Полинуклеотидные индукторы интерферона как объект молекулярной биофизики Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.323:543.253:615.275.4 А. Л. Тимковский**

Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 1

ПОЛИ НУКЛЕОТИДНЫЕ ИНДУКТОРЫ ИНТЕРФЕРОНА КАК ОБЪЕКТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОФИЗИКИ

Одним из направлений борьбы с вирусными инфекциями является, наряду с вакцино-профилактикой и химиотерапией, использование системы интерферона (ИФН). К сожалению, это направление в настоящее время используется недостаточно. Как хорошо известно, использование системы ИФН может быть двояким. Полученный вне организма очищенный и концентрированный ИФН («экзогенный» ИФН) может применяться в клинике как терапевтическое средство для введения пациентам в острой фазе вирусного заболевания. Но можно применять вещества (индукторы ИФН), вызывающие при введении в организм образование и секрецию в кровоток собственного, «эндогенного» ИФН. Воздействие ИФН на специфические рецепторы клеток организма приводит к синтезу в клетках нескольких «антивирусных белков», блокирующих этапы вирусной транскрипции и трансляции при заражении клеток вирусом и обеспечивающих профилактическую защиту клеток и организма от вирусной инфекции на срок не менее 7-10 дней. Поэтому повторное введение индукторов в организм позволяет длительное время поддерживать в нем состояние противовирусной резистентности. Как сам ИФН, так и его индукторы имеют чрезвычайно широкую специфичность действия в отношении вирусных инфекций и могут применяться при отсутствии точных сведений о типе или штамме вируса.

Среди индукторов ИФН разных типов и классов выделяются природные и биосинтетические двунитевые РНК (днРНК), которые обладают также иммуномодулирующей, противоопухолевой и радиозащитной активностью [I, 2]. При этом дуплексы синтетических го-мополирибонуклеотидов более предпочтительны, так как они не содержат генетической информации и могут быть получены в промышленных количествах ферментативным синтезом, не требующим переработки огромных количеств биомассы и утилизации больших объемов органических жидкостей. Однако для дуплексов комплементарных гомополимеров свойственны специфические структурные особенности, концептуальному рассмотрению которых посвящена данная статья.

В табл. 1 приведены основные сведения о разработке, специфике действия и медицинском применении природных и биосинтетических днРНК. Среди дуплексов комплементарных гомогюлирибонуклеотидов выделяют три базовых типа - дуплексы полирибоинозината (поли(И)) и полирибогуанилата (поли(Г)) с полирибоцитидилатом (поли(Ц)), а также дуплекс полирибоаденилата (поли(А)) с полирибоуридилатом (поли(У)). Искусственно объединенные для наглядности пары комплементарных нуклеотидов этих дуплексов представлены на рис. 1. До середины 1990-х годов интенсивно проводились разносторонние испытания полинуклеотидных индукторов ИФН. Основные типы их биологической активности (сходные с активностью других днРНК) представлены в табл. 1. Однако парадоксальность ситуации заключалась в том, что при сопоставлении дуплексов различного нуклеотидного состава преобладала достаточно примитивная феноменология и слишком мало внимания уделялось структурным особенностям полинуклеотидных препаратов. Большинство исследователей удовлетворились тем, что дуплекс поли(И)-поли(Ц) обладал наибольшей активностью, и в подавляющем количестве работ использовался именно он, несмотря на сразу же обнаруженную его высокую токсичность. Некоторые надежды возлагались на дуплекс

Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН, г. Гатчина Ленинградской обл.

