CC BY
22
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОПАТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.348-002.44-036.12-078.33-092.9
Гао Ю.1, Постовалова Е.А.1-2, Добрынина М.Т.1, Макарова О.В.12
ПОЛОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ, БРЫЖЕЕЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛАХ И ОБОДОЧНОЙ КИШКЕ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ХРОНИЧЕСКОМ ЯЗВЕННОМ КОЛИТЕ
1Кафедра клеточной биологии и гистологии МГУ им. М.В. Ломоносова, 119234, Москва; 2ФГБНУ «НИИ морфологии человека», 117418, Москва
На модели хронического язвенного колита, индуцированного 1% водным раствором декстрансульфата натрия у мышей линии C57Bl/6, изучали половые различия воспалительного процесса и субпопуляционного состава лимфоцитов. С помощью морфологических методов оценивали выраженность язвенного и воспалительного процессов, определяли субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови, брыжеечных лимфатических узлов и ободочной кишки методом проточной цитофлюориметрии. Показано, что по сравнению с самцами у самок мышей C57Bl/6 хронический язвенный колит протекает тяжелее, у самок более выражен язвенный и воспалительный процессы. Меньшая выраженность воспалительного процесса у самцов сочетается со снижением в ободочной кишке числа лимфоидных узелков. В периферической крови и брыжеечных лимфатических узлах по сравнению с самцами у самок выше относительное содержание CD3+CD8+ цитотоксических и FoxP3+ регуляторных Т-лимфоцитов и в периферической крови CD3+CD4+ Т-хелперов. В отличие от самцов у самок содержание В-лимфоцитов ниже в брыжеечных лимфатических узлах, но выше в ободочной кишке. При хроническом язвенном колите содержание FoxP3+ CD4+CD25+ регуляторных Т-лимфоцитов в ободочной кишке у самок снижается, а у самцов повышается в периферической крови в 3,6 и брыжеечных лимфатических узлах в 2,8 раза, а в ободочной кишке не изменяется. В ободочной кишке у самцов относительное количество CD3+CD4+ Т-хелперов снижается. Относительный показатель субпопуляции CD3-CD19+ В-лимфоцитов при хроническом язвенном колите у животных обоего пола в периферической крови снижается, а в ободочной кишке повышается. В брыжеечных лимфатических узлах этот показатель у самцов повышается.
Ключевые слова: половые различия; хронический язвенный колит; морфология; мыши C57Bl/6; субпопуляционный состав лимфоцитов.
Для цитирования: Гао Ю., Постовалова Е.А., Добрынина М.Т., Макарова О.В. Половые различия субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови, брыжеечных лимфатических узлах и ободочной кишке при экспериментальном хроническом язвенном колите. Иммунология. 2018; 39(1): 32-38. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-32-38
Gao Y.1, Postovalova E.A.'■2, DobryninaM.T.1, Makarova O.V.2
SEX DIFFERENCES OF SUBPOPULATION COMPOSITION OF LYMPHOCYTES IN THE PERIPHERAL BLOOD, MESENTERIC LYMPH NODES AND COLON IN EXPERIMENTAL CHRONIC ULCERATIVE COLITIS
department of Cell biology and histology, The biological faculty of Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow;
2Research institute of human morphology, 117418, Moscow
We studied sex differences of the inflammatory process and the subpopulation composition of lymphocytes in chronic ulcerative colitis, induced with 1% aquatic solution in C57Bl/6 mice. We showed that chronic ulcerative colitis was more severe in female C56Bl/6 mice, in comparison with males, with more pronounced ulceration and inflammation. Female mice had higher relative content of CD3+CD8 cytotoxic and FoxP3+ regulatory T-lymphocytes in the peripheral blood and lymph nodes and CD3+CD4+ Т-helpers in the peripheral blood. Unlike males the B-lymphocytic content of female mice was lower in the mesenteric lymph nodes but higher in the colon. In female mice with chronic ulcerative colitis the content of FoxP3+ CD4+CD25+ regulatory -lymphocytes decreased, but in male mice it increased 3.6 fold in the peripheral blood, 2.8 fold in mesenteric lymph nodes and did not change in the colon. Male mice also had a decrease in the relative number of CD3+CD4+ T-helpers. During chronic ulcerative colitis, both sexes had a decrease in the level of the CD3-CD19+ B-lymphocytic subpopulation in the peripheral blood and an increase in the colon.
Keywords: sex differences; chronic ulcerative colitis; morphology; C57BI/6 mouse; subpopulation composition of lymphocytes.
