CC BY
76
УДК 571.27
Полиреактивные аутоантитела при рассеянном склерозе: функциональный отбор из фаг-дисплейной библиотеки в сочетании с методом широкомасштабного секвенирования
Я. А. Ломакин1#*, М. Ю. Захарова1#, А. А. Белогуров1,2, Н. А. Быкова3,4, М. А. Дронина1,
А. Е. Тупикин5,6, В. Д. Кнорре1, А. Н. Бойко7,8, А. В. Фаворов9,10,11, М. Р. Кабилов5,6,
Н. А. Пономаренко1, А. Г. Габибов1,2,12
1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
2Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5
3Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича РАН, 127994, Москва,
Большой Каретный пер., 19, стр. 1
4Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73
5Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090,
Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8
6Центр коллективного пользования «Геномика» СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8
7Московский городской центр рассеянного склероза при городском госпитале № 11, 127018, Москва, ул. Двинцев, 6
8 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 ’Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991, Москва, ул. Губкина, 3 10Факультет онкологии, отдел биостатистики и биоинформатики, Школа медицины при Университете Джона Хопкинса, 21218, Балтимор, Мэриленд, США "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Москва, 1-й Дорожный пр., 1
12Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3 # Авторы внесли равный вклад в данную работу.
*Е-mail: [email protected] Поступила в редакцию 01.09.2013
РЕФЕРАТ Рассеянный склероз (РС) - хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, поражающее в основном людей молодого и среднего возраста. На сегодняшний день можно с уверенностью сказать, что без активации В-клеточного ответа развитие данной патологии невозможно. Хотя точный механизм, лежащий в основе этиологии РС, неизвестен, многие ученые полагают, что при определенном сочетании генетических и экологических факторов индуктором заболевания может служить вирусная или бактериальная инфекция. В данной работе мы поставили своей задачей с помощью сочетания методов широкомасштабного секвенирования и функционального отбора охарактеризовать поли- и кроссреактивные антитела, способные одновременно узнавать вирусные белки и аутоантигены, инициируя таким образом развитие болезни путем механизма молекулярной мимикрии. Мы обнаружили, что кроссреактивное узнавание двух антигенов, вероятно, обусловлено сочетанием индивидуального узна-
вания легкой и тяжелой цепью своего конкретного антигена. Выявленная высокая структурная гомология исследованных аутоантител с различными противовирусными антителами позволила нам предположить, что в индукции РС главенствующая роль может принадлежать целому ряду патогенов, а не какому-то определенному вирусу.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аутореактивные B-клетки, вирусные триггеры, кроссреактивность, основной белок миелина, рассеянный склероз, широкомасштабное секвенирование.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр; ГЭБ - гематоэнцефалический барьер; ИФА - иммуно-ферментный анализ; МОГ - миелин-олигодендроцитарный гликопротеин; ОБМ - основной белок миелина; LMP-1 (latent membrane protein 1) - латентный мембранный белок 1 вируса Эпштейна-Барр; РС - рассеянный склероз; ЦНС - центральная нервная система; ЦСЖ - цереброспинальная жидкость.
ВВЕДЕНИЕ
Рассеянный склероз (РС) - хроническое воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, поражающее с частотой 3 : 10000 в основном людей молодого и среднего возраста. В мире насчитывается более 2.5 млн больных РС [1]. Таким образом, РС является наиболее распространенной демиелинизирующей нейрово-спалительной патологией, при которой по пока непонятным причинам иммунная система организма начинает разрушать собственные миелиновые оболочки аксонов [2]. Социальный и экономический факторы имеют огромное значение при этом заболевании вследствие тяжелых симптомов, включающих неврит зрительного нерва, потерю контроля функций кишечника и мочевого пузыря, тяжелые параличи, а также большую длительность хронического периода. В 80% случаев развитие заболевания начинается с рецидивно-ремиттирующего течения, которое со временем переходит во вторично-прогрессирующее. Значительно реже, в 20% случаев, РС сразу же принимает первично-прогрессирующую форму [3].
Несмотря на огромное количество работ, посвященных изучению этиологии РС, точная причина развития или потенциальный патоген, способный индуцировать заболевание, остаются неизвестными. Считается, что для развития РС необходимо наличие предрасположенности, т.е. лишь при определенном сочетании генетических и экзогенных факторов возможна хроническая активация иммунных клеток, приводящая к нейрональным повреждениям. Генетический скрининг выявил несколько генов-кандидатов, среди которых наиболее значимым считается локус HLA (human leukocyte antigen) как регион, в наибольшей степени ассоциированный с РС. К сожалению, и здесь не удалось выявить однозначных корреляций, так, например, в Северной Европе исторически выявлена связь развития заболевания с HLA-DR2 или HLA-DRB1*15 [4, 5], а в другой части Европы (например, Сардиния) наибольшую ассоциацию проявили HLA-DRB1*0301, HLA-DRB1*0405 и HLA-DRB1*1303 [6]. Согласно другим данным,
обнаружены и новые гаплотипы (HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*10, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*14 и HLA-DRB1*08), коррелирующие с патологией как отрицательно, так и положительно, но при этом сила эффекта варьировала от случая к случаю [7-10]. Тем не менее однозначно установлено увеличение риска развития РС у родственников больного [11-14], при этом у ближайших родственников риск повышен примерно в 10-25 раз по сравнению с обычной популяционной выборкой. Также выявлена и связь гена CD40 (rs6074022) с РС [15]. Доказательством генетической предрасположенности может служить и значительная генетическая детерминированность индивидуального ответа больных на лечение многими препаратами. Например, фармакогеномные исследования РС обнаружили значимую роль ряда полиморфных вариантов генов (CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1, IL7RA, а также, возможно, TNF и CTLA4) в формировании ответа на прием копаксона [16]. Эпидемиологические исследования, в свою очередь, выявили несколько факторов риска РС, включая бактериальные и вирусные инфекции, климатические условия и курение.
