24 36 302 300 14 22 2 7
48 301 13 1
колхицин в глицерине 1,5 24 36 48 308 297 301 12 1
24 301 - -
0,1 36 300 - -
48 305 11 -
0,5 24 303 - -
наложение 36 307 12 -
желатиновых 48 304 11 1
капсул 1,0 24 303 12 1
36 300 21 6
48 301 13 2
24 306 12 1
1,5 36 304 14 1
48 302 - -
Суммируя данные оценки приемов полиплоидизации по критерию выхода растений тетрапло-идного типа, к более эффективному следует отнести способ наложения желатиновых капсул с 1% водным раствором колхицина на верхушечные почки в фазе начала распускания при экспозиции 36 часов. При данных условиях получено 29 автотетраплоидных растений, что составляет 53,70% от всех полученных полиплоидов. Морфо-анатомический анализ отобранных форм показал, что автотетраплоиды имеют кусты гетерозисного типа, утолщенные побеги более темной окраски, крупные размеры и измененную форму листьев и цветков, малое количество семян в плодах. Единичное цветение полиплоидов наблюдали на второй год вегетации. В дальнейшем цветение было обильным. Сравнительное изучение характера цветения и плодоношения диплоидных и тетрапло-идных форм позволило установить, что у большинства тетраплоидных растений сроки указанных этапов наступают на 7-10 дней позже, чем у контрольных диплоидов. Цветки тетраплоидов несколько крупнее, но их меньше. Ягоды крупные, созревают позже, чем у соответствующих диплоидных сортов (рис.).
Рисунок - Автотетраплоид R. rubrum сорта Ненаглядная: а - плодоносящий побег; б - листья
Семян мало, среди них много недоразвитых. Всхожесть семян низкая.
В целом, автотетраплоиды R. rubrum - высокорослые растения с мощными побегами. Почки по размерам и окраске не отличаются от диплоидных, но имеют более отклоненное положение на побеге. Листья крупные, более темные, неправильной формы, центральная лопасть четко не выражена. Зубчики края листовой пластинки более округлые, менее заостренные. По диаметру и длине цветки крупнее диплоидных. Окраска цветков, форма и цвет плодов сходны с диплоидами. Масса ягод несколько выше диплоидных сортов. Семян мало (табл. 2).
Таблица 2 - Морфологическая характеристика диплоидных и автотетраплоидных форм смородины красной
Признак 2П = 16 2П = 32
Куст среднерослый высокорослый
Побег
окраска темно-буро-серая темно-буро-серая
ветвление обильное слабое
Почки
форма узко-заостренная узко-заостренная
окраска светло-коричневая светло-коричневая
положение отклонены отклонены
Лист
длина, см 11,30±0,11 18,10±0,17
ширина, см 10,00±0,32 17,80±0,11
цвет светло-зеленый темно-зеленый
край мелко-зубчатый крупно-зубчатый
форма 5-лопастная ассиметричная,
с налегающими лопастями
поверхность слабо-морщинистая пузырчатая
Черешок
длина, см 7,52±0,27 8,31±0,14
Цветок
длина, мм 3,51±0,20 4,27±0,25
диаметр, мм 5,20±0,34 5,96±0,19
Сроки цветения конец апреля-начало мая на 7-10 дней позже диплоидов
Ягода
масса, г 0,9 1, 1
окраска красная красная
форма округлая округлая
Семена
шт./ плод 28 9
Изучение анатомического строения листьев показало, что клетки верхнего и нижнего эпидермиса тетраплоидных форм больше, чем клетки диплоидов.
Для автотетраплоидов характерно увеличение длины замыкающих клеток устьиц, количества и размеров хлоропластов в них, уменьшение числа устьиц и ароматических железок на единицу площади эпидермиса, уменьшение слоев столбчатого мезофилла и диаметра проводящих пучков в сравнении с диплоидами (табл. 3).
Таблица 3 - Сравнительная характеристика эпидермальных структур листа у диплоидных и тетраплоидных форм смородины красной
Признак 2n= 1 6 4n = 3 2
Размеры клеток верхнего эпидермиса (увеличение 7x20)** 5,8±0,3* 11,2±0,8
Размеры клеток нижнего эпидермиса (7x20)** 3,9±0,7 6,5±0,9
Размеры замыкающих клеток устьиц (10x20)** 3,6±0,6 5,9±0,7
Размеры хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (15x90)** 23,8±1,3 27,6±1,4
Количество устьиц в поле зрения микроскопа (10х20), шт. 61,3±2,5 25,6±1,3
Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (10х60), шт. 11,9±0,9 20,6±1,1
* X ± xs,
** В делениях окуляр-микрометра
Для всех индуцированных нами автотетраплоидов характерна хорошая, но пониженная, в сравнении с диплоидами, плодовитость. Исследования показали, что при переводе диплоидных сортов на тетраплоидный уровень фертильность снижается в среднем в 2 раза. У диплоидных сортов R. rubrum фертильность пыльцы составляла 75-85%. Процентное содержание крупных, нормально сформированных и проросших пыльцевых зерен у автотетраплоидов изменялось в пределах 4048% в зависимости от сорта (табл. 4). Следовательно, пониженная плодовитость автотетраплоидов смородины красной по сравнению с диплоидными сортами связана с аномалиями развития пыльцы.
