CC BY
72
INNOVATIVE TECHNOLOGIES
УДК 637.147.2
Получение ферментолизатов казеината натрия
для использования в специализированных пищевых
продуктах
С. Н. Зорин, канд. биол. наук; Ю. С. Сидорова, канд. биол. наук; И. С. Воробьева, канд. биол. наук; А. А. Кочеткова, д-р техн. наук, профессор;
В. К. Мазо, д-р биол. наук, профессор Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, г. Москва
Д. В. Абрамов, канд. биол. наук Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия, г. Углич, Ярославская обл.
Для получения ферментативных гидролизатов пищевого назначения широко используют цельный белок коровьего молока и его сывороточную и казеиновую фракции [1-5]. Применение мембранных технологий (ультрафильтрация и нанофильтра-ция) позволяет на основе ферментолизатов молочных белков получать пептидные смеси различного фракционного состава с высокой биологической ценностью. Они обладают сбалансированным аминокислотным скором и высокой усвояемостью, что дает возможность их эффективно использовать в составе продуктов, предназначенных для больных с нарушенной функцией пищеварения, для энтерального зондового питания, питания спортсменов, в том числе в составе гипоаллергенных продуктов и другой специализированной пищевой продукции [6, 7]. Еще одним направлением использования ферментативных гидролизатов может быть получение новых пищевых источников эссенциальных микроэлементов (ЭМ) в органически связанной форме. Наряду с биотехнологическими процессами культивирования биомассы простейших микроорганизмов в средах, обогащенных неорганическими соединениями микроэлементов (переходных металлов), ЭМ в органически связанной форме могут быть получены реакцией ком-плексирования с ферментативными гидролизатами различных пищевых белков [8, 9]. Перечень областей перспективного применения ферментолизатов белков для пищевых целей можно расширять, однако, к сожалению, в настоящее время их производство в нашей стране существенно ограничено.
Одним из коммерчески доступных субстратов для получения ферментативного гидролизата может быть ка-зеинат натрия, плохо растворимый в воде при комнатной температуре. Однако при относительно ограниченном ферментолизе этого белка с дальнейшей мембранной обработкой возможно получить пищевой источник пептидов, обладающий сбалансированным аминокислотным скором, удовлетворительными физико-химическими и органолеп-тическими свойствами.
Цель исследования - определение физико-химических характеристик ферментолизатов казеината натрия с низкой степенью гидролиза, полученных в лабораторных условиях.
Объектом исследования был выбран пищевой казеинат натрия (ООО «ТАГРИС МОЛОКО», Россия, ТУ 0229-077-00419785-97) с содержанием белка 85%. В качестве ферментного препарата использовали панкреатин из поджелудочной железы крупного рогатого скота (производства АВС Фармацойтичи С. п. А., Италия) с удельной протеолитической активностью 2,25 ph. Eur. u/mg (Европейская фармакопейная единица протеолитической активности).
В лабораторных условиях проводили ферментолиз казеината натрия панкреатином при массовым соотношении белок/ фермент 5000/1 (по сухому веществу). Водную взвесь казеината натрия концентрацией 5,0% инкубировали в водяной бане при температуре 49 °С в течение 120 мин до полного растворения субстрата. Используя 1,0 М раствор гидроокиси натрия, доводили значение рН раствора до 7,6, вносили фермент и вели гидролиз в течение
3 ч при температуре 49 °С и непрерывном перемешивании, поддерживая рН в диапазоне 7,3-7,5. Фермент инактивировали нагреванием смеси до температуры 80 °С в течение 20 мин, затем смесь охлаждали до температуры 25 °С и осветляли центрифугированием при 3000 мин -1 в течение 20 мин (центрифуга 6-JB, Beckman Coulter, Inc, Германия).
Для удаления горечи полученный раствор подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на установке «МИНИТАН» (Millipor, США) при использовании мембран с диаметром пор 10 кД. Отбирали высокомолекулярную и низкомолекулярную фракции и лиофильно высушивали.