Хотя исходная причина, вызывающая РС, остается неизвестной, при этом заболевании всегда происходят сходные процессы, такие, как активация и увеличение количества иммунных клеток в ЦНС, что в дальнейшем приводит к демиелини-зации, аксональному/нейрональному повреждению и гибели олигодендроцитов - знаковым симптомам РС [17]. Если на начальных этапах изучения РС основную роль в развитии заболевания отводили Т-лимфоцитам, то сейчас можно уверенно сказать, что для развития патологии необходима активация B-клеток. B-лимфоциты не только продуцируют патогенные аутоантитела, но и являются активными антигенпрезентирующими (АПК) и цитокинпродуцирующими клетками [18]. Список потенциальных аутоантигенов при РС постоянно расширяется и включает в себя различные белки, ассоциированные с мембраной олигодендроцитов. Среди них особо выделяют основной белок миели-
на (ОБМ), протеолипидный белок (PLP1) и миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ). Причем в сыворотке больных РС, а также мышей линии SJL с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом - моделью РС, обнаружены даже каталитические антитела к ОБМ, которые не только связывают, но и гидролизуют его [19-21].
Таким образом, выявление чужеродного, к примеру вирусного, антигена, способного индуцировать выработку аутоантител к компонентам миелиновой оболочки, и анализ структуры этих антител могут быть весьма перспективными для понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностике РС.
На сегодняшний день не существует медицинского протокола, позволяющего полностью вылечить больного РС. Наиболее часто при РС применяют бе-таферон, понижающий уровень воспаления в ЦНС [22], и копаксон, также уменьшающий частоту обострений [23]. Создаются вакцины, направленные на элиминацию аутореактивных B-клеток, среди которых наиболее известен уже зарегистрированный препарат - ритуксимаб - моноклональное антитело, неселективно уничтожающее все B-клетки. Существуют также экспериментальные проекты, направленные на специфическую элиминацию [24] или супрессию [25] именно аутореактивных патогенных B-клеток.
В нашей лаборатории ранее была сконструирована фаг-дисплейная библиотека одноцепочечных антител на основе генетического материала больных РС [26]. Был отобран и охарактеризован ряд моноклональных антител, связывающих ОБМ. Для одного из этих антител показана in vitro кроссреактивность между ОБМ и белком LMP-1 (latent membrane protein 1) вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ). В последнее время появился целый ряд работ о возможной вирусной индукции заболевания путем молекулярной мимикрии [27-29], поэтому полученные результаты стали дополнительным доказательством триггерной роли ВЭБ. В представленной работе мы решили прояснить, насколько уникальным является образование кроссреактивных аутоантител к ОБМ и LMP-1. Для этого мы целенаправленно получили кроссреак-тивные клоны путем последовательного обогащения библиотеки на два этих антигена. Проанализировав их структуры и принадлежность к зародышевым семействам, выявили высокое разнообразие подобных кроссреактивных клонов, которые потенциально способны индуцировать РС. Интересно отметить, что большая часть полученных антител обладает высокой гомологией с антителами к белкам других патогенов, что можно рассматривать как расширение списка потенциальных триггеров РС.
экспериментальная часть
Реактивы
Использовали агар, триптон, дрожжевой экстракт (Difco, Великобритания); одно- и двузамещенный фосфат натрия, хлорид натрия, бычий сывороточный альбумин, фракция V (БСА), бромистый эти-дий, ß-меркаптоэтанол (Sigma, США); акриламид, N^N'-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия (ДСН), мочевину, нитроцеллюлозную мембрану Hybond С extra (Amersham, США); поверхностно активное вещество NP40; глицин, изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид (IPTG) (Fermentas, Литва); раствор ТМВ (тетраметилбензидин) (ЗАО «НВО Имму-нотех», Россия), остальные реактивы отечественного производства марки «ос. ч.».
Ферменты
Термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза, щелочная фосфатаза, Rapid DNA Ligation kit (Fermentas, Литва), эндонуклеазы рестрикции и соответствующие стандартные буферные растворы (Fermentas, Литва); дезоксирибонуклеаза I (Biozyme Laboratories Ltd., США); трипсин, лизоцим (Merck, Германия); маркеры размера фрагментов ДНК и молекулярной массы: GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder; GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder, Protein Molecular Weight Marker 14.4-116.0 кДа, Prestained Protein Molecular Weight Marker 19.0-118.0 кДа (Fermentas, Литва); низкомолекулярный маркер 2.5-16.9 кДа (Amersham, США).
Антитела
Антитела к c-myc-эпитопу, продуцируемые гибридо-мой C-MYC; антитела к 3-flag-эпитопу, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США); антитела к белку M13 фаговой оболочки, конъюгированные и неконъюгированные с пероксидазой хрена (GE Heаlthcare, США).
Экспрессия белка и его очистка
Препараты очищенного бычьего ОБМ и рекомбинантного человеческого МОГ (30-147 аминокислотных остатков) были приготовлены согласно ранее опубликованной методике [21]. Рекомбинантный LMP-1 экспрессировали в эукариотических клетках линии HEK293. Клетки HEK293 были трансфицированы плазмидой pBudCE1.4/EF/LMP1-FLAG-His-Strep с использованием унифектина-56. Клетки лизиро-вали в буфере RIPA с добавлением 1 М мочевины и коктейля ингибиторов (Roche, Германия) в течение ночи при постоянном перемешивании при 4°С. LMP-1 очистили из лизата с использованием агарозы antiFLAG согласно методике. N- и С-концевые домены
LMP-1 очищали методом аффинной хроматографии на смоле Talon (Clontech, США), а затем с помощью MonoQ-сефарозы (Amersham).
