CC BY
96
Вестник Челябинского государственного университета. 2013. № 7 (298).
Биология. Вып. 2. С. 107-108.
П. В. Уржумов, А. В. Погодина, А. В. Аклеев
ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ N381 И РАЯР1 И ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕПАРАЦИИ ДНК
Актуальной проблемой является изучение вклада генов репарации ДНК в формирование индивидуальной чувствительности генома к повреждающему воздействию радиации. Было обследовано 62 человека, подвергавшиеся хроническому радиационному воздействию, и 13 человек из контрольной группы. Обнаружена достоверная связь между носительством аллеля NBS1 185Gln и повышенным уровнем фрагментации ДНК.
Ключевые слова: репарация ДНК, метод ДНК-комет, двунитевые разрывы, нибрин, NBS1, PARP1.
Введение. Вследствие генетической гетерогенности популяции человека в ней присутствуют индивиды, набор полиморфных вариантов генов которых определяет их повышенную чувствительность к действию мутагенов. В связи с этим актуальной проблемой является изучение вклада генов репарации ДНК в формирование индивидуальной чувствительности генома к повреждающему воздействию ионизирующего излучения.
Цель. Анализ эффективности репарации ДНК у лиц — носителей полиморфизмов Ии18501п гена NBS1 и Va1762A1a гена PARP1.
Материалы и методы. В ходе работы было обследовано 75 человек: 62 человека основной группы и 13 человек группы сравнения. В основную группу вошли люди, подвергшиеся хроническому радиационному воздействию в 1950-1960 гг. в результате загрязнения радиоактивными отходами ПО «Маяк» бассейна р. Течи [1]. Средняя доза облучения красного костного мозга составила 1,08±0,75 Гр. В группу сравнения вошли люди, сходные по половому, возрастному и национальному составу. В обоих случаях обследовались люди, не имеющие тяжёлых соматических заболеваний (злокачественные новообразования, сахарный диабет, туберкулёз).
Оценка эффективности репарации ДНК проводилась с использованием метода ДНК-комет [4]. Анализ проводили до облучения, непосредственно после облучения проб, а также через 1, 2 и 4 ч после облучения проб.
Выделение ДНК проводили с использованием реактива «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», Москва). Генотипирование по выбранным полиморфизмам осуществляли методом ПЦР с использованием комплекта реагентов для амплификации <^ОТ-экспресс» (НПФ «Литех»). Детекция результатов проводилась методом горизонтального электрофореза в агарозном геле с последующей окраской бромистым итидием.
Для исследования были выбраны два полиморфизма: NBS1 Glu185Gln (rs1805794) и PARP1 Val762Ala (rs1136410). Ген NBS1 кодирует белок нибрин. Этот белок вовлечён в ряд критических функций клетки, включая репарацию повреждений ДНК. Нибрин обеспечивает взаимодействие между двумя белками (MRE11A и Rad50) и контролирует репарацию двунитевых разрывов ДНК, индуцированных ионизирующим излучением или нормальными процессами [2]. Фермент, кодируемый геном PARP1, вовлечён в реакции репарации ДНК, повреждённой химическими мутагенами, активными формами кислорода и ионизирующей радиацией [5].
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программного комплекса SPSS Statistics 17.0. Сравнение групп по качественным признакам и проверку на соответствие равновесию Харди — Вайнберга проводили с помощью критерия х2. Для установления связи между степенью фрагментации ДНК и генотипами использовали корреляционный анализ по Спирмену.
Результаты и обсуждение. В таблице показаны наблюдаемые распределения частот аллелей и генотипов по исследованным локусам. Полученные данные не соответствуют теоретически ожидаемым равновесным распределениям Харди — Вайнберга, что, вероятно, вызвано небольшим размером выборки.
Попытка выявить какие-либо изменения в распределении генотипов у облучённых и необлу-чённых лиц не дала результатов. Требуется существенное расширение групп обследованных на последующих этапах работы.