For citation: Gao Y., Postovalova E.A., Dobrynina M.T., Makarova O.V. Sex differences of subpopulation composition of lymphocytes in the peripheral blood, mesenteric lymph nodes and colon in experimental chronic ulcerative colitis. Immunologiya. 2018; 39(1): 32-38. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-32-38
For correspondence: Postovalova Ekaterina Andreevna, E-mail: [email protected]
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 15.06.15
Для корреспонденции: Постовалова Екатерина Андреевна, E-mail: [email protected]
Accepted 16.08.17
Введение
Проблема гендерных различий клинического течения и механизмов развития воспалительных заболеваний интенсивно изучается и является актуальной, так как лечение больных с учётом пола позволит повысить его эффективность [1]. По данным литературы, показатели частоты развития большинства воспалительных инфекционных заболеваний, а также смертность выше у мужчин, чем у женщин [1]. Половые гистофизиологи-ческие различия иммунной системы, играющей ключевую роль в развитии воспалительных заболеваний, определяются карио-типом и уровнем стероидных половых гормонов - эстрогенов, прогестерона, андрогенов и экспрессией клеточных рецепторов к ним [2 - 6]. Половой диморфизм частоты развития и тяжести течения инфекционно-воспалительных и аутоиммунных заболеваний у человека особенно ярко проявляется после полового созревания, что, вероятно, обусловлено влиянием половых гормонов на морфофункциональное состояние иммунной системы и метаболические процессы [2, 3, 6]. Показано, что у женщин репродуктивного возраста выраженность реакций клеточно-опосредованного и гуморального иммунного ответа выше, чем у мужчин [2, 7, 8]. По сравнению с мужчинами у женщин выше содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови и уровень продукции противовоспалительных цитокинов [3, 9, 10].
Гендерные различия воспалительных заболеваний кишечника представлены в литературе, главным образом, клиническими и статистическими данными. В литературе [11] I.K. Kim и соавт. показали, что распространённость язвенного колита составляет 0,16 случаев на 100 тыс. человек. Половых различий в частоте развития язвенного колита не выявлено [12]. Известно, что при длительном течении язвенного колита у мужчин в 5 раз чаще, чем у женщин развивается колоректальный рак [13, 14].
К сожалению, во многих работах, посвящённых инфекци-онно-воспалительным заболеваниям и, в частности, язвенному колиту, исследования проводятся без учёта пола больных и их репродуктивного статуса [11]. Пол и уровень стероидных гормонов в значительной мере модифицируют иммунный ответ и, соответственно, течение воспалительных процессов при язвенном колите. Изучение половых различий течения язвенного колита собенно актуально, так как полученные результаты позволят проводить более успешную терапию.
В литературе данные о половых различиях клинического течения и морфологических проявлений хронического язвенного колита отсутствуют, что связано с трудностями в формировании репрезентативных групп наблюдения по длительности течения заболевания, его активности и проводимой лекарственной терапии.
Цель работы - изучение половых различий морфологических изменений и субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови, брыжеечных лимфатических узлах и ободочной кишке при экспериментальном хроническом язвенном колите, индуцированным декстрансульфатом натрия у половозрелых мышей линии С57В1/6.
Материал и методы
Работа выполнена на половозрелых самках (n = 20) и самцах (n = 20) мышей C57BL/6, полученных из питомника филиал «Столбовая» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства». Методом случайного отбора были сформированы контрольные и опытные группы, по 10 животных в каждой. Возраст мышей составлял 6-8 недель, масса тела - 18-22 г Животные получали свободный доступ к питьевой воде и брикетированному корму ПК-120-1 (ООО «Лабораторснаб»). При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г
ORIGINAL ARTICLE
С целью моделирования хронического язвенного колита мыши опытной группы обоего пола получали 1% водный раствор декстрансульфата натрия (ДСН) (Mr ~40,000, BioChemica, Германия) в течение первых четырёх суток эксперимента и повторно с 10-х по 12-е и с 21-х по 25-е сутки. Мыши контрольной группы получали питьевую воду. Животных с хроническим колитом и контрольных групп выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира на 60-е сутки.
Лимфоидные узелки подсчитывали в макропрепаратах ободочной кишки, фиксированных в 2% водном растворе уксусной кислоты. Для гистологического исследования проводили забор дистального отдела ободочной кишки, материал фиксировали в жидкости Буэна. Образцы тканей проводили по спиртовым растворам возрастающих концентраций, заливали в парафин, изготовляли гистологические препараты. Проводку материала осуществляли в аппарате Tissue-Tek VIP5Jr (Sakura, США). Обезвоженные образцы заливали в гистомикс на аппарате Tissue-Tek TEC (Sakura, США), изготовляли срезы толщиной 4 - 6 мкм на микротоме модели Microm HM340E (Thermo Scientific, США), монтировали их на предметные стёкла, проводили стандартную гистологическую обработку препаратов и окрашивали их гематоксилином и эозином. Анализ и съёмку гистологических препаратов проводили на микроскопе AxioPlan 2 Imaging (Carl Zeiss, Германия) с цифровой камерой AxioCam RHC (Carl Zeiss, Германия).
Для морфометрической оценки распространённости гиперемии и язв макропрепараты продольно рассечённой ободочной кишки мышей с хроническим язвенным колитом фотографировали и на фотографиях оценивали их площадь с помощью морфометрической программы Image-Pro Plus 6.0.
