Получение человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с молоком трансгенных кроликов Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

БИОТЕРАПИЯ

СЫВОРОТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ РАСТВОРИМЫХ ФОРМ МЕМБРАННЫХ АНТИГЕНОВ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ МЕЛАНОМЕ

В.В. Новиков13, О.С. Бурова2, В.В. Королева3, М.А. Крыжанова3, Л.В. Демидов2, И.Н. Михайлова2, А.Ю. Барышников2 Нижегородский государственный университет им. НИ. Лобачевского 2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 3Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной

Растворимые формы мембранных антигенов гемо-поэтических клеток выполняют регуляторные функции, чаще всего ограничивая иммунный ответ на чужеродные антигены. Обнаружено, что сывороточный уровень растворимых форм мембранных антигенов имеет прогностическое значение в мониторинге ряда онкозаболеваний.

Задача исследования. Изучение сывороточного уровня растворимых форм С095-антигена, опосредующего апоптоз, ¿050 (1САМ-3) антигена, являющегося молекулой адгезии, активационного антигена СБ38 и растворимой формы антигенов гистосовместимости I класса.

Материалы и методы. Образцы сыворотки крови больных меланомой, а также донорской крови. Содержание растворимых форм мембранных антигенов определяли иммуноферментным методом с помощью моноклональных антител серии ИКО. Сывороточную концентрацию растворимых антигенов выражали в условных единицах (и/т1).

Результаты. Сывороточное содержание растворимых антигенов С038 и СВ50 не отличалось от нормы, составляя 198,4+34,1 11/т1 и 198,4+58,2 и/т1 соответственно. В то же время уровень растворимого антигена С095 был повышен в сравнении с нормой в 1,7 раза и стал равен 635,8+97,1 и/т1 против 374,3+23,8 и/т1 у здоровых доноров (Р<0,05). Еще более значительное повышение было зарегистрировано для растворимых антигенов гистосовместимости I класса. Если в норме их содержание равнялось 1012,1+63,9 и/т1, то у больных меланомой уровень антигенов гистосовместимости I класса увеличивался в 5,1 раза и составлял 5158,0+621,7 и/т1 (Р<0,05).

Вывод. При меланоме наблюдается статистически достоверное повышение сывороточной концентрации растворимых антигенов гистосовместимости I класса и растворимого С095-антигена, свидетельствующее о возможности использовать данные показатели в иммунологическом мониторинге меланомы.

ПОЛУЧЕНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА С МОЛОКОМ ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ

М. И. Прокофьев Научно-технический центр «Новэнерго», Москва

Человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (чГКСФ) - гематопоэтический фактор роста, который стимулирует пролифирацию и дифференциацию предшественников клеток нейт-рофилов, повышает некоторые функциональные свойства зрелых нейтрофилов. Доказана эффективность использования чГКСФ как гематопоэтического фактора роста против различных форм лейкопении, а также лейкопении, вызванной химио- и радиотерапией при лечении онкологических заболеваний и в мобилизации предшественников клеток при трансплантации костного мозга, заболеваниях миелодисплазией, острой лейкемией и ВИЧ инфекцией.

Для клинического применения в настоящее время используются 2 формы рекомбинантного чГКСФ. Одну - гликолизированную форму «Граноцит» фирмы Rone-Poiilence - получают из дрожжевых клеток, другую - негликолизированную форму «Нейпоген» фирмы Roche - из бактериальных клеток E. coli.

Новое, наиболее прогрессивное направление -создание трансгенных животных, продуцирующих с молоком высокий уровень рекомбинантных белков. Этот метод получения рекомбинантных белков открывает безопаснйш, особенно по сравнению с донорской кровью, и хорошо возобновляемый источник производства лекарственных белков путем простого уве-

№2/томЗ/2004 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

8

БИОТЕРАПИЯ

личения стада животных. Суть метода состоит в том, что ген человека, регулирующий производство специфического лекарственного белка, вводят в зародыш животного. Полученое потомство приобретает способность вырабатывать лекарственный белок и под контролем промоторов молочной железы секре-тировать его в молоко.