Корреляционный анализ по Спирмену показал достоверную отрицательную связь между генотипом NBS1 185Glu/Glu и степенью фрагментации ДНК спустя 4 ч после облучения (р = 0,013), а также положительную связь между генотипом
Результаты генотипирования
Ген Полиморфизм Частота аллеля, % (абс.) Частота генотипа, % (абс.)
N P Всего NN NP PP Всего
NBS1 PARP1 Glu185Gln Val762Ala 69,2 (144) 73,6 (153) 30,8 (64) 26,4 (55) 100,0 (208) 100,0 (208) 46,2 (48) 58,4 (114) 46,2 (48) 38,5 (75) 7,6 (8) 3,1 (6) 100.0 (104) 100.0 (195)
N — условно нормальный аллель; P — условно патологический аллель.
NBS1 185G1u/G1n и степенью фрагментации ДНК через 15 мин (р = 0,034) и через 4 ч (р = 0,049) после облучения. Полученный результат может быть объяснён тем, что фермент нибрин, несущий аминокислотную замену 18501п, возможно, менее активен, чем белок, кодируемый аллелем 185G1u [3; 7], что в итоге может приводить к снижению эффективности репарации и увеличению фрагментации ДНК. Отсутствие корреляции между генотипом NBS1 185G1n/G1n и уровнем по-вреждённости ДНК, вероятно, связано с малым размером исследуемой группы.
Связь полиморфизма PARP1 Va1762A1a с уровнем повреждённости ДНК не обнаружена. Этот факт может быть объяснён тем, что условия исследования фрагментации ДНК позволяли выявлять только двунитевые разрывы ДНК, а PARP1 в гораздо большей степени участвует в репарации одноцепочечных разрывов ДНК, нежели двухцепочечных [6].
Выводы и заключение. 1. Не выявлено различий в распределении генотипов по изучаемым полиморфизмам между группами людей, подвергавшихся действию малых доз хронического облучения, и необлучённым контролем.
2. Отмечена связь между носительством аллеля NBS1 185Ип и повышенным уровнем фрагментацией ДНК через 15 мин и через 4 ч после облучения.
3. Связи полиморфизма РЛЯР1 Уа1762Л1а со степенью повреждённости ДНК не обнаружено.
На основе полученных результатов можно заключить, что исследование полиморфизмов гена NBS1 как маркеров индивидуальной радиочувствительности является перспективной задачей.
Список литературы
1. Аклеев, А. В. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Течи / А. В. Аклеев, М. Ф. Киселёв. М. : Мир, 2001. 532 с.
2. Carney, J. P. Rad 50 protein complex and Nijmegen breakage syndrome: linkage of double-strand break repair to the cellular DNA damage response / J. P. Carney, R. S. Maser, H. Olivares [et al.] // Cell. 1998. Vol. 93, № 3. P. 477-486.
3. Lu, M. Association between the NBS1 E185Q polymorphism and cancer risk: a meta-analysis / M. Lu, J. Lu, X. Yang, M. Yang, H. Tan, B. Yun, L. Shi // BMC Cancer. 2009. № 9. P. 124.
4. Ostling, O. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells / O. Ostling, K. J. Johanson // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. Vol. 123. P. 291-298.
5. Rodriguez, S. Hardy-Weinberg equilibrium testing of ascertainment for Mendelian randomization studies / S. Rodriguez, T. R. Gaunt, I. N. M. Day // Amer. J. Biol. Epidem. 2009. DOI 10.1093/aje/ kwn359.
6. Zhai, X. Polymorphisms of ADPRT Val762Ala and XRCC1 Arg39Glu and risk of breast cancer in Chinese women // Oncol. Rep. 2006. Vol. 15, № 1. P. 247-252.
7. Zhong, Q. Association of BRCA1 with the hRad50-hMre11-p95 complex and the DNA damage response / Q. Zhong, C.-F. Chen, S. Li, Y. Chen, C.-C. Wang, J. Xiao, P.-L. Chen, Z. D. Sharp, W.-H. Lee // Science. 1999. Vol. 285. P. 747-750.