С целью иммунофенотипического анализа лимфоцитов получали суспензию клеток из брыжеечных лимфатических узлов с помощью гомогенизатора Поттера в культуральной среде 199 с солями Хэнкса и глутамином (ПанЭко). Выделение суспензии клеток из ободочной кишки проводили по B. Weigmann и соавт. (2007). Фрагменты медиального отдела ободочной кишки инкубировали в растворе культуральной среды RPMI Medium 1640 (Gibco, UK) с этилендиаминтетра-уксусной кислотой (Sigma Aldrich, USA) и дитиотрейтолом, затем в культуральной среде RPMI Medium 1640 (Gibco, UK), содержащей коллагеназу Д (Roche, Switzerland), выделенную из Clostridium histolyticum, диспазу 2 (Roche, Швейцария), полученную из Bacillus polymyxa, ДНКазу 1 (Thermo Scientific, США). Проводили забор крови из шейных вен, в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА (5 мг/мл).
Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и суспензии клеток брыжеечных лимфатических узлов и стенки ободочной кишки определяли методом проточной цитофлуориметрии на приборе Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США), использовали антитела CD3e-FITC, CD4-PE-Cy5, CD8a-PE-Cy7, CD19-PE, F4/80-PE (eBioscience, США). Выявление субпопуляции регуляторных Т-лимфоцитов проводили согласно протоколу с помощью наборов Mouse Regulatory T Cell Staining Kit #3 (eBioscience, США). Абсолютное количество лейкоцитов и лимфоцитов в крови оценивали на гематологическом анализаторе Celltac alpha MEK-6400 (Nihon Kohden, Япония), абсолютное количество клеток в суспензиях клеток подсчитывали в камере Горяева.
Статистическую обработку показателей проводили с учётом характера распределения непараметрическими методами (^-критерий Манна - Уитни) в программе Statistica 8.0. Вычисляли медиану и интерквартильный размах - 25 - 75%. Различия считали достоверными при р < 0,05.
Результаты
При сравнительной макроскопической оценке относительной площади распространённости очагов - гиперемии и язв в слизистой оболочке ободочной кишки - установлено,
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
%
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
□ Ме<Лап Ц 25-75% Щ Шоп-О^Нег Рапде
^ р-0 008
£ -
\
Рис. 1. Относительная площадь язв в слизистой оболочке ободочной кишки у самок и самцов мышей С57В1/6 при хроническом язвенном колите (р <0,05).
□ МесИап Ц 25-75% ^ Ыоп-О^Нег Рапде о О^Пегз * Ех^ешев
□
2.4
2.2
2.0
1.8
5
5 1.6
о
л о 1.4
о 1.2
ю
< 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
* Р=0.003 **
Контрольная ХЯК Контрольная ХЯК группа группа
Рис. 2. Абсолютное количество лимфоидных узелков в ободочной кишке у самок и самцов мышей С57В1/6 контрольной группы и при хроническом язвенном колите (ХЯК).
что у самок с хроническим язвенным колитом показатели статистически значимо выше, чем у самцов (рис. 1).
При гистологическом исследовании продольных срезов дистального отдела ободочной кишки у самцов и самок мышей С57В^/6 с хроническим язвенным колитом картина была сходной и мозаичной. Отмечалось небольшое количество эпителизирующихся язв. Язвы были узкие, щелевидной или пирамидальной формы, их поверхность была выстлана однорядным уплощённым эпителием. Дно язв образовано грануляционной тканью с частично упорядоченным ходом коллагеновых волокон, со слабо- и умеренно выраженной инфильтрацией лимфоцитами, плазмоцитами, гистиоцитами. В краях язв выявлялись деформированные крипты, выстланные высоким призматическим эпителием с наличием митозов и отсутствием бокаловидных клеток.
На всём протяжении ободочной кишки наблюдалась воспалительная инфильтрация собственной пластинки слизистой
оболочки, особенно её базального отдела, и подслизистой основы плазмоцитами, лимфоцитами, единичными нейтрофила-ми и макрофагами, была видна деформация крипт, заполнение их просветов слизью. Встречались небольшие участки слизистой оболочки без выраженных воспалительных изменений. Отмечался очаговый фиброз базального отдела собственной пластинки слизистой и мышечной оболочек. По сравнению с самцами у самок показатель обьёмной доли воспалительного инфильтрата был выше и составил, соответственно, 19.55 (17.93, 21.37) и 30.23 (27.93, 31.35). На всём протяжении ободочной кишки в слизистой оболочке, преимущественно в её собственной пластинке, выявлялись лимфоидные узелки, часть их была со светлыми центрами. По данным макроскопической оценки, число лимфоидных узелков у самок с хроническим колитом по сравнению с контрольной группой не изменялось, а у самцов снижалось (рис. 2).