Масштабирование процесса фер-ментолиза для получения опытной партии казеината натрия осуществляли в полупромышленных условиях на базе ФГБНУ маслоделия и сыроделия (г. Углич). Гидролиз проводили в ферментере объемом 300 л (производство ФГУП ЭМЗ, Россия), ультрафильтрацию - на установке с площадью фильтрации 1,5 м2 через мембрану 20,0 кД (изготовитель Pasilac, Дания). Высокомолекулярную фракцию ферментолиза-та пастеризовали при температуре 75 °С в течение 20 мин, затем высушивали на распылительной сушке (Niro Atomizer тип Minor, Дания, производительность 7,5 кг/ч) и использовали в дальнейшем в качестве пищевого ингредиента.
В полученных препаратах методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления (колонка «Супероза 12», 1,6-50 см) оценивали молекулярно-массовое распределение пептидных фракций
V 272 72,9 29,0 14,6 8,0 4,1 1,6 V
Ф. 133 lili пол.
Молекулярная масса, кД а
V 272 72,9 29,0 14,6 8,0 4,1 1,6 V
Ф. 133 lili ГШ
Молекулярная масса, кД б
V 272 72,9 29,0 14,6 8,0 4,1 ' 133
Молекулярная масса, в
кД
Рис. 1. Эксклюзионные хроматограммы лабораторных образцов ферментативного гидролизата казеината натрия и продуктов его мембранной обработки: а - лабораторный гидролизат казеината натрия; б - ультрафильтрат (высокомолекулярная фракция); в - ультрафильтрат (низкомолекулярная фракция)
V 272 72,9 29,0 14,6 8,0 4,1 1,6 V
Ф. 133 lili пл.
Молекулярная масса, кД г
V 272 72,9 29,0 14,6 8,0 4,1 1,6 V
Ф. 133 пол.
Молекулярная масса, кД
д
Рис. 2. Эксклюзионные хроматограммы гидролизата казеината натрия, полученного в полупромышленных условиях и его высокомолекулярной фракции, полученной при ультрафильтрации через мембрану 20,0 кД: г -полупромышленный гидролизат казеината натрия; д - его высокомолекулярная фракция
6 V
Таблица 1
Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе ферментативного гидролизата казеината натрия
№ фракции Диапазон молекулярных масс, кД Содержание фракции (по оптической плотности при 280 нм) %
Лабораторные образцы Полупромышленные образцы
а б в г д
1 >29,0 50,6 56,6 0,0 25,4 31,3
2 29,0-14,6 13,4 13,9 0,0 22,3 20,6
3 14,6-1,6 24,7 22,2 38,0 39,1 38,6
4 <1,6 11,3 7,3 62,0 13,2 9,5
[7]. В качестве элюента использовали 0,2 М NaCl с добавлением азида, скорость элюирования составляла 2,0 мл/мин. Для регистрации оптической плотности использовали проточный ультрафиолетовый детектор UV-1 (производство Pharmacia, Швеция) с длиной волны 280 нм. Колонку предварительно калибровали по стандартным водорастворимым глобулярным белкам производства SERVA, Германия.
Стандартные графики зависимости времен удержания от молекулярных масс стандартов строили по методу кубической регрессии (подбор коэффициентов полинома третьей степени с помощью метода наименьших квадратов) с использованием пакета программ Microsoft Excel 2007. Содержание пептидных фракций (в различных диапазонах молекулярных масс) в анализируемых препаратах оценивали интегрированием полученных хрома-
тограмм массовым методом в диапазоне от свободного до полного объема хроматографической колонки. Осмоляльность гидролизата и его фракций определяли криоско-пическим методом по ГОСТ Р 555782013 [10] на миллиосмометре -криоскопе термоэлектрическом «МТ-5-01» (изготовитель ОАО НПП «Буревестник», Россия).
Органолептические показатели полученных гидролизатов определяли по ГОСТ 31689-2012 «Казеинат. Технические условия».
Полученные гидролизаты были хорошо растворимы в воде при комнатной температуре, а после ультрафильтрационной обработки обладали удовлетворительными органо-лептическими свойствами при практически полном отсутствии горечи. Высокое весовое соотношение субстрат /фермент позволило использовать в процессе ферментолиза минимальное количество щелочи
для поддержания оптимальной рН (менее 0,25% от массы субстрата), что значительно упростило процесс проведения реакции.
На рис. 1 приведены эксклюзионные хроматограммы лабораторных образцов ферментолизата казеината, его высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций, полученных после ультрафильтрационной обработки с использованием мембраны 10 кД.
