CC BY
15
DOI 10.31588/2413-4201-1883-236-4-138-142
УДК 619:616.98:578.824.11
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА И ОЦЕНКА ЕГО АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ
Мухамеджанова А. Г. - аспирант, Ефимова М. А. - д.б.н., Чернов А. Н. - д.б.н., Хаертынов К. С. - к.в.н., Ахмадеев Р. М. - к.в.н.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: вирус бешенства, антиген, электрофорез, иммуноблот Key words: rabies virus, antigen, electrophoresis, immunoblot
В настоящее время проблема повсеместного распространения рабической инфекции является весьма актуальной проблемой для большинства регионов Российской Федерации, несмотря на активное проведение противоэпизоотических мероприятий [2, 7]. Также сохраняется высокий показатель обращаемости за постэкспозиционной помощью людей, подвергшихся риску инфицирования вирусом бешенства [6, 12]. Необходимым условием эффективности реализации мероприятий по ликвидации бешенства является активная специфическая профилактика и высокоинформативная диагностика, базирующаяся на современных лабораторных методах исследования [3].
Наиболее распространёнными из них являются биопроба на лабораторных животных, морфологическое исследование головного мозга, метод иммунофлуо-ресценции, реакция преципитации в агаровом геле [11]. Однако большинство из них обладает значительными недостатками: низкая чувствительность и недостаточная специфичность (световая микроскопия и реакция преципитации), длительность получения результатов экспертиз и трудоемкость (биопроба и реакция нейтрализации) [8]. Особый интерес для планирования противоэпизоотических мероприятий представляют усовершенствование существующих и разработка новых серологических методов как эффективных средств диагностики бешенства [1, 6]. Подобные исследования требуют предварительной наработки специфиче-
ских компонентов тест-систем - антигенов и иммуноглобулинов [13]. Исследования включают в себя учёт генетических особенностей (вариабельности) вируса [5], а также определение специфичности и чувствительности отдельных компонентов. Недостаточный контроль на этих этапах может привести к снижению диагностической эффективности тест-систем на финальном этапе разработки [9].
Целью настоящего исследования явилась оценка серологической активности и специфичности антигенов вируса бешенства, выделенных из мозговой ткани мышей с использованием гомогенизатора FastPrep и последующего ультрацентрифугирования.
Материал и методы исследований. В ходе проведения исследований использован производственный штамм вируса бешенства «Овечий» ГНКИ (коллекция ФЦТРБ-ВНИВИ), являющийся мозговой суспензией (инфекционный титр 5,25
5 25
lg10- , ). В качестве основного вирусного материала использовалась 20% суспензия в 0,01 М фосфатно-буферном растворе, приготовленная из мозговой ткани мышей, инфицированных интрацеребрально вирусом бешенства и подвергнутых декапита-ции в течение 7 суток при проявлении клинических признаков заболевания.
Для освобождения вируса от мозговой ткани и балластных веществ суспензию подвергали предварительной дезинтеграции на приборе FastPrep®-24 Classic Instrument (MP Biomedicals) согласно ранее изложенной методике [5]. Дальнейшее
осаждение препарата производилось при помощи низкоскоростного центрифугирования при 4200 g на центрифуге LMC-4200R (Biosan); полученный при этом су-пернатант концентрировали ультрацентрифугированием при 25000 g на ультрацентрифуге Optima L-90K (Beckman). Очистку вируса проводили в ступенчатом градиенте сахарозы 10-50% с шагом 10%. Получаемые в процессе концентрирования промежуточные стадии флотации подвергались анализу посредством аналитического электрофореза в 12,5% разделяющем полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием коллоидным раствором Кумасси G-250 (ООО «ДИА-М») по методу Laemmli [10] для выявления локализации полипептидов. С целью повышения чувствительности метода производилось дополнительное окрашивание гелей раствором серебра (Silver diamine solution). Результаты электрофореза подтверждались реакцией иммуноблот (BioRad), постановка которой осуществлялась с использованием сывороток крови, полученных путём гипериммунизации кроликов производственным штаммом вируса бешенства «Овечий» (ГНКИ) с титром 1:6400 - 1:12800.
Серологическую активность наиболее удовлетворяющих заявленным требованиям фракций определяли в сэндвич-мо-
дификации иммуноферментного анализа (ИФА) в 96-луночных полистироловых планшетах в объёме 100 мкл. Определение оптимальной концентрации антигенов вируса бешенства, отобранных с зон сахарозы 15-20% и 40-45%, проводили методом шахматного титрования в концентрациях 2, 4, 6, 8, 10 мкг/мл при разведениях контрольных сывороток от 1:100 до 1:1600. Положительными контролями служили вышеобозначенные гипериммунные сыворотки овец, отрицательными -сыворотки, полученные от интактных животных, в разведениях 1:100 - 1:1600. Ан-тирабический пероксидазный конъюгат (производство «ФЦТРБ-ВНИВИ») применялся в разведении 1:3200. Учёт результатов производился на спектрофотометре Bio-Rad Model 680 при длине волны 490 нм. Концентрацию белка в исследуемых фракциях измеряли на приборе UV-5 (Mettler-Toledo).
