CC BY
17
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Получение ферментативным путём радиоактивно меченого иммуностимулятора 1,3;1,6-в-0-глюкана (транслама) и изучение его фармакокинетики и фармакодинамики
Т. Н. ЗВЯГИНЦЕВА, С. П. ЕРМАКОВА, Н. Н. БЕСЕДНОВА*, Л. А. ЕЛЯКОВА
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток
*Научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток
Fermentative Production of 1,3;1,6-jft-D-Glucan (Translam), a Labeled Immunostimulant and Investigation of Its Pharmacokinetics and Pharmacodynamics
T. N. ZVYAGINTSEVA, S. P. ERMAKOVA, N. N. BESEDNOVA, L. A. ELYAKOVA
Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Department of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok
Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Vladivostok
С помощью1,3-в-П-глюканазы из морского моллюска ламинарана и 14С-глюкозы получен радиоактивно меченый транс-лам. Фармакокинетика обмена в организме крыс препарата транслам, меченного 14С, по таким параметрам, как уровень отложения его в органах и тканях, ретенция в них, скорость выведения с калом и мочой характерна для поведения в организме углеводов, в частности глюкозы, выведение транслама осуществляется преимущественно с мочой, что может свидетельствовать о неполном гидролизе препарата в организме после внутримышечного введения.
Ключевые слова: иммуностимулятор, транслам, радиоактивно меченый, фармакокинетика.
Production of labeled translam from a marine mollusk was provided by the use 1,3-yS-D-glucanase. The pharmacokinetics of the 14C-translam metabolism in the experimental rats by the accumulation level and the retention time in the organs and tissue and the excretion rate with the feces and urine was of the same character as that of carbohydrates and in particular that of glucose, whereas the excretion of translam mainly with the urine was likely evident of its incomplete hydrolysis after the intramuscular administration.
Key words: immunostimulant, labeled translam, pharmacokinetics.
Наземные организмы содержат комплексы
1.3-3-Б-глюканаз, состоящие из ферментов эн-до- и экзо-типа действия, которые катализируют разрыв молекул полисахарида соответственно изнутри или снаружи, и являются типичными гид-ролазами [1, 2].
Исследованные морские беспозвоночные и микроорганизмы содержат, высокоактивные эндо-
1.3-в-Б-глюканазы [3,4]. Эти ферменты, вначале обнаруженные как гидролазы [5, 6], обладают уникальной специфичностью [7—12]. 1,3-3-Б-Глюка-назы из морских источников практически одинаково катализируют реакции как гидролиза (перенос гликоновой части субстрата (8П_Х) на воду), так и трансгликозилирования (перенос 8П.Х на гидроксил содержащие вещества) (рис. 1). Продуктами реакции гидролиза являются глюкоза, ламинариолиго-сахариды и 1,3;1,6-в-Б-глюкоолигосахариды; продуктами реакции трансгликозилирования являются
© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: 690022 Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159. Тихоокеанский институт биоорганической химии
различные гликозиды. Эти ферменты были использованы для синтеза «-нитрофенилламинари- и 1,3;1,6-в-Б-глюкоолигозидов (донор — ламинаран, акцептор — пара-нитрофенил бета-Б-глюкопира-нозид (рМр-01с)), радиоактивно меченых ламина-ри- и 1,3;1,6-в-Б-глюкоолигосахаридов [12, 13].
Кроме того, в морском моллюске СЫатуз аЫйт обнаружена эндо-1,3-в-Б-глюканаза, обладающая глюканозил трансферазной или ветвя-щей активностью и способная трансформировать исходный 1,3;1,6-в-Б-глюкан-ламинаран в более разветвлённые и высокомолекулярные 1,3;1,6-$-Б -глюканы [11], подобно амилазе Б из клубней картофеля, которая трансформирует амилозу в амилопектин [14].
Фракции более разветвлённых и высокомолекулярных 1,3;1,6-/3-Б-глюканов, образующихся под действием этой 1,3-в-Б-глюканазы в результате глюканозил трансферазной реакции за счёт способности фермента катализировать расщепление в-1,3-гликозидной связи, и образование в процессе переноса гликоновой части субстрата
О
(Бп-Х) на молекулы ла-минарана (Бп) не только в-1,3-, но и ^-1,6-глю-козидных связей (рис. 1), названы Транслам и Антивир [7, 11, 15, 16].
Транслам в настоящее время разрабатывается нами как иммуностимулятор и радиопротектор [11, 15], Антивир — как фитоиммуностимулятор [16].
Цель настоящей работы — получение радиоактивно меченого транслама с помощью
1,3-в-Б-глюканазы из морского моллюска и исследование его фармакокинетики и фармакодинамики.