© А. Л. Тимковский, 2007

поли(Г) ■ поли(Ц), однако попытки разработать стандартную методику его получения были неудачными. В итоге возобладало мнение о том, что значительная токсичность дуплекса поли(И)-поли(Ц) свидетельствует о существовании однозначной корреляции между активностью и токсичностью этих соединений. И хотя некоторые авторы склонялись к тому, что активность полинуклеотидных индукторов ИФН, независимо от нуклеотидного состава, определяется пространственной геометрией участка дуплекса достаточно протяженного размера [1], практически не было попыток объяснить структурными особенностями разницу в активности полинуклеотидных препаратов и пытаться повысить их активность до некоторого стандартного уровня, за исключением работ Де Клерка (Бе С1егсц) по термоактивации некоторых дуплексов [3 и др.]. Токсичность же поли(И)-поли(Ц) привела сначала к резким ограничениям в его клиническом применении, а затем и вообще к утрате интереса к этому виду препаратов.

Таблица 1. Применение природных и синтетических двунитевых РНК в биомедицинских исследованиях

Природные:

репликативная форма РНК амбер-мутанта фага £2 (MS2) («Ларифан»), препарат клинического применения

(J. Doskocil - Чехия; Г. Фелдмане - Латвия),

вирионная днРНК фага фб («Рифастин)

(W. J. Kleinschmidt - США; Л. В. Сандахчиев - Новосибирск),

днРНК-транскригтт 2-микронной плазмиды киллерных дрожжей («Ридостин»),

препарат клинического применения (Л. В. Сандахчиев - Новосибирск)

Биосинтетические:

поли(И)поли(Ц) (М. R. Hilleman et al. - США),

поли(А)-поли(У) (M.R. Hilleman et al. - США),

в Российской Фармакопее - «Полудан», препарат клинического применения (офтальмология)

(Л. Л. Фадеева, А. А. Каспаров - Москва),

поли(Г)-поли(Ц) (С. Е. Брсслср, Н. С. Сидорова, А. Л. Тимковский - Ленинград, Санкт-Петербург; Е. Dc Clercq - США, Бельгия),

лекарственная форма «Полигуацил» - доведена до начала промышленного производства и клинических испытаний

поли(И)-поли(Ц), экранированный поли-Ь-лизином (Н. В. Levy-США), препарат крайне ограниченного клинического применения,

поли(И)поли(Ц) с точками нарушения комплементарное™ (mismatched)

(Р. О. P. Ts’o, W. A. Carter - США), лекарственная форма «Амплиген» -- испытана в клинике при СПИДе (отрицательный результат)

Виды активности днРНК: ИФН-индуцирующая, противовирусная,

иммуностимулирующая (в том числе адъювантная), радиозащитная, противоопухолевая

Чувствительные вирусы: подавляющее большинство из известных ныне вирусов

Тип действия: в основном профилактический,

терапевтический при раннем постинфекционном применении, терапевтическая эффективность против офтальмогерпеса; кумулятивное терапевтическое действие при комбинации с химиотерапией, антителами, антисыворотками и пр.

І

Рис. І. Структура элементарных звеньев трех базовых дуплексов комплементарных полирибонуклеотидов.

В течение длительного срока в лабораториях, возглавляемых профессорами С. Е. Бреслером и Н. С. Сидоровой, проводилось систематическое получение и исследование дуплексов различного нуклеотидного состава. Была разработана рациональная биотехнология ферментативного проточного синтеза полирибонуклеотидов (как гомополимеров, так и сополимеров) с помощью иммобилизованных полинуклеотидфосфорилаз. В результате в сотрудничестве с российскими вирусологами было проведено строгое сравнение биологической активности во многих экспериментальных системах дуплексов разного нуклеотидного состава, полученных из одинаковым образом синтезированных и очищенных полирибонуклеотидов (другие специалисты в подавляющем числе случаев использовали препараты различных фирм и неодинаковой степени чистоты). При этом были разработаны методики надежно воспроизводимого получения стабильного дуплекса поли(Г)-поли(Ц). Основные результаты испытаний были многократно опубликованы [4, 5 и др.], здесь они отражены в табл. 2.