Результаты исследований. В результате очистки вирусного материала путём фракционирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы и ультрацентрифугирования нами были получены ранее описанные [5] пять антигенных фракций, отобранных соответственно с зон сахарозы 15-20% (АГ №1), 20-35% (АГ №2), 20-40% (АГ №3), 40-45% (АГ №4), 45-50% (АГ №5).
А В
Рисунок 1 - Денситограммы антигенных фракций: А - фракция АГ№1 с локализацией детерминант в диапазоне 60-67 кДа; В - фракция АГ №4 с преобладающим пиком в диапазоне 67 кДа и дополнительными - в диапазоне 40-45 кДа
Согласно результатам аналитического электрофореза, наиболее удовлетворяющими предъявляемым требованиям явились фракции АГ №1 и АГ №4 с концентрациями по белку 0,78±0,03 мг/мл и
0,45±0,07 мг/мл. Распределение антигенных детерминант в данных фракциях иллюстрируется денситограммами (рисунок 1А, 1В). Согласно представленным денситограммам, основные полипептиды
фракции АГ №1 локализуются в диапазоне молекулярных масс 65-70 кДа, тогда как у фракции АГ №4 обнаруживается дополнительная зона локализации в диапазоне 4045 кДа.
Подобное распределение антигенных детерминант также визуально подтверждено результатами иммуноблота с гипериммунной кроличьей сывороткой (рис. 2).
Рисунок 2 - Активность полученных антигенных фракций в реакции иммуноблот: 1 -фракция АГ №1 (зона сахарозы 15-20%); 2 - фракция АГ №3 (зона сахарозы 20-40%); 3 -фракция АГ №2 (зона сахарозы 20-35%); 4 - фракция АГ №4 (зона сахарозы 40-45%); 5 -фракция АГ №5 (зона сахарозы 45-50%); 6 - осадок, полученный в результате ультрацентрифугирования; 7 - гомогенат супернатанта мозговой ткани, полученный в результате ультрацентрифугирования; 8 - гомогенат осадка мозговой ткани, полученный в результате ультрацентрифугирования; 9 - гомогенат инфицированной мозговой ткани, полученный в результате низкоскоростного центрифугирования; 10 - маркер молекулярных масс.
Следующий этап исследования заключался в определении серологической активности вышеуказанных фракций с использованием гипериммунных кроличьих
и овечьих сывороток с предварительной оптимизацией условий постановки сэн-двич-ИФА на модели овечьих гипериммунных сывороток (табл. 1, 2).
Таблица 1 - Определение оптимальной концентрации антигенной фракции №1, отобранной с зоны сахарозы 15-20% (Сб = 0,78±0,03 мг/мл)
Концентрация антигена (мкг/мл) ОП490 с положительной/отрицательной сыворотками (ОЕ), взятыми в разведении:
1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600
2 0,450/0,052 0,490/0,052 0,590/0,049 0,560/0,053 0,523/0,051
4 0,770/0,061 0,696/0,052 0,880/0,052 0,660/0,056 0,690/0,053
6 0,775/0,047 0,780/0,057 0,902/0,062 0,803/0,059 0,890/0,057
8 0,905/0,053 0,880/0,059 1,112/0,074 0,837/0,063 0,890/0,058
10 1,052/0,062 1,066/0,060 1,217/0,081 0,840/0,067 0,901/0,062
Таблица 2 - Определение оптимальной концентрации антигенной фракции №4,
отобранной с зоны сахарозы 40-45% (Сб = 0,45±0,07 мг/мл)
Концентрация антигена (мкг/мл) ОП490 с положительной/отрицательной сыворотками (ОЕ), взятыми в разведении:
1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600
2 0,490*/0,052 0,410*/0,053 0,430*/0,049 0,389*/0,052 0,390*/0,047
4 0,648*/0,054 0,639*/0,061 0,601*/0,055 0,520*/0,054 0,512*/0,052
6 0,780*/0,059 0,767*/0,063 0,730*/0,059 0,721*/0,053 0,704*/0,058
8 0,903*/0,064 0,901*/0,069 0,830*/0,061 0,811 */0,055 0,802*/0,065
10 1,235*/0,067 1,167*/0,071 1,103*/0,066 0,1020*/0,061 0,891*/0,069
Примечание: * - достоверно относительно отрицательного контроля (р<0,0001)
Исходя из данных, представленных в таблицах, оптимальная концентрация фракции АГ №1 составила 6 мкг/мл, фракции АГ №4 - 10 мкг/мл.
Установленные концентрации антигенов обеспечивали высокий уровень оптической плотности и достоверное различие результатов со специфической положительной и контрольной отрицательной сыворотками в минимальном рабочем разведении 1:400 - 1:800.
Заключение. В результате очистки исходного вирусного материала, предварительно гомогенизированного на Ба81Ргер-24, с последующим фракционированием в градиенте плотности сахарозы нами были получены пять антигенных фракций. Согласно данным аналитического электрофореза, наибольшая активность при исследовании промежуточных стадий флотации была зафиксирована в отношении фракций АГ №1 и АГ №4. На основании анализа полипептидных профилей указанных фракций нами были выявлены диапазоны локализации основных антигенных детерминант. Сравнительно высокая активность и специфичность исследуемых препаратов были подтверждены в реакции иммуноб-лот с гипериммунной кроличьей сывороткой и сэндвич-ИФА; в процессе исследования нами были подобраны оптимальные концентрации антигенных фракций.