Таким образом, при хроническом язвенном колите в отличие от самцов у самок отмечалась большая распространённость язвенного процесса, более выраженная воспалительная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы. Менее выраженный язвенно-воспалительный процесс у самцов сочетался со снижением числа лимфоидных узелков в стенке ободочной кишки.
В контрольной группе по сравнению с самками у самцов в периферической крови относительное содержание CD3+CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов и FoxP3+ CD4+CD25+ регуляторных Т-лимфоцитов было ниже. В брыжеечных лимфатических узлах у самцов было ниже процентное содержание CD3+CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов и FoxP3+ CD4+CD25+ регуляторных Т-лимфоцитов, а в ободочной кишке - регуляторных Т-лимфоцитов (рис. 3). Относительное количество В-лимфоцитов в периферической крови у самок и самцов не различалось. По сравнению с самками у самцов в брыжеечных лимфатических узлах содержание В-лимфоцитов было выше в 1,6 раза, а в ободочной кишке - в 6,5 раза ниже (рис. 3).
При хроническом язвенном колите, по сравнению с контрольной группой, у самок в периферической крови снижались показатели относительного количества В-лимфоцитов (табл. 1). В брыжеечных лимфатических узлах у самок (в отличие от контроля) повышались показатели абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов (табл. 2). В суспензии клеток, выделенных из ободочной кишки, при хроническом колите у самок отмечалось увеличение показателей процентного содержания В-лимфоцитов, а относительное содержание регуляторных Т-лимфоцитов было выше у животных контрольной группы (табл. 3).
В периферической крови у самцов с хроническим колитом по сравнению с контролем были ниже показатели относительного количества Т-хелперов (14,84 (14,40, 16,00) -контрольная группа; 11,75 (6,90, 14,20) - хронический язвенный колит; р < 0,02)) и В-лимфоцитов, а регуляторных Т-лимфоцитов - выше (см. табл. 1). В брыжеечных лимфатических узлах по сравнению с контролем при хроническом колите у самцов снижалось процентное содержание Т-лимфоцитов хелперов (34,18 (29,00, 37,60) - контрольная группа; 25,80 (21,00, 30,00) - хронический язвенный колит; р < 0,01)), но повышалось процентное содержание В-лимфоцитов и регуляторных Т-лимфоцитов (см. табл. 2). В суспензии клеток из ободочной кишки при хроническом колите у самцов увеличивались показатели относительного количества Т-хелперов (2,90 (1,60, 3,50) - контрольная группа; 7,40 (4,60, 1,20) - хронический язвенный колит; р < 0,003)) и В-лимфоцитов (см. табл. 3).
Обсуждение результатов исследования
В работе Ю. Гао и соавт. [15] на модели острого язвенного колита, индуцированного ДСН, показано, что у самцов мышей С57В1/6 его клинические и морфологические прояв-
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 1
Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у самок и самцов мышей C57Bl/6 контрольной группы и при хроническом язвенном колите (ХЯК)
Параметры Контр., самки ХЯК, самки Р Контр., самцы ХЯК, самцы p
Лейкоциты, млн/мл 7,80 (6,70, 8,80) 5,40 (5,20, 5,40) 0,006 9,38 (8,80, 9,60) 6,75 (4,40, 11,70) 0,08
Лимфоциты, млн/мл 5,30 (4,70, 7,80) 3,50 (3,30, 3,50) 0,03 7,50 (7,06, 8,10) 7,80 (6,50, 9,40) 0,35
Т-хелперы (СЭ4+ СЭ3+), % 16,760 (14,80, 17,70) 17,00 (16,40, 18,10) 0,62 14,84 (14,14; 16,0) 11,75 (6,90, 14,20) 0,02
Цитотоксические Т-лимфоциты 16,00 (13,80, 17,65) 16,90 (14,80, 17,90) 0,72 12,88 (11,20, 14,60) 10,95 (9,30, 19,40) 0,35
(СЭ3+ СЭ8+), %
В-лимфоциты (СЭ3- СЭ19+), % 58,10 (53,70, 60,35) 42,95 (39,60, 50,85) 0,03 65,80 (57,90, 66,80) 44,20 (30,00, 54,00) 0,001
Регуляторные Т-лимфоциты 6,80 (5,40,10,20) 7,60 (6,75, 8,00) 0,86 2,80 (2,40, 3,60) 9,95 (7,30, 11,50) 0,0001
(Рохр3+СЭ4+ СЭ25+), % от
Т-хелперов
Таблица 2
Субпопуляционный состав лимфоцитов брыжеечных лимфатических узлов у самок и самцов мышей C57Bl/6 контрольной группы и при хроническом язвенном колите (ХЯК)
Параметры Контр., самки ХЯК, самки Р Контр., самцы ХЯК, самцы Р
Лейкоциты, млн/мл 28,8 (22,30, 33,90) 38,90 (32,85, 43,40) 0,045 27,24 (22,80, 27,50) 22,90 (11,75, 43,15) 0,85
Лимфоциты, млн/мл 24,70 (19,13, 29,07) 33,57 (28,35, 37,46) 0,045 19,39 (15,61, 20,48) 19,09 (9,80, 35,98) 0,95