На рис. 2 приведены хроматограммы полупромышленного ферментолизата и высокомолекулярной фракции, полученной при ультрафильтрации через мембрану 20,0 кД.
В табл. 1 представлены результаты количественного определения молекулярно-массового распределения белково-пептидных фракций в составе полученных продуктов.
Лабораторные образцы ферментолизата казеината натрия и его высокомолекулярной фракции содержали значительные количества макромолекулярных агрегатов с массой выше 29 кД (50,6 и 56,6% соответственно), представленных, по-видимому, частично мицелляр-ной формой казеина и частично более легкими ассоциатами. Содержание пептидных фракций с молекулярными массами в интервале от 14,6 до 1,6 кД, образовавшихся в результате ограниченного протео-лиза казеината натрия, существенно не различалось для этих двух про-
INNOVATIVE TECHNOLOGIES
Таблица 2
Осмоляльность исходного казеината натрия и его гидролизатов
№ Наименование образца Осмоляльность, ммоль /кг воды
1 Казеинат натрия исходный 8
Лабораторные образцы гидролизатов казеината натрия
2 Гидролизат казеината натрия 15
3 Высокомолекулярная фракция гидролизата казеината натрия (после ультрафильтрации) 10
4* Низкомолекулярная фракция гидролизата казеината натрия (после ультрафильтрации) 154
Полупромышленные образцы гидролизатов казеината натрия
5 Гидролизат казеината натрия 15
6 Высокомолекулярная фракция гидролизата казеината натрия (после ультрафильтрации) 8
* Низкомолекулярная фракция обладала выраженной горечью
дуктов (24,7 и 22,2%). Содержание коротких пептидов и свободных аминокислот (фракции с молекулярными массами менее 1,6 кД) в высокомолекулярной фракции ферментолизата снизилось более чем в 1,5 раза. В низкомолекулярной фракции содержание коротких пептидов и свободных аминокислот составило 62%, что и определило ее выраженный горький вкус и высокую осмоляльность.
При масштабировании процесса протеолитического расщепления ка-зеината натрия и последующей мембранной ультрафильтрации в полупромышленных условиях были проанализированы полученные образцы ферментолизата и его высокомолекулярной фракции. Как следует из результатов количественной оценки молекулярно-массового распределения, содержание пептидных фракций с молекулярными массами в интервале от 14,6 до 1,6 кД, образовавшихся в результате ограниченного протеолиза казеината натрия, было в обоих продуктов практически одинаковым (39,1 и 38,6%) и почти в 2 раза выше значений, полученных для лабораторных образцов. В результате ультрафильтрации содержание коротких пептидов и свободных аминокислот в высокомолекулярной фракции снизилось в 1,6 раза, т. е. практически так же, как это имело место в лабораторных условиях.
В табл. 2 приведены результаты определения осмоляльности исходного казеината натрия и его гидро-лизатов, полученных в лаборатории и в полупромышленных масштабах, которые свидетельствуют, что лабораторные и полупромышленные об-
разцы ферментолизата и его высокомолекулярной фракции по осмоляльности практически не отличаются от нативного белка, хотя легко растворимы в воде при комнатной температуре. Как и следовало ожидать, высокая осмоляльность наблюдается в низкомолекулярной фракции после ультрафильтрационной обработки ферментолиза-та, полученного в лабораторных условиях.
В лабораторных условиях в результате трехчасового одностадийного ограниченного протеолиза казеината натрия панкреатином получен фер-ментолизат, при ультрафильтрации которого в свою очередь могут быть количественно выделены и охарактеризованы высокомолекулярный и низкомолекулярный пептидный продукты. Полупромышленное масштабирование процессов протеоли-за и ультрафильтрации позволило получить ферментолизат казеина-та натрия и его высокомолекулярную фракцию, хорошо растворимые в воде и с удовлетворительными органолептическими свойствами, что позволяет их использовать в составе специализированных пищевых продуктов различной целевой направленности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гмошинский, И. В. Использование ферментативных гидролизатов белка в специализированных гипоаллерген-ных продуктах: современное состояние вопроса/И. В. Гмошинский, С. Н. Зорин // Актуальные проблемы физиологии пищеварения и питания. Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 80-летию ака-
демика А. М. Уголева. - СПб. - 2006. -С. 27.