Обогащение библиотеки
Фаг-дисплейная библиотека одноцепочечных антител, полученная из лимфоцитов периферической крови больных РС, описана ранее [26]. Oбо-гащение проводили согласно методике (Tomlison protocol; Source BioScience, http://www.lifesciences. sourcebioscience.com) с небольшими модификациями. На иммунотюбы (Immuno Tubes maxisorp, Nunc, Германия) сорбировали 1G мкг/мл антигена ^БМ, МOГ, LMP-1) в карбонатном буфере (pH 9.2). Проводили два раунда обогащения на каждый антиген. Два дополнительных раунда с использованием OБМ в качестве антигена были проведены в случае двойного обогащения на LMP-1/OБМ.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Антиген, разведенный в G.1 М карбонатном буфере до концентрации 5 мкг/мл, сорбировали на поли-стироловых планшетах (MaxiSorp, Дания) в течение ночи при 4°С. На следующий день после удаления антигена лунки промывали З раза буфером ФСБ с G.1% Tween 2G. Участки неспецифического связывания блокировали 3% раствором БСА в ФСБ, pH 7.2 (37°С, 1 ч). После этого лунки снова промывали трижды буфером ФСБ с G.1% Tween 2G, а затем инкубировали в течение 1 ч при 37°С с реагентами второго слоя в буфере ФСБ с G.1% Tween 2G. После каждой инкубации проводили отмывку трижды буфером ФСБ с G.1% Tween 2G. Антитела последнего слоя были конъюгированы с пероксидазой хрена. Проявление проводили фирменным реагентом TMB (ЗАO «НВO Иммунотех»), реакцию останавливали 1G% H3PO4. Oптическую плотность (OD45G) измеряли с помощью прибора Varioscan Flash microplate reader (Thermo Scientific, США).
Широкомасштабное секвенирование генов вариабельных участков VH/VL из фаг-дисплейных библиотек
Начальная фаг-дисплейная библиотека РС и четыре подбиблиотеки, обогащенные на разные антигены ^БМ, МOГ, LMP-1, двойное обогащение LMP-1/OБМ), были амплифицированы в клетках TG-1 Escherichia coli. ПЦР проводили с использованием Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase (Fermentas). Реакционная смесь содержала 5 нг плазмиды ДНК в качестве матрицы и 1G пмоль фланкирующих праймеров. ПЦР-продукты были очищены с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, США) и лигированы с адап-
торами NEBNext Multiplex Oligos (New England Biolabs, Великобритания) с использованием NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs). После приготовления образцов библиотеки были проанализированы с помощью Qubit (In-vitrogen) - количественно и 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) - качественно. На основе обсчетов библиотеки нормировали до концентрации 10 нМ и смешивали в эквимолярном соотношении. Амплификацию образцов проводили в соответствии с протоколом (Illumina) с использованием MiSeq с Reagent Kit v2 (2 X 250). Объединение и приведение в соответствие друг с другом связанных прочтений было сделано на базе GW CLC Bio. Характеристики антител определяли непосредственно после широкомасштабного секвенирования с использованием онлайн-ресурса IMGT/HighV-QUEST [30].
Параметры фильтров для анализа встречаемости гипервариабельных участков
Результаты выравнивания последовательностей, полученных методом широкомасштабного секве-нирования, после анализа с помощью программы IMGT/V-QuEST [31] были отфильтрованы по следующим критериям: поле «Functionality» выравнивания должно быть «productive» (последовательность антитела должна быть оценена программой как продуктивная); идентичность аллелей V-гена и зародышевого сегмента из базы IMGT должна быть не меньше 70%; в расчет не брали последовательности легких цепей, идентифицированных программой IMGT/V-QuEST как тяжелые цепи.
результаты и обсуждение
В ходе данной работы мы проанализировали представленность и структуру антител, отобранных на основные аутоантигены РС - ОБМ и МОГ, а также на вирусный белок LMP-1, для которого ранее нами была показана потенциально возможная триггерная роль при РС [26]. С этой целью мы провели по два раунда обогащения на МОГ и LMP-1 (на ОБМ обогащение проведено ранее [26]), для поиска кросс-реактивных антител - последовательно два раунда биопэннинга на LMP-1, а затем два раунда на ОБМ. Все обогащения проводили под контролем поликлонального ИФА. После селекции проанализировали полученные одноцепочечные антитела в составе фаговых частиц методом моноклонального ИФА. Клон считали положительным, если его сигнал на связывание с одним или двумя антигенами в ИФА превышал минимум в 3 раза сигнал бактериофага M13K07, используемого в качестве отрицательного контроля (в титре 1013 фаговых частиц/лунку). Результаты ИФА для наиболее перспективных клонов, способ-
<
е
х
с
га
I
!_
У
и
1.S-
0.8
0.6
0.4
0.2
10°|10"
а1
III
1
ОБМ
LMP-1
ь
llil
10"[l0" юНю” 10”|l0” 10’*| 10“ 10“|l0” 10u| 10’* lclio“ 10"|l0" loHlO” 10»|10” loH 10" lO'^lO” 10H10"
dl hi c2 d2 g2 аб b7 dlO elO gio cl2 ТГ-АТ ml3
Рис. 1. Моноклональный фаговый ИФА связывания полученных антител с ОБМ (зеленые столбцы) и LMP-1 (фиолетовые столбцы). В качестве отрицательного контроля использовали бактериофаг M13K07 ^13) и бактериофаг, экспонирующий на своей поверхности одноцепочечное антитело, специфичное к тиреоглобулину(ТГ-АТ)
Фаговые клоны и их концентрация, кол-во фаговых частиц в лунке
ных связывать и ОБМ, и LMP-1, приведены на рис. 1. Способность данных фаговых клонов связывать оба антигена подтверждена путем проведения не менее трех независимых ИФА.