Т-хелперы (СЭ4+ СЭ3+), % 35,10 (33,70, 35,30) 33,75 (32,95, 35,45) 0,52 34,18 (29,00, 37,60) 25,80 (21,00, 30,00) 0,01
Цитотоксические Т-лимфоциты (СЭ3+ СЭ8+), % 36,60 (35,60, 37,10) 33,45 (32,25, 38,10) 0,28 25,37 (21,70, 26,40) 27,10 (23,90, 27,80) 0,30
В-лимфоциты (СЭ3- СЭ19+), % 22,80 (20,80, 25,60) 25,85 (20,75, 27,05) 0,35 36,46 (36,10, 37,10) 40,20 (37,90, 47,80) 0,03
Регуляторные Т-лимфоциты (Рохр3+СЭ4+ СЭ25+), % от Т-хелперов 17,10 (12,60, 18,80) 17,75 (15,85, 21,20) 0,95 5,41 (5,40, 5,52) 14,95 (13,80, 17,65) 0,002
Таблица 3
Субпопуляционный состав лимфоцитов в суспензии клеток, выделенных из ободочной кишки у самок и самцов мышей C57Bl/6 контрольной группы и при хроническом язвенном колите (ХЯК)
Параметры Контр., самки ХЯК, самки Р Контр., самцы ХЯК, самцы Р
Лейкоциты, млн/мл 1,00 (0,60, 1,10) 0,80 (0,60, 1,10) 0,58 1,10 (0,40, 1,10) 1,10 (0,40, 1,30) 0,44
Лимфоциты, млн/мл 0,40 (0,25, 0,50) 0,25 (0,21, 0,30) 0,09 0,60 (0,50, 0,67) 0,50 (0,16, 0,50) 0,19
Т-хелперы (СЭ4+ СЭ3+), % 12,60 (10,10, 13,90) 13,90 (9,10, 23,60) 0,32 2,90 (1,60, 3,50) 7,40 (4,60, 12,20) 0,003
В-лимфоциты (СЭ3+ СЭ19+), % 9,10 (7,90, 9,38) 34,80 (18,20, 51,90) 0,0005 1,40 (0,40, 1,80) 14,60 (7,70, 30,50) 0,001
Регуляторные Т-лимфоциты (Рохр3+СЭ4+ СЭ25+), % от Т-хелперов 57,40 (32,90, 63,00) 19,30 (15,70, 26,40) 0,004 15,40 (14,50, 16,40) 29,55 (9,60, 61,00) 0,44
ления более выражены, чем у самок. В отличие от экспериментального острого язвенного колита, при котором воспалительный процесс более выражен у самцов, при хроническом язвенном колите тяжесть воспалительного процесса оказалась выше у самок. По данным проведённой нами оценки выраженности в ободочной кишке язвенно-воспалительного процесса у мышей С57В1/6 с ДСН-индуцированным хроническим язвенным колитом распространённость очагов гиперемии и язв в слизистой оболочке у самок в 2,5 раза выше, чем у самцов. В литературе отсутствуют данные о взаимосвязи половых различий и тяжести воспалительного процесса с изменениями субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, брыжеечных лимфатических узлах и стенки ободочной кишки.
Сведения, посвящённые половым различиям субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови у лабораторных животных в норме, противоречивы. По нашим данным, в периферической крови у самцов мышей С57В1/6 в отличие от самок в контрольной группе показатели FoxP3+
регуляторных и CD3+ CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов ниже. В брыжеечных лимфатических узлах самок в отличие от самцов выше показатели CD3+ CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов и ниже CD3- CD19+ В-лимфоцитов, что является для самок нормой. В ободочной кишке у самок выше содержание В-лимфоцитов.
Содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови является интегративным показателем, отражающим на организменном уровне процессы пролиферации, дифферен-цировки и миграции иммунокомпетентных клеток. Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов в брыжеечных лимфатических узлах и стенке ободочной кишки характеризуют состояние локального компартмента иммунной системы. Одной из основных субпопуляций лимфоцитов, модулирующих иммунологические реакции, являются регуляторные Т-лимфоциты. Они представлены двумя популяциями: натуральными, имеющими тимическое происхождение, и индуцированными, которые дифференцируются в периферических органах и компартментах иммунной системы [16].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
%
22
Контрольная"
группа
£ А
Р=0,02 **
£
п
Цитоксические Регуляторные
Периферическая кровь
%
72 70 68 66 64 62 60 58 56 54 52 50 48 46 44
1
—Контроль группа
£
J ц
° О
В-лимфоциты
%
Брыжеечные лимфатические узлы
%
Контрольная *
1 НУ Р=0, 303
**
* Р=0, Э01
*
< -
А
Контрольная Р=0,001
группа
] [
£ 5
Цитоксические Регуляторные
В-лимфоциты
%
70
Ободочная кишка
%
60 50 40 30 20 10 0 -10
Контрольная группа г □ * Р=0,02
9
1 а =1
Ос
£ 0
Контрольная
С ъ Р=0,03
■1
А
Цитоксические Регуляторные
В-лимфоциты
□ Ме(Лап Ц 25-75% Non-Outlier Range о Outliers * Extremes
Рис. 3. Относительное содержание CD3+CD8+ цитотоксических и FoxP3+CD4+CD25+ регуляторных Т-лимфоцитов и CD3"CD19+-В-лимфоцитов в периферической крови, брыжеечных лимфатических узлах и ободочной кишке у самок и самцов мышей C57Bl/6 контрольной группы.