Рис. 1. Гипотетическая схема получения 14С-меченного транслама глюканозил трансферазной реакцией, катализируемой 1,3-)3^-глюканазой Л0 из Chlamys albidus (E).
I - Реакции, катализируемые Л0. Донор гликозильных остатков - ламинаран (Sn); акцептор - 14С-глюкоза (14C-GIc).
II - Получение меченого транслама (Sn-x-Sn-y-14C-GIc). Донор гликозильных остатков -продукт глюканозил трансферазной реакции (Sn-x-Sn); акцептор - 14С-глюкоза (14C-GIc).
Материал и методы
В работе использовали: коммерческий препарат глюкозы 14С-01с (20 МБк) с удельной радиоактивностью 10,7 ГБк/л; ламинаран из Ьаттапа аскопо(ёе8 получали по методу [17]; 1,3-8-Б-глюканазы Ь0 и Ьху получали из морских моллюсков по методу [6], в качестве носителей использовали Полихром-1 и сефадекс 0-50.
Количество общих сахаров в растворах определяли фенол сернокислотным методом [18], восстанавливающих сахаров — методом Нельсона [19].
Для получения меченного 14С транслама смесь из ламина-рана (2 г, 10 мг/мл), фермента (5х10-2 ед/мл; 1 ед соответствует количеству фермента, под действием которого образуется 1 мкмоль глюкозы в мин), и 14С глюкозы (0,75 мл) инкубировали в течение 5 ч в условиях образования транслама [11]. Глубину гидролиза ламинарана определяли по накоплению восстанавливающих сахаров [19]. Инкубационную смесь наносили на колонку с Полихромом-1 (4х40 см). Элюцию проводили последовательно водой (для удаления низкомолекулярных продуктов и 01с), 7,5% водным этанолом (для удаления непрореагировавшего ламинарана). Транслам элюировали 15% водным этанолом. Для определения молекулярной массы транслам хроматографировали на сефадексе 0-50 (1х 100 см). Выход сахаров в процессе элюции с Полихрома-1 или 0-50 регистрировали фенол сернокислым методом [18]. Выход меченого транслама (200 мг) составил 10% от исходного ламинарана. Включение метки в транслам составило 10% от 14С-01с. Бумажную хроматографию проводили на хроматографической бумаге КМ-18 («КИгак») в системе растворителей я-бутанол— пиридин—вода (6:4:3). Радиоактивность вырезанных бумажных полос (1.1 см) измеряли в толуольном сцинцилляторе на
счётчике «ЯаскЪйа» (ЬКВ, Швеция). Работа проводилась под тягой в соответствии с правилами ТБ при работе с изотопами.
Радиоактивно меченый транслам растворяли в горячей дистиллированной воде, свежеприготовленный раствор вводили крысам (использовали белых нелинейных крыс обоего пола массой 150—160 г) однократно, внутримышечно в объёме 0,2 мл в мышцу бедра в дозе 10 мг на крысу. Удельная радиоактивность препарата — 17 кБк/мл. Через 1, 6, 24 ч и на 2, 3, 4, 8, 16-е сутки после введения 14С-транслама животных под лёгким эфирным наркозом забивали и определяли содержа-
ние в органах и тканях радиоактивной метки. На каждый срок наблюдения забивали 5—6 крыс. Кроме того, 5 крыс сразу после введения 14С-транслама помещали в специальные обменные клетки, где собирали кал и мочу. Проводили радиометрическое определение содержания метки в следующих органах и тканях крыс: в крови, печени, почках, селезёнке, лёгких, трахее, костях скелета, скелетной мышце, сердечной мышце, мышце в месте введения, коже, щитовидной железе, тимусе, слюнных железах, надпочечниках, яичках, яичниках, гипофизе, головном мозге, желудке, тонкой и толстой кишке. Измерение радиоактивности органов и тканей крыс проводили методом счёта сцинцилляций с использованием радиометров ^-излучения [20, 21]. При измерении радиоактивности в-из-лучения толстослойным методом пробы органов животных высушивали, измельчали, перемешивали для гомогенизации и из полученного порошка прессовали таблетки определённого диаметра. Данная методика приготовления образцов для измерения широко используется в ГНЦ РФ — Институте биофизики и хорошо освоена [22]. Радиоактивность микротаблеток из биосубстратов измеряли на автоматических в-радио-метрах Р8С 1/В и Р8С 1/С фирмы «Интерпрайз».