В результате было отобрано несколько фаговых клонов, несущих одноцепочечные антитела, которые наиболее эффективно связывали LMP-1 или LMP-1/ОБМ. В таблице приведены данные по относительной силе связывания фаговых клонов с исследуемыми антигенами, а также аминокислотные последовательности их гипервариабельных участков и принадлежность к зародышевым семействам. Сравнивая структуры полученных одноцепочечных антител, можно отметить несколько интересных закономерностей: (1) множественный отбор отдельных легких цепей как на LMP-1, так и на два антигена; (2) встречаемость одинаковых легких цепей как в свободном виде, так и в составе одноцепочечных антител - клоны с12 и Ь3 LL, g3 LL, d4 LL. Селекция определенных легких цепей как в свободном виде при отборе на LMP-1 (Ь3 LL, g3 LL, d4 LL), так и в составе одноцепочечных антител при получении кроссреактивных клонов (с12) может свидетельствовать об их важной роли в связывании LMP-1, который мы использовали в качестве первого антигена при двойном отборе. В то же время для дальнейшего связывания ОБМ, вероятно, необходима уже их комбинация с тяжелой цепью, т.е. в данном случае связывание с двумя антигенами и потенциальная кроссреактивность определяются узнаванием свое-
го антигена тяжелой и легкой цепью по отдельности. Интересно и то, что относительная сила связывания анти^МР-1-антител со своим антигеном значительно превышает относительную силу связывания с обоими антигенами потенциально кроссреактивных анти-LMP-l/-анти-ОБМ-антител (таблица). Эти наблюдения могут отражать природную ситуацию, происходящую при развитии РС, когда первично образованные антитела на какой-либо патоген (в частности, ВЭБ) в дальнейшем могут при попадании в ЦНС (при наличии поврежденного гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)) взаимодействовать с ОБМ, вызывая деградацию миелиновой оболочки. По-видимому, способность таких антител к потенциальной полиреактивности, пусть и при слабом связывании, предпочтительней высокой специфичности с сильной аффинностью.
Поиск гомологов отобранных моноклональных антител проводили по аминокислотным последовательностям с помощью баз данных Protein Data Bank proteins (pdb), UniProtKB/Swiss-Prot (swissprot) и программы protein BLAST. На рис. 2 и 3 представлены данные по относительной гомологии между структурами полученных нами антител и иммуноглобулинами, специфичными к белкам различных вирусов и бактерий. Выявлен высокий уровень сходства полученных антител с целым рядом патоген-специфических антител (против вируса гриппа, вируса лихорадки Западного Нила, вируса бешенства, ротавируса, пневмококка, стрептококка и др.)
ТОМ 5 № 4 (19) 2013 | АСТА NATURAE 1109
Одноцепочечные антитела, отобранные после двух раундов фагового дисплея на соответствующие антигены
Отбор на LMP-1 / ОБМ Связывание с LMP-1 Связывание с ОБМ
Клон vh Dh Jh H-CDR3 vL JL L-CDR3
Ь7 IGHVl-2*04 IGHD1-26*01 IGHJ4*02 VRGSTYSPSGYFEY IGKV5-2*01 IGKJ2*01 LQHDNFP + + +
glO IGHV1-3*01 IGHD6-13*01 IGHJ4*02 ARIFEGLSGIAAPFDY IGKV4-1*01 IGKJ4*01 QQYFSSPLT +
hl IGHV1-8*01 IGHD4-17*01 IGHJ6*03 AREVSDYSDYGDVYYMDV IGKV3-20*01 IGKJ5*01 QQYCCSPIT
ell IGHV1-8*01 IGHD4-17*01 IGHJ6*03 AREVSDYSDYGDVYYMDV IGLV1-44*01 IGLJ3*02 AAWDGSLNGP
hll IGHV1-18*04 IGHD3-3*02 IGHJ2*01 ARREEGLYTTSPGYFGV IGLV3-21*03 IGLJ7*02 RVWDKQTVSRSG +
el2 IGHV1-46*01 IGHD4-11*01 IGHJ6*02 ARRGFDY IGKV1-33*01 IGKJ1*01 LQFYEFPYT
cil IGHVl-46*03 IGHD5-12*01 IGHJ6*03 AKDLRPRDIGDMDV IGKV1-39*01 IGKJ5*01 QQSYSSP +
cl2 IGHVl-69*06 IGHD1-26*01 IGHJ6*02 ARCGILRSHYFYGMDV IGLV1-47*01 IGLJ7*01 AAWDDSLSG +
a6 IGHV3-7*01 IGHD4-11*01 IGHJ6*02 VRGGLGAGADY IGLV4-69*01 IGLJ7*01 QTWGTGI + + +
c3 IGHV4-b*01 IGHD2-21*01 IGHJ5*01 AGLTQSSHNDAN IGKV2-30*01 IGKJ1*01 MQATHWP +
fil (=el LL) - - - - IGLV1-47*01 IGLJ3*02 VAWDDNLSG
c2 - - - - IGLV3-1*01 IGLJ7*01 AAWDDSLNGPV
dl - - - - IGLV6-57*01 IGLJ7*01 QSYNTSTLI
al - - - - IGLV10-54*01 IGLJ3*02 SVWDSSLSA
Отбор на LMP-1
h4 LL IGHV3-23*01 IGHD6-13*01 IGHJ2*01 AKDIAAAATTPEY IGKV3-11*01 IGKJ5*01 QQRSNWPPT +++ H.O.
cl2 LL IGHV5-51*01 IGHD4-17*01 IGHJ4*03 ARFYDSTGSCDY IGKV1D-33*01 IGKJ2*02 SIIQXKFPLXC +++ H.O.
d4 LL, g3 LL, b3 LL - - - - IGLV1-47*01 IGLJ7*01 AAWDDSLSG +++ H.O.
el LL (=f 11) - - - - IGLV1-47*01 IGLJ3*02 VAWDDNLSG +++ H.O.
d2 LL (=al) - - - - IGLV10-54*01 IGLJ3*02 SVWDSSLSA +++ H.O.