Содержание FoxP3+ CD4+CD25+ регуляторных Т-лимфо-цитов у самок считается нормой по сравнению с самцами, у которых эти показатели выше как в крови и брыжеечных лимфатических узлах, так и в ободочной кишке. Эти половые различия, видимо, во многом определяют особенности течения экспериментального хронического язвенного колита. Известно, что в механизмах развития язвенного колита наряду с изменениями слизистого барьера и состава микрофлоры играют роль нарушения реакций иммунного ответа и, в первую очередь, дисбаланс супрессорно-цитотоксических и Т-регуляторных лимфоцитов [17]. Т-регуляторные лимфоциты оказывают супрессорное действие и снижают выраженность воспалительных реакций. Этот механизм опосредуется подавлением популяции супрессорно-цитотоксических Т-лимфоцитов. В ряде исследований показано, что при язвенном колите у человека снижено содержание регулятор-ных Т-лимфоцитов в периферической крови, но увеличено в стенке ободочной кишки [16, 18-21]. Процентное содержание регуляторных Т-лимфоцитов находится в обратной зависимости от активности заболевания: чем выше активность колита, тем ниже содержание регуляторных Т-лимфоцитов [22]. Так, ВгапсЬо^ G. и др. [23] оценивали в периферической крови у больных язвенным колитом содержание регу-ляторных Т-лимфоцитов и показали, что содержание этой субпопуляции низкое и что показатели у мужчин и женщин не различаются. Однако следует отметить, что все пациенты получали иммуносупрессорные препараты - азатиоприн и системные глюкокортикоиды, которые влияют на дифферен-цировку регуляторных Т-лимфоцитов. Реакция лимфатических узлов при хроническом язвенном колите у самок более выражена, чем у самцов, и характеризуется повышением содержания Т-хелперов лимфоцитов, супрессорно-цитотокси-ческих и регуляторных Т-лимфоцитов, но в отличие от самцов у самок выше содержание В-лимфоцитов.
При хроническом колите в ободочной кишке самок в 3,8 раза повышается содержание В-лимфоцитов, а регуляторных Т-лимфоцитов в 2,9 раза снижается. Тогда как у самцов при хроническом язвенном колите повышаются в 2,6 раза показатели содержания лимфоцитов Т-хелперов и В-лимфоцитов. Показатели содержания в ободочной кишке В-лимфоцитов и регуляторных Т-лимфоцитов у них самцов характеризуются высокой вариабельностью, и статистических значимых различий их содержания не выявлено.
Морфологические проявления хронического язвенного колита у самок более выражены, чем у самцов, а содержание ключевой иммуносупрессорной субпопуляции регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови и брыжеечных лимфатических узлах у них не изменяется, а в ободочной кишке снижается.
Сравнительный анализ относительного количества регу-ляторных Т-лимфоцитов позволяет предположить, что процессы дифференцировки и миграции этих субпопуляций клеток при хроническом язвенном колите интенсифицируются. В ободочной кишке у самок при хроническом язвенном колите снижено содержание регуляторных Т-лимфоцитов, что обусловливает более выраженную локальную иммунную воспалительную реакцию и косвенно свидетельствует о недостаточной дифференцировке индуцированных регулятор-ных Т-лимфоцитов.
Выводы
1. По сравнению с самцами у самок мышей C57BL/6 хронический язвенный колит характеризуется более выраженным язвенным и воспалительным процессами. Меньшая выраженность воспалительного процесса у самцов сочетается со снижением в ободочной кишке числа лимфоидных узелков.
2. В контрольной группе у самцов и самок мышей C57BL/6 баланс субпопуляций лимфоцитов во всех иссле-
ORIGINAL ARTICLE
дованных компартментах иммунной системы различается. В периферической крови и брыжеечных лимфатических узлах по сравнению с самцами у самок выше относительное содержание CD3+CD8+ цитотоксических и FoxP3+ регуляторных Т-лимфоцитов и в периферической крови - CD3+CD4+ Т-хелперов. В отличие от самцов у самок содержание В-лимфоцитов ниже в брыжеечных лимфатических узлах, но выше в ободочной кишке.