Таблица 2. Биологическая активность (отн. ед.) дуплексов комплементарных

полирибонуклеотидов

Нуклеотидный состав И-Ц г-ц А-У (Г,И)Ц

Максимальный титр индуцированного ИФН 1 0,8-1 0,2-0,5 1-1,5

Период максимальной продукции ИФН, ч 4-6 18-24 4-6 4-24

Антивирусная активность

у мышей 1 1-1,5 0,5-0,7 1,2-2,0

в ФЭК 1 0,5-1 н/о 2,0-5,0

в первичных культурах клеток почки кролика 1 -0,01 н/о 1

Острая токсичность для незараженных мышей* 1 <0,1 -0,1 0,1-0,2

для зараженных мышей I 0 н/о (!) 0, Ї 0,2

Хроническая токсичность 1 0,1-0,2 н/о 0,3-0,4

Стабильность в крови приматов** <0,1** 1 ** — 0,3** 0,7-0,9**

Радиозащитная активность 1 1,1-1,3 н/о н/о

* ЛД5о равна 12-40 мг/кг для поли(И)-поли(Ц) и более 200 мг/кг для поли(Г)-поли(Ц).

** Доля макромолекулярной фракции в каждом дуплексе, сохранившейся после 3 ч контакта с сывороткой, отнесена к таковой для поли(Г) поли(Ц), принятой за единицу, н/о - не определяли.

Приведенные результаты показывают, что в смысле активности дуплекс по-ли(И) поли(Ц) действительно может считаться эталоном. Однако при этом тезис о непременно высокой токсичности наиболее активных препаратов был нами опровергнут. Видно, что можно получить полинуклеотидные дуплексы, не уступающие и даже превосходящие по активности поли(И)-поли(Ц), однако обладающие намного меньшим токсическим действием. Особенно резко различалась токсичность поли(И)-поли(Ц) и поли(Г)-поли(Ц) у зараженных вирусом животных [6]. Таким образом, некоторое влияние первичной структуры полинуклеотидных дуплексов на их ИФН-индуцирующую и противовирусную актизность можно считать установленным, но еще большее влияние первичной структуры сказывается в токсичности и некоторых других видах биологической активности.

Что же касается вклада других структурных факторов в биологическую активность дуплексов, то мы сочли этот аспект разработанным совершенно недостаточно. Потому с позиций молекулярной биофизики автором этих строк была предложена концепция нескольких уровней структурной организации дуплексов комплементарных полинуклеотидов и определена их иерархия во влиянии на биологическую активность [7]. Известным и общепризнанным до этого было следующее: полирибонуклеотидные дуплексы стабилизированы спариванием комплементарных полинуклеотидов водородными связями в соответствии с геометрией Уотсона-Крика и находятся в пространственной конфигурации А’. Значительная био-

логическая активность дуплексов наблюдалась лишь при достаточно высоком молекулярном весе комплементарных цепей. Была вроде бы очевидной, но практически никем до нас не принималась во внимание очень высокая степень полидисперности длин полинуклети-дов, получаемых ферментативным синтезом. Не учитывалось и то, что вследствие монотонной последовательности нуклеотидов в гомополимерах отсутствует (в отличие от природных днРНК) строгая фиксация взаимного расположения комплементарных полинуклео-тидных цепей. Поэтому даже при гипотетическом равенстве длин цепей их взаимодействие может начинаться в любых точках и неизбежно должно приводить к образованию не только двунитевых участков (вторичная структура), но и разветвлений, петель и неспаренных од-нонитевых протяженностей. В итоге было сформулировано представление о третичной структуре дуплексов комплементарных полинуклеотидов, которую можно охарактеризовать как набор двунитевых участков, разделенных локальными внутримолекулярными структурными дефектами [7]. Отсюда понятна упомянутая выше необходимость большей длины комплементарных цепей (зависимость активности от длины цепей для по-ли(Г)-поли(Ц) приведена на рис. 2), что повышает вероятность образования двунитевых

Отн. биол.активность

Поли(Г)-поли(Ц)

Мполи (Г)>

тыс. Да

Рис. 2. Суммирование данных о зависимости биологической активности поли(Г) поли(Ц) от молекулярной массы поли(Г) и поли(Ц).