Использование трансгенных сельскохозяйственных животных в качестве живых биореакторов имеет целый ряд преимуществ по сравнению с известными технологиями производства рекомбинантных белков. Получение рекомбинантных лекарственных белков с использованием модифицированных микроорганизмов не обеспечивает пострансляционных модификаций -таких, какгликолизирование, силиконирование, фол-динг, что приводит к снижению стабильности и функциональной активности получаемого белка. Все эти дострансляционные модификации в полной мере осуществляется в рекомбинантных белках, получаемых с молоком трансгенных животных. Несмотря на то, что в культуре клеток млекопитающих происходят необходимые посттрансляционные процессы, концентрация рекомбинантного белка очень низка, а процесс культивирования требует дорогостоящего оборудования и культуральных сред, в отличие от использования трансгенных животных.

Эффективность экспрессии, например, моноклональных гуманизированных антител, в молоке трансгенных животных в 3000 раз выше, чем в микроорганизмах, и в 160 ООО раз эффективнее, чем в системе культуры клеток (D.P.Pollon et.al.,1998). Стоимость производства 1 г моноклональных антител с использованием системы культуры клеток составляет 300-1000 долларов США в зависимости от выхода белка и мощности биореактора, а затраты на его производство с молоком коз - 40 долларов (Fulton S.P., 1999). По данным F.O. Custro (2000), затраты на производство 1 г неочищенных гуманизированных моноклональных антител в культуре клеток составляет 5-12 тыс. долларов США, а с молоком трансгенных кроликов -15 долларов.

В настоящее время получено более 60 фармацевтических рекомбинантных белков с молоком почти всех видов трансгенных животных. Некоторые из них находятся уже на III фазе клинических испытаний.

Однако почти отсутствуют сообщения о производстве гематопоэтических факторов роста, таких, как ГКСФ, эритролоэтин и тому подобных, - с использованием трансгенных сельскохозяйственных животных. Имеется одно сообщение корейских ученых (Junt Но Ко et. al., 2000) о получении 2 трансгенных коз с геном чГКСФ. Однако сперма от трансгенного самца оказалась нетрансгенной, следовательно, он был мо-

заиком, не трансгенным по половой линии, и не мог дать трансгенного потомства. Несмотря на то, что самка была плодотворно осеменена и выделяла чГКСФ с молоком, она также не дала трансгенного потомства.

Другой группе исследователей (A. Aguirre et al., 1998) не удалось добиться реальных результатов в получении трансгенных сельскохозяйственных животных, продуцирующих с молоком другой гематопоэти-ческий фактор роста, эритропоэтин.

Нами получены трансгенные кролики, продуцирующие с молоком чГКСФ. Это было сделано путем инъекции чГКСФ с лактоглобулиновым бычьим промотором в пронуклеус зиготы кролика и пересадки их реципиенту с ложной беременностью. Интеграция гена у исходных трансгенных кроликов составила 3,3 % к числу родившихся у реципиентов потомков. Стадии половозрелости достигли 4 трансгенных самца, и после их спаривания с нетрансгенными самками была выделена линия для дальнейшего размножения. Уровень наследования гена чГКСФ после спаривания трансгенных кроликов с нетрансгенными увеличивался с 16,6 % в F1 до 44,9 %в F3. Низкий уровень наследования гена у кроликов F1 обусловлен, по-видимому, мозаицизмом исходного трансгенного родителя. Стабилизация генома наступила в третьем поколении, когда уровень наследования гена (44,9 %) при спаривании трансгенных кроликов с нетрансгенными приближается к теоретически ожидаемому (50 %). Соответствие наследования чужеродного гена по закону Менделя подтверждается и уровнем наследования от спаривания трансгенных кроликов с трансгенными (79,5 % против 75% по закону Менделя).

Экспрессия гена чГКСФ трансгенных кроликов -по результатам иммуноферментного анализа (E10SA). Концентрация чГКСФ в молоке изменялась в зависимости от стадии лактации, но была не ниже 10-30 мг/л.

Продемонстрирована высокая биологическая активность рекомбинантного чГКСФ в молоке трансгенных кроликов методом in vivo на мышах с вызванной циклофофамидом лейкопенией.

Очистка гликолизированной формы рекомбинантного чГКСФ из молока трансгенных кроликов методом высокоэффективной хроматографии доведена до гомогенного препарата. Установлено, что полученная гликолизированная форма рекомбинантного чГКСФ проявляет более высокую биологическую активность в опытах in vivo на мышах с вызванной циклофосфа-мидом лейкопенией по сравнению с коммерческим препаратом Нейпоген, который является рекомбинантным ГКСФ, выделенным из микроорганизмов. Активность выделенного чГКСФ коррелирует с активностью контрольного цитокина в экспериментах с использованием клеточной линии NFS-60.

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

№2/томЗ/2004