2. Гмошинский, И. В. Современные технологии в производстве специализированных гипоаллергенных продуктов питания/ И. В. Гмошинский [и др.] // Симпозиум «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса». - М., 2003. - С. 5-7.
3. Ладодо, К. С. Специализированные продукты питания для детей с различной патологией. Каталог К. С. Ладодо, Г. Ю. Сажинов. - М.: Минсельхозпрод РФ, 2000. - 200 с.
4. Osborn, D. A. Formulas containing hydrolysed protein for prevention of allergy and food intolerance in infants/D. A. Osborn, J. Sinn // Cochrane Database Syst. Rev. - 2006. - № 4. -цит. по CD 003664.
5. Pedrosa, M. Palatability of hydrolysates and other substitution formulas for cow's milk-allergic children: a comparative study of taste, smell, and texture evaluated by healthy volunteers / M. Pedrosa [at all] // J Investig. AUergoL Clin. Immunol. -2006. - V. 16. —№ 6. - P. 351-356.
6. Гмошинский, И. В. Мембранные технологии - инновационный метод повышения биологической ценности белка для питания детей раннего возраста/И. В. Гмошинский [и др.] // Вопросы современной педиатрии. - 2012. -Т. 2. - № 2. - С. 10-13.
7. Зорин, С. Н. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков с использованием некоторых коммерческих ферментных препаратов и различных схем проведения гидролиза / С. Н. Зорин, М. Баяржаргал // Биомедицинская химия. - 2009. -Т. 55. - Вып. 1. - С. 73-80.
8. Мазо, В. К. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов/ В. К. Мазо, И. В. Гмошинский, С. Н. Зорин // Семинар ученых России и стран АСЕАН «Применение современных биотехнологий в пищевой промышленности». - Ханой, 2010. - С. 110.
9. Mazo, V. K. New food sources of essential trace elements produced by biotechnology facilities/ // V. K. Mazo, I. V. Gmoshinskiy, S. N. Zorin. -Biotechnology Journal. - 2007. - V. 2. -issue 10. - P. 1297-1305.
10. ГОСТ Р 55578-2013. Продукты пищевые специализированные. Метод определения осмоляльности. - М.: Стандартинформ, 2014. - 8 с.
Получение ферментолизатов казеината натрия для использования в специализированных пищевых продуктах
Ключевые слова
казеинат натрия; мембранные технологии; ферментативный гидролиз; функциональный пищевой ингредиент
Реферат
К источникам белкового сырья животного происхождения высокой биологической ценности могут быть отнесены: цельный белок коровьего молока и его сывороточная и казеиновые фракции. В работе описан способ получения ферментолизатов казеината натрия с низкой степенью гидролиза в лабораторных и полупромышленных условиях с использованием панкреатина из поджелудочной железы крупного рогатого скота с последующей мембранной обработкой. Исследования проводились учеными Федерального исследовательского центра питания, биотехнологии и безопасности пищи на базе ВНИИ маслоделия и сыроделия. Высокое соотношение субстрат: фермент (5000:1 по сухим веществам) позволило в минимальном объеме использовать щелочь для поддержания оптимального значения рН в процессе реакции. В полученных препаратах методом экс-клюзионной жидкостной хроматографии высокого давления оценивали молекулярно-массовое распределение пептидных фракций. Криоскопическим методом определяли осмоляль-ность гидролизата и его фракций. Определяли органолепти-ческие показатели полученных гидролизатов и их фракций. Лабораторные образцы ферментолизата казеината натрия и его высокомолекулярной фракции содержали значительные количества макромолекулярных агрегатов с массой 29 кД - 50,6 и 56,6% соответственно. Содержание пептидных фракций с молекулярными массами в интервале от 14,6 до 1,6 кД составило 24,7 и 22,2 % соответственно. Содержание коротких пептидов и свободных аминокислот в высокомолекулярной фракции ферментолизата снизилось более чем в 1,5 раза. В низкомолекулярной фракции содержание коротких пептидов и свободных аминокислот составило 62%, что и определило ее выраженный горький вкус и высокую осмоляльность. При масштабировании процесса содержание пептидных фракций с молекулярными массами в интервале от 14,6 до 1,6 кД было практически одинаковым для ферментолизата и его высокомолекулярной фракции (39,1 и 38,6%), что превышает значения, полученные для лабораторных образцов. В результате ультрафильтрации содержание коротких пептидов и свободных аминокислот в высокомолекулярной фракции снизилось в 1,6 раза, так же как в лабораторных условиях. Полупромышленное масштабирование процессов протеолиза и ультрафильтрации позволило получить ферментолизат казеината натрия и его высокомолекулярную фракцию, хорошо растворимые в воде и с удовлетворительными органолептическими свойствами (практически полное отсутствие горечи), что позволяет использовать их в составе специализированных пищевых продуктов различной целевой направленности.