Примечание. LL в названии клона обозначает, что клон отобран на LMP-1. Относительное связывание с антигенами рассчитывали как отношение сигнала ИФА связывания с антигеном определенного фагового клона к сигналу отрицательного контроля М13К.07, ± - превышение над фоном в 1.5 и более раза; Н— превышение в 3 раза; -Н— превышение в 6 раз; +-Н— превышение в 9 и более раз. Описанные клоны показывали статистически значимое связывание с антигенами минимум в трех независимых экспериментах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
с3
— anii-streplococcal polyglycerol phosphate anti-EBV LMP-1
- anti-DNA
— h4 LL — a6
____і- anti-pneumococcal
L_ anti-pneumococcal
- anti-rabies
—anti-pneumococcal
e12
— hi
-anti-vaccinia virus
- cross-reaction complex
-anti-HIV-1 gp120 anti-pneumococcal capsular polysaccharide ■“ti-SARS-CoV nudeocapsid protein
c12
С anti-rabies anti-rabies
-------------anti-HIV-1 V3
anti-SARS S protein - anti-SARS S protein --------anti-HIV-1 CD4bs
hii
- anti-vaccinia virus
— eii
-anti-influenza
-----yiu
anti-HBV core і— anti-hepatiti: "^anti-Echinococi
anti-streptococcal /anti-lysoganglioside g10
¡-hepatitis C virus E2 protein ^anti-Echinococcus granulosus antigen -anti-EBV LMP-1 -----anti-pneumococcal
---------b7
___ranti-HIV-1 gp120
i—anti-HIV-1 gp120 rotavirus-specific anti-rabies anti-rabies anti-rabies anti-rabies anti-rabies
- anti-vaccinia virus
—rotavirus-specific
- rotavirus-specific
cii
rotavirus-specific anti-hepatitis B surface antigen rotavirus-specific rotavirus-specific rotavirus-specific rotavirus-specific rotavirus-specific rotavirus-specific rotavirus-specific rotavirus-specific
Рис. 2. Г омология тяжелых цепей отобранных антител с противовирусными антителами, известными из опубликованных данных (базы данных Protein Data Bank proteins (pdb), UniProtKB/SwissProt (swissprot). Жирным отмечены антитела, отобранные в данной работе
как для тяжелой, так и для легкой цепей. Можно отметить высокий уровень структурного сходства полученных антител с антителами из ЦСЖ РС, анти-МОГ, анти-CD152 (антиген 4 цитотоксических лимфоцитов), антителами к белку Бенс-Джонса. Крайне интересны данные по близости структур тяжелых цепей кроссреактивных антител с3 и анти^МР-1-антитела ^Ь|ЛВЛ55010.1 - гомология 91%), а также кроссреак-тивного g10 и анти^МР-1-антитела ^Ь|ЛВЛ55014.1 -гомология 86%), что косвенно подтверждает корректность отбора антител из фаговой библиотеки. Среди легких цепей высокая гомология антитела Ь7 и МОГ-специфичного антитела (gb|ЛЛY15116.1 - гомология 90%) может свидетельствовать о полиреактивности отобранного антитела, а сходство а6 и антитела из ЦСЖ больного РС (gb|ЛЛS21063.1 - гомология 94%) может косвенно подтверждать аутоиммунную
природу отобранного нами антитела. На наш взгляд, высокая провирусная гомология антител, способных связывать ОБМ, потенциально указывает на то, что первичной мишенью для этих антител могут служить многие вирусные белки. Таким образом, для запуска РС и активации патогенных В-клеток, наряду с генетическими и экологическими факторами, необходимо наличие не определенного экзогенного патогена, а его способность, проникая в ЦНС, увлекать за собой клетки иммунной системы, что в итоге приводит к их «множественной и беспорядочной» активации. То есть антителосекретирующие клетки, активированные еще на периферии в лимфатических узлах, мигрируют через поврежденный ГЭБ. Таким образом, первичные антитела к вирусным антигенам начинают взаимодействовать с собственными кроссреактивными аутоантигенами в ЦНС, вызывая
г£
- anti-tetanus toxoid
—anti-pneumococcal b7
— an"-ygS.nNA
77 '-anti-dsDNA e12
—anti-cucumber mosaic virus
-Bence Jones protein
-anti-influeneza Hemagglutinin
■S
a6
CSF mAb MS d1
Tanti:HIV-1 V3
I----------anu-ni
\____r— anti-rabies
L-anti-rabies
-Bence Jones protein a1
-ami-jnflugneza Hemagglutinin
rotavirus-specific e1 LL f11
Рис. 3. Гомология легких цепей отобранных антител с противовирусными антителами, известными из опубликованных данных (базы данных Protein Data Bank proteins (pdb), UniProtKB/ Swiss-Prot (swissprot). Жирным шрифтом отмечены антитела, отобранные в данной работе
“*anti-DNA -anti-HIV-1 V3 -anti-HIV-1 V3
- anti-streptococcal/anti-myosin
I—anti-HlV-1 Gp41 ectodomain
H Lanti-rabies
----d4 LL
- c12
,—rotavirus-specific
МЖГ1
Lrntauirus-snecifir.