В каждой серии экспериментов за единицу принята активность максимально активного препарата.

участков достаточной длины для реализации активности. Следующим выводом является то, что снижение числа внутримолекулярных дефектов в дуплексах должно приводить к упорядочению их структуры, увеличению средней длины регулярных участков и, как следствие, повышению активности. Очевидно, что требуется разработка физико-химических методов тестирования количества внутримолекулярных дефектов, а это сделало бы возможным подбор условий для снижения их количества. И, наконец, стало достаточно очевидным, что типы внутримолекулярных дефектов (следовательно, и методы их обнаружения) должны в значительной степени различаться для дуплексов разного нуклеотидного состава, и это как раз и объясняет как некоторые отличия в активности таких дуплексов. Отсюда следовала необходимость подбора разнообразных способов регуляризации их структуры. Для дуплексов поли(Г)-поли(Ц) данная задача была решена путем применения полярографии на ртутном капающем электроде, позволяющей количественно регистрировать число неспаренных с гуанинами цитозинов, и вольтамперометрии на графитовом электроде, зависящей от жесткости макромолекул дуплекса (т. е. от числа дефектов, являющихся шарнирами, точками изгиба) [8, 9]. Часть результатов приведена на рис. 3, из которого видно, что величина пика, соответствующего восстановлению цитозина на ртутном электроде, пропорциональна количеству неспаренных с гуанинами цитозинов в дуплексе и однозначно свидетельствует о степени регуляризации структуры дуплекса.

Особенно интересен, с нашей точки зрения, поиск возможностей повышения противовирусной активности дуплекса поли(А)поли(У), как заведомо мало токсичного и при этом значительно более удобного для промышленного получения больших его количеств. Было обнаружено, что взаимодействие с этим дуплексом известного координационного соединения двухвалентной платины - 1/ис-диамминдихлор-Р1(Н) (цис-ЩЩ) приводит к существенному повышению биологической активности [10] (табл. 3). Мы предположили, что в дуплексе поли(А)-поли(У) при взаимодействии цепей формируются дефекты совершенно особого типа, а именно: геометрия дуплекса в некоторых местах может быть искажена и приобретать характер хугстиновского спаривания за счет аномального взаимодействия урацила с атомом N(7) аденина. Тогда повышение активности может быть объяснено тем, что соединения платины, которые, как известно, взаимодействуют в нуклеиновых кислотах с атомом N(7) пуринов, блокируют хугстиновское спаривание и повышают регулярность дуплекса. Этот механизм иллюстрирует рис. 4. Значит, в данном случае следует искать не точечные эффекты в молекулах дуплекса, а изменения в общей их упорядоченности и термостабильности [11]. Такая комплексная работа проводится сейчас (Ю. В. Иванов, М. А. Суржик и автор этой статьи) на препаратах платины, синтезируемых К. И. Яковлевым (С.-Петерб. хим.-фарм. академия), в сотрудничестве с кафедрой молекулярной биофизики СПбГУ (А. А. Богданов и Н. А. Касьяненко) и лабораторией термодинамики белка Института белка РАН (Р. С. Хусайнова и С. А. Потехин). Ее задача - подбор оптимальных модификаторов и условий взаимодействия для повышения упорядоченности дуплекса по-ли(А)-поли(У), повышения его активности и введения его в круг максимально активных противовирусных препаратов - индукторов ИФН.

Начальные этапы исследования дуплекса поли(А)-поли(У) выполнены при финансовой поддержке Санкт-Петербургского научного центра РАН в 2003 и 2005-2006 гг.

Рис. 3. Дифференциальная импульсная полярография (ДИП) поли(Ц) и ее дуплексов с поли(Г).