Авторы
Зорин Сергей Николаевич, канд. биол. наук, Сидорова Юлия Сергеевна, канд. биол. наук, Воробьева Ирина Сергеевна, канд. биол. наук, Кочеткова Алла Алексеевна, д-р техн. наук, профессор, Мазо Владимир Кимович, д-р биол. наук, профессор Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Устьинский проезд,
д. 2/14, [email protected], [email protected] Д. В. Абрамов, канд. биол. наук Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия, 152613, Ярославская обл., г. Углич, Красноармейский бульвар, д. 19, [email protected]
Preparation of Fermentative Sodium Caseinate for Use in Specialty Foods
Key words
sodium caseinate; membrane technology; enzymatic hydrolysis; a functional food ingredient
Abstracts
The prospect of a biotechnological approach based on the combined use of enzymatic hydrolysis processes and membrane technologies to produce a wide range of functional food ingredients and, in particular, enzymatic hydrolyzates of dietary proteins, is no doubt. The sources of raw materials of animal protein with high biological value for dietary enzymatic hydrolyzates are the whole bovine milk protein and its whey and casein fractions. The work describes a process for preparing enzymatic sodium caseinate with a low degree of hydrolysis in laboratory and pilot conditions using pancreatin from the cattle pancreas, with following membrane processing. Research carried out by scientists of the Federal Food Research Centre, Biotechnology and Food Safety on the basis of Institute of Butter and Cheese. The high ratio of substrate: enzyme (5000:1 on dry substance) allowed to use a minimal volume of alkali to maintain an optimal pH during the reaction. In obtained preparations the molecular weight distribution of peptide fractions was evaluated with exclusion HPLC. The osmolality of the hydrolyzate and its fractions was determined with the cryoscopic method. Organoleptic characteristics of derived hydrolyzates and its fractions were evaluated. Laboratory samples of sodium caseinate enzymatic hydrolyzate and its high molecular weight fraction contained significant amounts of macromolecular aggregates with weight above 29 kDa (50.6% and 56.6% respectively). The content of peptide fractions with molecular weights in the range from 14.6 to 1.6 kDa, was 24.7 % and 22.2% respectively. The content of short peptides and free amino acids (less than 1.6 kDa) in the high molecular weight fraction decreased by more than 1.5 times. The content of short peptides and free amino acids in low molecular weight fraction was 62%, which determined its distinct bitter taste and high osmolality. During scaling the process the content of peptide fractions with molecular weights in the range from 1.6 to 14.6 kDa was almost identical for enzymatic hydrolyzate and its high molecular weight fraction (39.1% and 38.6%), which is significantly higher than the values obtained in the laboratory samples. The content of short peptides and free amino acids after ultrafiltration in the high molecular weight fraction has decreased in 1.6 times, the same as it was in the laboratory conditions. Semi-industrial scale proteolysis and ultrafiltration allowed us to obtain enzymatic sodium caseinate hydrolyzate and its high molecular weight fraction, easily soluble in water and with satisfactory organoleptic properties (almost complete absence of bitterness), that allows to use them as a part of specialized food products of different target orientation.
Authors
Zorin Sergey Nikolaevich, Candidate of Biological Science, Sidorova Yuliya Sergeevna, Candidate of Biological Science, Vorobyova Irina SAergeevna, Candidate of Biological Science, Kochetkova Alla Alexeevna, Doctor of Technical Science, Professor, Mazo Vladimir Kimovich, Doctor of Technical Science, Professor Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 2/14, Ustyinsky Proezd, Moscow, 109240, [email protected], [email protected]
D.V. Abramov, Candidate of Biological Science All-Russian Scientific Research Institute of Butter and Cheese, 19, Krasnoarmeysky Bulvar, Uglich, Yaroslav Region, 152613, [email protected]