L rotavirus-specific
------anti-rabies
-anti-rabies -antirr.abies janti-influeneza 1 anti-influeneza e11
Hemagglutinin
Hemagglutinin
1-----anti-rabies
—anli-rabies —.anti-West Nile virus anti-rabies anti-rabies, anti-rabies
,!■ 2 HIV • G;I
I L rot; Ц-anti-V L-anti-i anti-i
anti-rabies
rotavirus-specific rotavirus-specific West Nile virus
....i-West Nile virus
anti-influeneza A ---anti-West Nilgais
-I 'anti-ebolavSis
'anti-ebolavirus glycoprotein
^an^-r№S^/A28
-anti-MOG
anti-tejtanus toxoid anti-vaccinia virus vaccinia virus
,___vaccinia virus
anti-rabies c3
,_l—anti-tet
P---------anti
—jlj---------anti-v
~------3nti-va
'—anti-ranÍP!
u_
Írota
rnta\
—anti-rabies —anti-rabies .
_i—anti-vaccinia virus “t-anti-DNA .anti-rabies Panti-rabies —TVanti-rabies anti-rabies 1—anti-rabies —anti-rabies anti-rabies anti-rabies anti-rabies anti-rabies..
rotavirus-specific rotavirus-specific
—Lanti-rabies anti~rabies c11 g2
anti-HAV capsid Lanti-vaccinia virus
anti-pneumococcal capsular polysaccharide
ОБМ - РС
МОГ - РС
LMP-1 - РС
LMP-1/ОБМ - РС
Q.
£
РС
РС
РС
РС
Рис. 4. Сравнение встречаемости CDR3 тяжелых цепей в обогащенных библиотеках по сравнению с исходной библиотекой РС. На представленных точечных диаграммах каждая точка обозначает CDR3 с определенной последовательностью; по оси X отложено количество прочтений для этого CDR3 в библиотеке РС, а по оси Y -в соответствующей обогащенной библиотеке. Для каждой пары РС-отбора проведен регрессионный анализ, отмечены точки выброса с помощью пакета 'саг' языка R (помечены красным). Также на графиках отмечены экспериментально исследованные клоны, отобранные с помощью моноклонального фагового ИФА (зеленый цвет с указанием индивидуальной маркировки, приведенной в таблице). Указаны последовательности CDR3 наиболее интересных клонов
локальные воспаления и в дальнейшем развитие заболевания.
Для оценки результатов отбора антител на выбранные антигены проведено широкомасштабное секвенирование обогащенных библиотек. С использованием оборудования Illumina MiSeq определено около 100 000 последовательностей из каждой библиотеки (по 50000 для тяжелых и легких цепей). Далее был проведен анализ отобранных антител по встречаемости CDR3 для тяжелых и легких цепей, а также определены относительные заряды наиболее эффективно отобранных CDR3. Для этого полученные в результате широкомасштабного сек-венирования последовательности были выровнены с последовательностями антител из базы данных IMGT [32] с помощью программы IMGT/V-QUEST
[31], а затем результаты выравниваний были отфильтрованы для избавления от артефактов. В дальнейшем анализировали только отфильтрованные результаты секвенирования. Сравнительному анализу подвергали представленность различных CDR3 в обогащенных библиотеках по сравнению с начальной библиотекой РС, считая мерой представленности CDR3 общее число последовательностей, несущих этот CDR3 (рис. 4, 5). На рис. 4, 5 отображена и представленность CDR3-антител, полученных с помощью функционального отбора (таблица). Точки выброса, находящиеся выше регрессионной линии, соответствуют положительному отбору на данный CDR3 (он значительно преобладает в этом отборе по сравнению с остальными CDR3), а точки выброса ниже этой линии - отрицательному
ОБМ - РС
МОГ - РС
LMP-1 - РС
LMP-1/ОБМ - РС
еК* 612#
§■ |. КУУЕРМТ/
/ §- /
£ ш О I— о 8 § /
1- / !■ /
/ §. о 2_
.У.
о • 1 о - ;
о.
100 200 300 «0 600
РС
100 200 300 400 500
РС
РС
РС
Рис. 5. Сравнение встречаемости CDR3 легких цепей в обогащенных библиотеках по сравнению с исходной библиотекой РС. На представленных точечных диаграммах каждая точка обозначает CDR3 с определенной последовательностью; по оси X отложено количество прочтений для этого CDR3 в библиотеке РС, а по оси Y -в соответствующей обогащенной библиотеке. Для каждой пары РС-отбора проведен регрессионный анализ и отмечены точки выброса с помощью пакета 'саг' языка R (помечены красным). На графиках отмечены экспериментально исследованные клоны, отобранные с помощью моноклонального фагового ИФА (зеленый цвет с указанием индивидуальной маркировки, приведенной в таблице). Указаны последовательности CDR3 наиболее интересных клонов
отбору на них. Нас, в первую очередь, интересовали положительные выбросы, так как они были первыми кандидатами на функционально значимые CDR3 в каждом отборе. Как и ожидалось, среди распространенных (по количеству встречаемости) CDR3 преобладает большая часть клонов, выбранных после функционального отбора с помощью моноклонального фагового ИФА. Причем видно, что клоны Ы и е11 имеют CDR3 тяжелой цепи с повышенной полиреактивностью, так как частота его встречаемости увеличена во всех четырех обогащенных библиотеках по сравнению с исходной. А CDR3 клона 1t.11 амплифицировался в библиотеках ОБМ, LMP-1, LMP-l/ОБМ, что может характеризовать его как часть кроссреактивного паратопа для двух общих эпитопов именно у ОБМ и LMP-l. С другой стороны, довольно интересной представляется ситуа-
ция, когда по анализу встречаемости H-CDR3 явный отбор по связыванию ОБМ и LMP-l прошла последовательность ARGATSTRLLSRRGHAFDV, но методом моноклонального фагового ИФА мы не получили ни одного антитела с таким CDR3. Возможным объяснением может служить ограниченное число клонов, анализируемое при фаговом ИФА. Подобная ситуация может возникнуть и в результате невысокой аффинности конкретного фагового клона к двум антигенам в формате моноклонального ИФА (низкий сигнал при ИФА), в результате чего данный клон не был выбран для дальнейшего анализа. Однако в действительности он количественно прошел отбор на два антигена. В любом случае дальнейший анализ клонов с подобными гипервариабельны-ми участками может помочь прояснить проблему кроссреактивности. Среди легких цепей потенци-
Рис. 6. Распределение суммарного заряда CDR3 в библиотеках, обогащенных на разные антигены для тяжелых (А) и легких (Б) цепей
альной повышенной кроссреактивностью между ОБМ и МОГ обладал СDR3 клона е12. При этом он был эффективно отобран и в библиотеке LMP-l/ ОБМ после обогащения на ОБМ, хотя при обогащении на LMP-l не наблюдалось эффективного отбора на данный СDR3.