3. При хроническом язвенном колите статистических значимых различий показателей содержания CD3+CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов в периферической крови, брыжеечных лимфатических узлах и ободочной кишке не выявлено, но у самцов снижено относительное количество CD3+CD4+ Т-хелперов. Содержание FoxP3+ CD4+CD25+ регу-ляторных Т-лимфоцитов в ободочной кишке у самок снижается, а у самцов повышается в периферической крови в 3,6 и брыжеечных лимфатических узлах в 2,8 раза, а в ободочной кишке не изменяется. В ободочной кишке у самцов относительное количество CD3+CD4+ Т-хелперов снижается.
4. Относительный показатель субпопуляции CD3-CD19+ В-лимфоцитов при хроническом язвенном колите у животных обоего пола в периферической крови снижается, а в ободочной кишке повышается. В брыжеечных лимфатических узлах у самок показатель содержания этой субпопуляции не изменяется, а у самцов повышается.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-14, 16—23 см. REFERENCES)
15. Гао Ю., Постовалова Е.А., Добрынина М.Т., Макарова О.В. Половые различия морфологических изменений и иммунологических нарушений при экспериментальном остром язвенном колите. Клиническая и экспериментальная морфология. М. 2016; 1(17): 37-42.
REFERRENCES
1. Giefing-Kroll C., Berger P., Lepperdinger G., Grubeck-Loebenstein B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 2015; 14(3): 309-21.
2. Angele M.K., Frantz M.C., Chaudy I.H. Gender and sex hormones influence the response to trauma and sepsis: potential therapeutic approahes. Clinics. 2006; 61(5): 479-88.
3. Bouman A., Heineman M.J., Faas M.M. Sex hormones and the immune response in humans. HumReprodUpdate. 2005; 11(4): 411-23.
4. Klein S.L. Immune Cells Have Sex and So Should Journal Articles. Nat. Rev. Immunol. 2012; 153(6): 2544-50.
5. Olsen N.J., Kovacs W.J. Gonadal steroids and immunity. Endocrine Reviews. 1996; 17(4): 369.
6. Roberts C.W. Sex-associated hormones and immunity to protozoan parasites. Rev. Clin. Microbiol. 2010; 14: 476-88.
7. Fish E.N. The X-files in immunity: sex-based differences predispose immune responses. Nat. Rev. Immunol. 2008; 8(9): 737-44.
8. Knoferl M.W., Angele M.K., Schwacha M.G., Bland K.I., Chaudry I.H. Preservation of splenic immume functions by female sex hormones after trauma-hemorrhage. Crit. Care. Med. 2002; 30: 888-93.
9. Latham K.A., Zamora A., Drought H., Subramanian S., Matejuk A. et al. Estradiol treatment redirects the isotype of the autoandibody response and prevents the development of autoimmune arthritis. Hum. Reprod. Update. 2003; 171: 5820-7.
10. Mullen A.C., High F.A., Hutchins A.S., Lee H.W., Villarino A.V., Livingston D.M. et al. Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection. Science. 2001; 292: 1907-10.
11. Kim I.K., Park K.J., Kang G.H., Im J.P., Kim S.G. et al. Risk factors for complications after total colectomy in ulcerative colitis. Turk. J.Gastroenterol. 2012; 23(5): 515-22.
12. Glickman R.M. Inflammatory bowel disease: ulcerative colitis and Crohn's disease. Harrison's principles of internal medicine. 1991; 1268-81.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
13. Murphy G., Devesa S.S., Cross A.J., Inskip P.D., McGlynn K.A. et al. Sex disparities in colorectal cancer incidence by anatomic subsite, race and age. Int. J. Cancer. 2010; 128: 1668-75.
14. Loftus C.G., Loftus E.V. Jr, Harmsen W.S., Zinsmeister A.R., Tremaine W.J. et al. Updated Incidence and Prevalence of Crohn's Disease and Ulcerative Colitis in Olmsted County, Minnesota (19702011). Inflamm. Bowel Dis. 2007; 13(3): 254-61.
15. Gao Y., Postovalova E.A., Dobrynina M.T., Makarova O.V. Sex-related differences in morphological changes and immune disorders during experimental acute ulcerative colitis. Klinicheskaya i experimentalnaya morfologiya. 2016; 1(17): 37-42. (in Russian)
16. Maul J., Loddenkemper C., Mundt P., Berg E., Giese Peripheral and intestinal regulatory CD4+ CD25(high) T cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2005; 128: 1868-78.
17. Vignali D.A.A., Collison L.W., Workman C.J. How regulatory T cells work. Nat.Rev. Immunol. 2008; 7(8): 523-32.
18. Wang Y., Liu X.P., Zhao Z.B., Chen J.H., Yu C.G. Expression of CD4+ forkhead box P3 (FOXP3)+ regulatory T cells in inflammatory bowel disease. J. Dig. Dis. 2011; 12: 286-94.
19. Makita S., Kanai T., Oshima S., Uraushihara K., Totsuka T. et al. CD4+CD25bright T cells in human intestinal lamina propria as regulatory cells. J. Immunol. 2004; 173: 3119-30.