/ - поли(Ц) 2-10'4 М; 2 - поли(Г)-поли(Ц) 4-] О’4 М, образование комплекса при 100 °С и 0,1 М ЫаС1, pH 7,4; 3 - поли(Г)-поли(Ц) 4-10’4 М + поли(Ц) 4-10'6 М; 4 - поли(Г)-поли(Ц) 4-10'4 М, образование комплекса при 20 °С и 0,05 М ЫаС1, pH 6,8; 5 - поли(Г)-поли(Ц) 4-10'1 М, образование комплекса при 20 “С и 0,05 М ЫаС1, pH 6,8, затем прогрев при 100 °С; б - поли(Г)-поли(Ц) 4-10'4 М, синтез РНК-полимеразой по матрице поли(Ц).

Таблица 3. Биологическая активность дуплекса поли(А) • поли(У), модифицированного цис-дихлордиаммин-Р1(11)

Гь Кумулятивная выживаемость*, % Титры ИФН**, ед./мл

в легких в мозгу

0 43,6 320 40

0,02 47,5 160 0

0,05 55,0 110 20

0,10 62,3 320 80

0,20 71,9 640 320

Плацебо 29,4 0 0

* Препараты вводили мышам интраназально в лозе 20 мкг на мышь за сутки до заражения вирусом гриппа.

** Препараты вводили мышам внутривенно в дозе 100 мкг на мышь. г/, - молярное соотношение платина/нуклеотид.

Рис. 4. Предполагаемый механизм возникновения внутримолекулярных дефектов в дуплексе поли(А)поли(У) и их исправления координационным соединением двухвалентной платины.

Timkovskii A. L. Polynucleotide interferon inducers as an object for molecular biophysics.

The conception of considering the structure/biological activity relations for the duplexes of complementary polyribonucleotides on the basis of molecular biophysics is presented. The consequence of this conception is the idea of the tertiary structure of these duplexes, in which the regular regions, responsible for the biological activity (interferon-inducing and antiviral), are separated by the intramolecular structural defects. It is shown that the methods for testing dcfccts and minimizing their contents in duplexes could seriously increase biological activity.

Литература

1, De Clercq E., Eckstein F„ Merigan Т. С. II Ann. N. Y. Acad. Sci. 1970. Vol. 173. P. 444-461. 2. Вильнер Jl. М., Тим-ковский А. Л., Тихомирова-Сидорова Н. С. II Итоги науки и техники. Сер. Вирусология. М., 1977. Т. 6. С. 114-159. 3. De Clercq Е., Wells R. D., Grant R. C., Merigan Т. С. II J. Mol. Biology. 1971. Vol. 56. P. 83-100. 4. Тимконский A. Jl., Ершов Ф. И. II Индукторы интерферона/ Под ред. В. М. Жданова. М., 1982. С. 51-55. 5. Surzhik М. A., Vilner L. М., Kalchurin A. L., Timkovskii A. L. II Antiviral Res. 1998. Vol. 38. P. 13 1-140. 6. Вильнер Jl. М., Тимковский A. Jl. II Индукторы интерферона / Под ред. Р. А. Кукайн. Рига, 1981. С. 74-77. 7 Тимковский A.J1. II Там же. С. 52-65. 8. Brabec V., Timkovskii A. L. II General Physiol. Biophys. 1983. Vol. 2, N 6. P. 487-497. 9. Тимковский A. Jl., Балцаро-ваЗ., Брабец В. //Молекулярная биология. 1994. Т. 28, вып. 5. С. 1028-1034. 10. Аксенов О. А., Платонова Г. А., Тимковский А. Л. II Антибиотики и химиотерапия. 1999. Т. 4, № 6. С. 12-15. 11. Иванов Ю. В., Карелов Д. В., Суржик М. А., Тимковский А. Л. II Итоги исследований (научные проекты, программы С.-Петербургского научного центра РАН 2001-2003 гг.) / Отв. ред. Ю. В. Наточин. СПб., 2004. С. 114-116.

Статья принята к печати 19 сентября 2006 г.