Взаимодействие двух белков во многом обусловлено наличием заряда в области их соприкосновения. Так как у антитела наибольшую роль в формировании сайта связывания играет СDR3, мы решили оценить вклад электростатических взаимодействий данного региона в специфичность связывания при отборе на разные антигены, а также в отборе кросс-реактивных клонов. С этой целью мы определили частоту встречаемости СDR3 с разными зарядами для тяжелых и легких цепей (рис. 6), учитывая количество прочтений для каждой последовательности. Можно отметить, что в библиотеке, обогащенной на МОГ, практически на треть уменьшилось количество нейтрально заряженных СDR3 тяжелых цепей и в 7 раз увеличилось количество СDR3 с суммарным высоким отрицательным зарядом (-4 и больше) во многом за счет сокращения положительного заряда (+1). В отборе на остальные антигены наблюдается смещение суммарного заряда в высокозаряженные области как положительные (+4), так и отрицательные (-4). Для легких цепей в основном наблюдается уменьшение количества нейтрально заря-
женных и увеличение слабоотрицательных СDR3 (-1 - у ОБМ, МОГ, двойного обогащения LMP-l/ОБМ и -1-2 у LMP-l). Из этих данных можно сделать вывод, что хотя изначально в библиотеке антител больных РС (РС на рис. 6), в некоторой степени отражающей распределение антител в организме больного, преобладают и иммуноглобулины с нейтральными СDR3, тенденцию к проявлению аутореактивности в основном имеют антитела с заряженными остатками в антигенсвязывающих центрах. Причем у тяжелых цепей по сравнению с легкими наблюдается большее смещение заряда в крайние области по модулю - как в положительную, так и в отрицательную стороны. Это может свидетельствовать о более активном участии тяжелой цепи в формировании сайта связывания.
ВЫВОДЫ
В настоящей работе получены панель антител к ряду аутоантигенов при РС, а также набор кросс-реактивных антител, связывающих как белок вируса Эпштейна-Барр, так и структурный элемент миелиновой оболочки - ОБМ. Высокая гомология антител, полученных к выбранным аутоантигенам и патогенам вирусной и бактериальной природы, может свидетельствовать об участии целого ряда вирусов в развитии РС. Полиреактивность аутоантител при РС может реализовываться за счет сочетания
двух цепей - тяжелой и легкой, каждая из которых в большей степени отвечает за связывание своего антигена. В случае последовательного отбора на LMP-1 и ОБМ, проведенного в данной работе, за связывание с LMP-1, более вероятно, отвечает легкая цепь антитела, тогда как комбинация с тяжелой цепью приводит к формированию полноценного кроссреактивно-го антитела, связывающего как LMP-1, так и ОБМ. Для аутоантител, специфичных к исследованным аутоантигенам РС - ОБМ, МОГ и потенциальному вирусному триггеру РС - LMP-1, характерно увеличение заряженных CDR3. •
Работа поддержана РФФИ (гранты № 12-04-01609-а, 12-04-33258, 12-04-92428-ЕМБЛ-а, 13-04-40277-Н, 09-04-12128-офи_м), грантом фонда «Сколково» «Персонализированная терапия аутоиммунных заболеваний и рака», программами Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и № 27 «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов», НШ-2046.2012.4, стипендией Президента РФ (СП 2445.2013.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hauser S.L., Oksenberg J.R. // Neuron. 2006. V. 52. № 1.
P. 61-76.
2. Hemmer B., Nessler S., Zhou D., Kieseier B., Hartung H.P // Nat. Сііп. Practice Neurol. 2006. V. 2. № 4. P 201-211.
3. Compston A., Coles A. // Lancet. 2008. V. 372. № 9648.
P. 1502-1517.
4. Jersild C., Fog Т., Hansen G.S., Thomsen M., Svejgaard A., Dupont B. // Lancet. 1973. V. 2. № 7840. P. 1221-1225.
5. Barcellos L.F., Oksenberg J.R., Begovich A.B., Martin E.R., Schmidt S., Vittinghoff E., Goodin D.S., Pelletier D., Lincoln R.R., Bucher P., et al. // Am. J. Hum. Genet. 2003. V. 72. № 3.
P. 710-716.
6. Marrosu M.G., Murru R., Murru M.R., Costa G., Zavattari P, Whalen M., Cocco E., Mancosu C., Schirru L., Solla E., et al. // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. № 25. P. 2907-2916.