20. Holmen N., Lundgren A., Lundin S., Bergin A.M., Rudin A. et al. Functional CD4+CD25high regulatory T cells are enriched in the colonic mucosa of patients with active ulcerative colitis and increase with disease activity. Inflamm. Bowel Dis. 2006; 12: 447-56.
21. Dige A., Hvas C.L., Deleuran B., Kelsen J., Bendix-Struve M. et al. Adalimumab treatment in Crohn's disease does not induce early changes in regulatory T cells. Scand. J. Gastroenterol. 2011; 46: 1206-14.
22. Saruta M., Yu Q.T., Fleshner P.R., Mantel P.Y., Schmidt-Weber C.B. et al. Characterization of FOXP3+CD4+ regulatory T cells in Crohn's disease. Clin. Immunol. 2007; 125: 281-90.
23. Brandhorst G., Petrova D.T., Weigand S., Eberle C., Nicolas von Ahsen et al. Lack of correlation between Treg quantification assays in inflammatory bowel disease patients. World J. Gastroenterol. 2015; 21(11): 3325-9.
Поступила 15.06.17 Принята в печать 16.08.17
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 616-002-092:612.015.1.017.1
Кулебякина М.А.1, Дыйканов Д.Т.1, Рубцов Ю.П.1, Семина Е.В12, Ткачук В.А12
КОМПОНЕНТЫ УРОКИНАЗНОЙ СИСТЕМЫ ОКАЗЫВАЮТ РЕЦИПРОКНОЕ ВЛИЯНИЕ НА НАКОПЛЕНИЕ АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ И ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ^ЛИМФОЦИТОВ В СЕЛЕЗЕНКЕ
1Факультет фундаментальной медицины ФГБОУ МГУ им. М.В. Ломоносова, 119192, г. Москва, Россия; 2Лаборатория молекулярной эндокринологии ФГБУ «НМИЦК» Минздрава РФ, 121552, г. Москва, Россия
При ряде аутоиммунных заболеваний выявляется взаимосвязь с нарушением функции регуляторных Т-лимфоцитов (Treg), выполняющих в организме функцию иммуносупрессии. Существуют свидетельства того, что в функционировании регуляторных Т-лимфоцитов участвует урокиназа (uPA), сериновая протеаза крови и межклеточного матрикса, стимулирующая процессы фибринолиза, а также способная запускать внутриклеточную сигнализацию, регулирующую миграцию, пролиферацию и выживаемость клеток. Несмотря на имеющиеся данные, на сегодняшний день до конца не установлено, является ли влияние uPA на функционирование Treg физиологически значимым в регуляции иммунного ответа. Кроме того, также остается неизвестным, участвует ли в uPA-зависимой регуляции функционирования этой субпопуляции лимфоцитов специфический мембранный рецептор uPA, uPAR (Сй87), представляющий собой гликозилфосфатидилинозитол- ^Р|-) заякоренный белок. Мы провели оценку влияния урокиназы и её рецептора на содержание различных субпопуляций лимфоцитов в селезенке мышей. Для этого мы использовали мышей, нокаутных по урокиназе, а также мышей, нокаутных по урокиназному рецептору. Обнаружено, что выключение урокиназной системы приводит к двукратному снижению в селезенке количества Т-регуляторных лимфоцитов, подавляющих активацию иммунной системы. Более того, в селезенке нокаутных мышей обоих линий увеличивается содержание цитотоксических (СР8+) Т-лимфоцитов и активированных (СР25+) лимфоцитов, что может являться свидетельством избыточной лимфопролиферации. Тот факт, что наблюдаемые изменения происходят как у животных, лишенных иРА, так и у лишённых uPAR, позволяет нам предположить, что все эти эффекты опосредованы зависимым от uPAR механизмом действия иРА, а не её протеолитической активностью.
Ключевые слова: урокиназа; рецептор урокиназы; Т-лимфоциты; цитотоксические Т-лимфоциты; регуляторные Т-лимфоциты.
Для цитирования: Кулебякина М.А., Дыйканов Д.Т., Рубцов ЮП., Семина Е.В., Ткачук В.А. Компоненты урокиназной системы оказывают реципрокное влияние на накопление антивоспалительных регуляторных и про-воспалительных цитотоксических Т-лимфоцитов в селезенке. Иммунология. 2018; 39(1): 38-43. Б01: http://dx.doi. 0^/10.18821/0206-4952-2018-39-1-38-43
Для корреспонденции: Семина Екатерина В., канд. биол. наук, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эндокринологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии», E-mail: [email protected]
Список сокращений: Treg - регуляторные Т-лимфоциты, uPA - активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа), CD87 или uPAR - рецептор урокиназы, WT - животные дикого типа, uPA-/- - мыши, нокаутные по гену урокиназы, uPAR-/- - мыши, нокаутные по гену урокиназного рецептора.