Результаты и обсуждение
Ранее было показано, что ферменты из морских моллюсков, вначале обнаруженные как гид-ролазы [5, 6], практически с одинаковой интенсивностью катализируют одновременное протекание реакций гидролиза и трансгликозилирования в присутствии различных акцепторов [7]. Под действием фермента данной группы эндо-1,3--б-Б-глю-каназы из Chlаmys аШйт в продуктах ферментативной трансформации ламинаранов, при отсутствии искусственно введённых акцепторов, были обнаружены продукты глюканозил транферазной реакции — 1,3;1,6--в-Б-глюканы, более высокомолекулярные и разветвлённые, чем исходный ламинаран [7, 11]. Наибольший выход — 10—20% такой фракции глюканов, названной трансламом, был достиг-
-О-
Рис. 2. Максимальная концентрация в органах мышей 14С в разные сроки после введения им 14С-транслама.
По оси абсцисс - % от введённого количества на 1 г сырой ткани: по оси ординат - органы.
нут при глубине гидролиза связей в исходном субстрате 10—15%. Следовательно, данный фермент на начальный стадиях катализирует примерно с одинаковой интенсивностью реакции гидролиза и глюканозил трансферазную реакцию.
Была исследована возможность получения радиоактивно меченого транслама в результате катализа ферментом из С.аЫйт одновременно трёх реакций: гидролиза, трансгликозилирования (перенос 8П_Х на 14С-01с) и глюканозил трансферазной (перенос 8П-Х на молекулы полисахаридов) (рис. 1).
Синтез радиоактивно меченого транслама проводили в присутствии 14С-ОІс в условиях образования из ламинарана под действием 1,Э-уЗ-В-глюкана-зы из морского моллюска более разветвлённых и высокомолекулярных 1,Э;1,6-уЗ-В-глюканов: при высокой концентрации ламинарана (10 мг/мл) и глубине реакции гидролиза ламинарана не более 10—15%. Фракция разветвлённых и высокомолекулярных 1,Э;1,6-уЗ-В-глюканов (200 мг), содержащая метку (около 10 кБк/мг) и имеющая структурные характеристики, аналогичные для транслама (1,3 : 1,6 = 75 : 25, М.м. около 8—10 кДа), быша получена после разделения продуктов реакции на Полихроме-1. Выгход меченого транслама составил около 10% от исходного ламинарана, что сопоставимо с ранее опубликованными данными [11], включение метки в транслам составило около 10% от исходного её количества. В процессе трансформации ламинарана быши также получены радиоактивно меченые лами-нари- и 1,3;1,6-в-В-глюкоолигосахариды. Как бышо
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
показано методом бумажной хроматографии в низкомолекулярные продукты ферментоли-за ламинарана (за исключением транслама) включилось около 15% 14С-01с. Общее количество включённой в продукты ферментативной реакции 14С-01с составило около 25%, что совпадает с ранее опубликованными данными [12] по трансгликозилирова-нию с использованием 14С-ОІс в качестве акцептора. Таким образом, присутствие 14С-01с практически не влияет на протекание глюканозил трансферазной реакции, продуктом которой является транслам.
В ранее опубликованных работах для эн-до-1,3-ув-В-глюканазы из морского моллюска была исследована кинетика или только реакции гидролиза [5, 6], или одновременного протекания реакций гидролиза и трансгликозилирования [7, 8] или гидролиза и глюканозил трансферазной [11]. В данном исследовании впервые регистрировали одновременно накопление продуктов всех трёх реакций, которые катализирует эндо-1,3-ув-В-глюканаза из морского моллюска С.аШйт. Как следует из полученных данных, все три реакции протекают одинаково эффективно. В точке максимального накопления меченого транслама (около 10%), глубина реакции гидролиза была 10%, а количество продуктов трансгликозилирования, оцененное по включению 4С-01с в низкомолекулярные продукты, составило примерно 15%. Таким образом, присутствие 14С-01с практически не влияет на протекание реакций гидролиза и глюканозил трансферазной, продуктом которой является транслам.
На диаграмме (рис. 2) представлена максимальная концентрация 14С-транслама в различ-ныгх органах (в % от введенного количества на 1 г сырой ткани) в разные сроки после введения его крысам.
Эффективный период полувыведения препарата транслам, меченного 14С, из организма крыс составил 2,4 сут при однократном внутримышечном введении и был сопоставим с эффективными периодами полувыгаедения для органических соединений, меченных 14С.
Заключение
Таким образом, фармакокинетика обмена в организме крыс полисахарида — препарата транс-лам, меченного 14С, по таким параметрам, как уровень отложения его в органах и тканях, ретенция в них, скорость выведения с калом и мочой харак-
ЛИТЕРАТУРА
1. Широкова Н. И., Елякова Л. А. Экзо-бета-1,3-глюканаза из улитки Eulota maakii. Биоорган химия 1977; 3: 1656—1662.
2. Larriba G, Andaluz E., Cueva R. Basco R. D. Molecular biology of yeast exoglucanases. FEMS Microbiol Lett 1995; 125: 121—126.