7. Dyment D.A., Herrera B.M., Cader M.Z., Willer C.J., Lincoln M.R., Sadovnick A.D., Risch N., Ebers G.C. // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. № 14. P. 2019-2026.
8. Masterman Т., Ligers A., Olsson Т., Andersson M., Olerup O., Hillert J. // Ann. Neurol. 2000. V. 48. № 2. P 211-219.
9. Barcellos L.F., Sawcer S., Ramsay PP, Baranzini S.E., Thomson G., Briggs F., Cree B.C., Begovich A.B., Villoslada P., Montalban X., et al. // Hum. Mol. Genet. 2006. V. 15. № 18.
P. 2813-2824.
10. Ramagopalan S.V., Morris A.P., Dyment D.A., Herrera B.M., DeLuca G.C., Lincoln M.R., Orton S.M., Chao M.J., Sadovnick A.D., Ebers G.C. // PLoS Genet. 2007. V. 3. № 9. P. 1607-1613.
11. Robertson N.P., Fraser M., Deans J., Clayton D., Walker N., Compston D.A. // Brain. 1996. V. 119. Pt 2. P. 449-455.
12. Sadovnick A.D., Baird P.A., Ward R.H. // Am. J. Med. Genet. 1988. V. 29. № 3. P. 533-541.
13. Willer C.J., Dyment D.A., Risch N.J., Sadovnick A.D., Ebers G.C., Canadian Collaborative Study G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 22. P 12877-12882.
14. Ebers G.C., Sadovnick A.D., Dyment D.A., Yee I.M., Willer
C.J., Risch N. // Lancet. 2004. V. 363. № 9423. P. 1773-1774.
15. Sokolova E.A., Malkova N.A., Korobko D.S., Rozhdestvenskii
A.S., Kakulya A.V., Khanokh E.V., Delov R.A., Platonov F.A., Popova T.Y., Aref'eva E.G., et al. // PLoS One. 2013. V. 8. № 4.
P e61032.
16. Царева Е.Ю., Кулакова О.Г., Макарычева О.Ю., Бойко А.Н., Щур С.Г., Лащ Н.Ю., Попова Н.Ф., Гусев Е.И., Башинская
B.В., Львов Д.В. и др. // Мол. биол. 2011. Т. 45. № 6. С. 963-972.
17. Yong V.W., Marks S. // Neurology. 2010. V. 74. Suppl 1.
P. S9-S16.
18. Lund F.E., Randall T.D. // Nat. Rev. Immunol. 2010. V. 10.
№ 4. P. 236-247.
19. Ponomarenko N.A., Durova O.M., Vorobiev I.I.,
Aleksandrova E.S., Telegin G.B., Chamborant O.G., Sidorik L.L., Suchkov S.V., Alekberova Z.S., Gnuchev N.V., et al. // J. Immunol. Meth. 2002. V. 269. № 1-2. P 197-211.
20. Ponomarenko N.A., Durova O.M., Vorobiev I.I., Belogurov A.A., Telegin G.B., Suchkov S.V., Misikov V.K., Morse H.C., Gabibov A.G. // Immunol. Lett. 2006. V. 103. № 1. P. 45-50.
21. Ponomarenko N.A., Durova O.M., Vorobiev I.I., Belogurov A.A. Jr., Kurkova I.N., Petrenko A.G., Telegin G.B., Suchkov
S.V., Kiselev S.L., Lagarkova M.A., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 2. P 281-286.
22. Paty D.W., Li D.K. // Neurology. 1993. V. 43. № 4. P. 662-667.
23. Sela M. // Rejuvenation Res. 2006. V. 9. № 1. P 126-133.
24. Stepanov A.V., Belogurov A.A. Jr., Ponomarenko N.A., Stremovskiy O.A., Kozlov L.V., Bichucher A.M., Dmitriev S.E., Smirnov I.V., Shamborant O.G., Balabashin D.S., et al. // PLoS One. 2011. V. 6. № 6. P. e20991.
25. Belogurov A.A. Jr., Stepanov A.V., Smirnov I.V., Melamed
D., Bacon A., Mamedov A.E., Boitsov V.M., Sashchenko L.P., Ponomarenko N.A., Sharanova S.N., et al. // FASEB J. 2013.
V. 27. № 1. P 222-231.
26. Gabibov A.G., Belogurov A.A. Jr., Lomakin Y.A., Zakharova M.Y., Avakyan M.E., Dubrovskaya V.V., Smirnov I.V., Ivanov A.S., Molnar A.A., Gurtsevitch V.E., et al. // FASEB J. 2011.
V. 25. № 12. P 4211-4221.
27. Wekerle H., Hohlfeld R. // N. Eng. J. Med. 2003. V. 349. № 2.
P. 185-186.
28. Lunemann J.D., Jelcic I., Roberts S., Lutterotti A., Tackenberg B., Martin R., Munz C. // J. Exp. Med. 2008. V. 205. № 8. P. 1763-1773.
29. Chastain E.M., Miller S.D. // Immunol. Rev. 2012. V. 245. № 1. P. 227-238.
30. Alamyar E., Giudicelli V., Li S., Duroux P, Lefranc M.P // Immunome Res. 2012. V. 8. № 1. P. 26.
31. Brochet X., Lefranc M.P., Giudicelli V. // Nucl. Acids Res. 2008. V. 36. P. W503-508.
32. Lefranc M.P., Giudicelli V., Ginestoux C., Jabado-Michaloud J., Folch G., Bellahcene F., Wu Y., Gemrot E., Brochet X., Lane J., et al. // Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. P D1006-1012.