Таблица 4 - Жизнеспособность пыльцы сортов смородины красной разного уровня плоидности
Пыльцевых зерен по 5 полям зрения микро-
Сорт Плоидность скопа
Всего Проросших
просмотрено, шт. шт. %
Йонкер ван Тетс 2n 4n 142 118 112 54 78,87±1,25* 45,76±0,75
Прыгажуня 2n 4n 140 117 120 57 85,71±1,50 48,72±0,50
Натали 2n 141 115 81,56±0,75
4n 116 49 42,24±0,33
Красная Андрейченко 2n 4n 147 119 116 52 78,91±0,78 43,69±0,32
Ненаглядная 2n 4n 145 115 111 49 76,55±0,72 42,61±0,29
Голландская красная 2n 4n 144 116 108 47 75,00±0,69 40,52±0,19
* X ± xs
Выводы.
1. Оптимальным способом получения автотетраплоидов R. rubrum является обработка верхушечных почек в стадии начала распускания 1% водном раствором колхицина в течение 36 часов.
2. Взаимозависимость уровня плоидности и морфологии вегетативных органов, а также тенденция к увеличению размеров эпидермальных структур у автотетраплоидов позволяет проводить первичную их идентификацию в начальный период развития растений.
3. Индуцированные автотетраплоиды R. rubrum представляют новый исходный материал, который может быть использован в селекции для получения сортов с приподнятой формой куста и крупными, малосемянными плодами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бавтуто, Г.А. Обогащение генофонда и создание исходного материала плодово-ягодных культур на основе экспериментальной автополиплоидии и мутагенеза: автореф. дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.05. / Г.А. Бавтуто ; Тартуский гос. ун-т. - Тарту, 1980. - 49 с.
2. Бученков, И.Э. Создание исходного селекционного материала плодово-ягодных культур (смородина черная и красная, крыжовник, микровишня войлочная, черешня, айва обыкновенная) / И.Э. Бученков. -Минск: Право и экономика, 2013. - 201 с.
3. Рыбин, В.А. Цитологический метод в селекции плодовых / В.А. Рыбин. - М.: Колос, 1967. - 216 с.
4. Санкин, Л.С. Методика определения уровня плоидности / Л.С. Санкин, Т.П. Сорокина // Цитология и генетика культурных растений: сб. науч. тр. - Новосибирск, 1967. - С. 151-152.
5. Санкин Л.С. Экспериментальная полиплоидия в селекции смородины и крыжовника / Л.С. Санкин // Отдаленная гибридизация и полиплоидия в селекции плодовых и ягодных культур: тез. докл. на секции садоводства РАСХН. - Орел, 1993. - С. 47.
6. Трунин, Л.Л. Экспериментальные полиплоиды черной смородины, смородины дикуши и крыжовника / Л.Л. Трунин // Научные достижения в практику: сб. науч. тр. - Тамбов, 1972. - С. 64-68.
7. Чувашина, Н.П. Цитогенетика и селекция отдаленных гибридов и полиплоидов смородины / Н.П. Чу-вашина. - Л.: Наука, 1980. - 121 с.
PREPARATION AND ANALYSIS AUTOTETRAPLOIDS RIBES RUBRUM L. I.E. BUCHENKOV, A.G. CHERNECKAYA Summary
Obtained and studied Fund avtotetraploidov Ribes rubrum six varieties. The optimal way to obtain avtotetraploidov R. rubrum is the Treatment of the apical buds start blooming stage in a 1% aqueous solution of colchicine for 36 hours. Interdependence ploidy level and morphology of vegetative organs, as well as a tendency to increase the size of epidermal struc-tures in avtotetraploidov allows their identification in the primary period of plant development. Avtotetraploidy R. rubrum represent a new source, which can be used in breeding for varieties with elevated form of a bush and large fruits.
© Бученков И.Э., Чернецкая А.Г.
Поступила в редакцию 1 апреля 2014г.