3. Pesentseva M. S., Kusaykin M. I., Anastyuk S. D. et al. Catalytic properties and mode of action of endo-(1,3)-beta-D-glucanase and beta-D-glucosidase from the marine mollusk Littorina kurila. Carbohydr Res 2008; 343: 2393—2400.
4. Сова В. В., Широкова Н. И., Кусайкин М. И. и др. Beta-1,3-Глюка-наза из неоплодотворённых яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Сравнение с beta-1,3-глюканазами морского и наземного моллюсков. Биохимия 2003; 68: 650-655.
5. Sova V. V., Elyakova L. A. Some aspects of the specificity and action pattern of /3-1,3-glucan glucanohydrolase from Spisula sachalinensis. Biochim Biophys Acta 1972; 258: 219—227.
6. Privalova N. M, Elyakova L. A. (1978) Purification and some properties of endo-beta-1,3-glucanase from marine bivalve Chlamys albidus. Comp Biochem Physiol, 60B: 225—228.
7. Звягинцева T. H, Елякова Л. А. Механизм действия и специфичность 1,3-бета-глюканаз морских моллюсков. Биоорган химия 1994; 10: 453—474.
8. Звягинцева Т. Н, Назарова Н. И., Елякова, Л. А. Исследование трансгликозилирующей способности эндо-бета-1,3-глюканаз. II. Кинетические особенности реакций гидролиза и трансгликози-лирования, катализируемых эндо-бета-1,3-глюканазами из морских моллюсков. Биоорган химия 1984; 10: 1342—1346.
9. Сова В. В., Звягинцева Т. Н., Светашева Т. Г. и др. Сравнительное изучение особенностей реакций гидролиза и трансгликозилиро-вания, катализируемых бета-1,3-глюканазами из различных источников. Биохимия 1997; 62: 1300—1307.
10. Безукладников П. В., Елякова Л. А., Звягинцева Т. Н., Миргородская О. Л. Изучение реакций, катализируемых карбогидразами, с помощью масс-спектрометрии ЭРИАД. Химия природ соедин 1989; 1: 54—59.
11. Звягинцева Т. Н., Елякова Л. А., Исаков В. В. Ферментативное превращение ламинаранов в 1-3;1-6-бета^-глюканы, обладающие
терна для поведения в организме углеводов, в частности глюкозы, но в отличие от последних, выведение осуществляется преимущественно с мочой, а не с выдыхаемым 14С02, что может свидетельствовать о неполном гидролизе препарата в организме после внутримышечного введения.
иммуностимулирующим действием. Биоорган химия 1995; 21:
218—225.
12. Bezukladnikov P. V., Elyakova L. A. Transglycosylation and multiple attack of endo-(1^3)-/3-D-glucanase L-IV from Spisula sachalinensis: a new approach to the evaluation of the degree of multiple attack on polysaccharides. Carbohydr Res 1990; 203: 119—127.
13. Звягинцева Т. H., Макарьева Т. H., Ермакова С. П., Елякова Л. А. Препаративное получение n-нитрофенилламинариолигозидов реакцией трансгликозилирования, катализируемой эндо-бета-1,3-глюканазой из морского моллюска. Биоорган химия 1998; 24:
219—223.
14. Thoma J., Spradlin J., Dygert S. Plant and Animal Amylases / The Enzymes, 3rd Ed. 1971; 5: 115.
15. Кузнецова Т. Е., Крылова H. В., Звягинцева Т. H. и др. Влияние транслама на некоторые показатели естественной резистентности облучённого организма. Докл РАН, 1994; 2: 236—238.
16. Елякова Л. А., Лапшина Л. А., Реунов А. В., Можаева К. А. Защитное действие бета-1,6;1,3-глюкана «антивир», полученного ферментативной трансформацией ламинарана, на растених табака против вируса табачной мозаики. Докл РАН, 1994; 336: 710—711.
17. Звягинцева Т. Н., Широкова Н. И., Елякова Л. А. Структура ламинаранов их некоторых видов бурых водорослей. Биоорган химия 1994; 20: 1349—1358.
18. DuBois M., Gilles K., Hamilton J. et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 1956; 28: 350—356.
19. Nelson T. E. A photometric adaptation of the Somogy method for determination of glucose. J. Biol. Chem 1944; 153: 375—381.
20. (1962) Техника измерений радиоактивных препаратов. М.: Госа-томиздат, 83.
21. Левочкин Ф. К. Метод измерений удельной активности толстослойных источников бета-излучения. Дозиметрические и радиометрические методики. М.: 1966; 381.
22. Денисов И. И., Соколова Г. И., Сафрошин Г. И. др. Определение бета-активности проб из биосубстратов методом градуировочных кривых. М.: 1967; 31.
-е-