На основании данных настоящего исследования будет рассмотрена возможность использования полученных высокоспецифичных фракции антигена вируса бешенства в качестве иммунизирующего
антигена для получения диагностических иммуноглобулинов, что позволит повысить чувствительность и специфичность тест-систем на основе ИФА и РИФ для проведения скрининговых исследований на бешенство и мониторинга эффективности мероприятий по ликвидации бешенства.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Абрамова, Е.Г. Экспериментальное обоснование внедрения куль-туральных технологий в производство ан-тирабического иммуноглобулина / Е.Г. Абрамова, С.В. Генералов, Ж.В. Матвеева, И.М. Жулидов // Проблемы особо опасных инфекций. - 2016. - 2. - С. 95-101. Б01: 10.21055/0370-1069-2016-2-95-101.
2. Бельчихина, А.В. Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по бешенству животных на территории Российской Федерации / А.В. Бельчихина, А.К. Караулов //. Ветеринария сегодня. -2016. - 1(16). - С.64-70.
3. Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза / А.М. Гулюкин // Вопросы вирусологии. - 2014. - Т. 59, № 3. - С. 5-10.
4. Гулюкин, А.М. Особенности эпизоотического процесса и молекулярно-генетических характеристик изолятов вируса бешенства в Республике Татарстан / А.М. Гулюкин, А.А. Шабейкин, О.Н. Зай-кова, И.В. Полякова, А.Д. Забережный и др. // Ветеринарный врач. - 2015. -С.3-11.
5. Ефимова, М.А. Выделение, очистка и оценка серологической активности антигенов вируса бешенства / М.А. Ефимова, К.С. Хаертынов, А.Ф. Арсла-нова, Р.М. Ахмадеев, А.И. Никитин, В.Г. Гумеров, Э.А. Шуралев // Проблемы особо опасных инфекций. - 2017. - №4. - С. 2730.
6. Сухарьков, А.Ю. Диагностика бешенства животных методом им-муноферментного анализа, сравнение прямого и непрямого сэндвич-варианта / А.Ю. Сухарьков, Н.А. Назаров, А.Е. Метлин // Ветеринария Кубани. - 2011. - №6. - С.12-14.
7. Manoj S., Mukherjee A., Johri S., Kumar K.V. Recovery from rabies, a uni-
versally fatal disease. Mil Med Res. 2016; 3: 21. DOI: 10.1186/s40779-016-0089-y.
8. Maxwell M.J., Freire de Carvalho M.H., Hoet A.E., Vigilato M.A., Pompei J.C., Cosivi O., Del Rio Vilas V.J. Building the road to a regional zoonoses strategy: A survey of zoonoses programmes in the Americas. PLoS One. 2017; 12(3): e0174175. DOI: 10.1371/journal.pone.0174175.
9. Tekki I.S., Ponfa Z.N., Nwosuh C.I., Kumbish P.R., Jonah C.L., Okewole P.A., Shamaki D., Ahmed S.M. Comparative assessment of seller's staining test (SST) and direct fluorescent antibody test for rapid and accurate laboratory diagnosis of rabies. Afr Health Sci. 2016; 16(1): 123-7. DOI: 10.4314/ahs.v16i1.16.
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА И ОЦЕНКА ЕГО АКТИВНОСТИ И
СПЕЦИФИЧНОСТИ
Мухамеджанова А. Г., Ефимова М. А., Чернов А. Н., Хаертынов К. С., Ахмадеев Р. М.
Резюме
В настоящей статье приведено обоснование способа получения и очистки антигена вируса бешенства путём гомогенизации на FastPrep-24 с последующим фракционированием в градиенте плотности сахарозы. Установлено, что максимально очищенные антигенные фракции содержатся в зоне сахарозы 15-20%. В результате выделена мажорная фракция полипептидов, высокая антигенная активность которой подтверждена методами ИФА и иммуноблота, что в перспективе позволит использовать её в качестве иммунизирующего материала, а также компонента экспресс-тест-систем для диагностики бешенства.
OBTAINING RABIES VIRUS ANTIGEN AND ASSESSMENT OF ITS ACTIVITY AND SPECIFICITY IN IMMUNOSORBENT ASSAY AND IMMUNOBLOT
Mukhamedzhanova A. G., Efimova M. A., Chernov A. N., Khaertynov K. S., Akhmadeev R. M.
Summary
This article contains the rationale for the preparation and purification of the rabies virus antigen by the homogenization on FastPrep-24, followed by a conversion in a sucrose density gradient. It has been established that the maximum purified antigenic fractions are located in the 1520% sucrose zone. As a result, a major fraction of polypeptides was isolated, a high antigenic activity of which was confirmed by the methods of ELISA and immunoblot. In prospect it can be used as an immunizing material and as a component of rapid test-systems for the diagnosis of rabies.
