CC BY
85
Е.А. Блинова1'2, А.В. Аклеев1'2
Связь однонуклеотидных полиморфизмов генов репарации ДНК с риском развития злокачественных новообразований у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию
1 ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины»
ФМБА России, г. Челябинск 2 ФГБОУ ВО «Челябинский государственный университет», г. Челябинск
E.A. Blinova1,2, A.V. Akleev12
Association of Single Nucleotide Polymorphisms in DNA Repair Genes with the Risk of Malignant Neoplasm Development in Persons Exposed
to Chronic Radiation
1 Urals Research Center for Radiation Medicine, FMBA of Russia , Chelyabinsk, Russia.
2 Chelyabinsk State University, Chelyabinsk
Ключевые слова: генетический полиморфизм, риск развития рака, репарация ДНК, радиационное облучение.
Целью данного исследования является анализ риска развития злокачественных новообразований (ЗНО) у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в зависимости от наличия полиморфных вариантов генов репарации ДНК В исследование были включены лица, подвергшиеся хроническому радиационному воздействию в период с 1949 по 1960 г. в результате сбросов радиоактивных отходов в реку Теча (Южный Урал, Россия). В обследованную группу и группу сравнения вошли мужчины и женщины, средний возраст которых составил 78лет, средняя накопленная доза обучения красного костного мозга в группе лиц с ЗНО составила 0,79 Гр, в группе сравнения — 1 Гр. Проводился анализ ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов эксцизионной репарации оснований (0001 гэ1052133, АРЕХ гэ1130409), эксцизионной репарации нуклеотидов (ЕЯЯС2 гэ13181, ХРС гэ2228001, ХЯСС1 гэ1799782, ХЯСС1 гэ25487, РАЯР1 гэ1136410), негомологичного соединения концов ДНК (ЫББ1 гэ13312840, ХЯСС4 гэ2075685) с риском развития рака. Было выявлено два полиморфизма, статистически значимо ассоциированных с риском развития ЗНО (р<0,05). Полиморфизм гена 0001 гэ1052133 ассоциирован с повышенным риском развития ЗНО у носителей генотипа С/0, отношение шансов
Keywords: gene polymorphism, risk of cancer, DNA repair, radiation exposure.
The aim of the current research is to analyze the risk of the development of malignant neoplasms in persons chronically exposed to radiation, depending on the presence of polymorphous variants of genes involved in the base and nucleotide excision repair, nonhomologous end joining. The research involved a study of a group ofpersons who had been exposed to chronic low-intensity radiation over the period from 1949 through 1960 due to the releases of radioactive waste into the Techa River (South Urals, Russia). The study group included men and women, whose average age was 78years, the average accumulated dose of red bone marrow in the group of individuals with cancer was 0.79 Gy, in the comparison group was 1 Gy. We examined the association of SNPs of the genes involved in the base excision repair (OGG1 rs1052133, APEX rs1130409), nucleotide excision repair (ERRC2 rs13181, XPC rs2228001, XRCC1 rs1799782, XRCC1 rs25487, PARP1 rs1136410), nonhomologous end joining (NBS1 rs13312840). Two SNPs were associated with the risk of malignant neoplasm development (p<0.05). The polymorphism of the gene OGG1 rs 1052133 is associated with an increased risk of cancer development in the genotype C/G carriers, the adjusted odds ratio (OR) is 2.14 (95% CI - 1.43-3.22). The polymorphism of the gene for nonhomologous end joining NBS1 rs13312840 is also associated with a risk of cancer
E.A. Блинова, А.В. Аклеев
(ОШ) составило 2,14 (95% ДИ — 1,43-3,22). Полиморфизм гена негомологичного соединения концов ДНК NBS1 гз13312840 также статистически значимо ассоциирован с риском развития ЗНО, у носителей генотипа С/Т наблюдается повышенный риск (ОШ — 2,25, 95% ДИ — 1,12—4,51), а у носителей генотипа С/С пониженный риск развития ЗНО (ОШ — 0,27, 95% ДИ — 0,08—0,96).
development in С/Тheterozygotes (OR — 2.25, 95% CI — 1.12-4.51) and in homozygotes C/C (OR — 0.27, 95% CI - 0.08-0.96).
Среди отдаленных последствий облучения человека наибольшее значение в формировании ущерба здоровью имеет развитие злокачественные новообразований (ЗНО) [19]. Согласно эпидемиологическим исследованиям одним из канцерогенныгх факторов является радиационное воздействие, которое способно индуцировать как солидные новообразования, так и лейкозы [14]. Можно полагать, что избыточный радиационный риск ЗНО реализуется у части облученныгх лиц, которые являются наиболее радиочувствительными.
Очевидно, что реализация радиационных канцерогенных эффектов зависит от баланса процессов повреждения и восстановления клеточных структур, в первую очередь ядерной ДНК. При равных условиях воздействия и физиологических параметрах клеток степень повреждения генома определяется эффективностью работы системы обнаружения и репарации повреждений, которая в свою очередь напрямую зависит от генетических особенностей организма.
Существенный вклад в вероятность развития отдаленных стохастических эффектов облучения, таких как ЗНО разной локализации, могут вносить однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) в генах системы репарации [6; 17]. Один из механизмов участия ОНП в канцерогенезе — замены в смыгсловыгх участках гена, приводящие к изменению нуклеотид-ной последовательности, что может отражаться на аминокислотной последовательности белка или влиять на экспрессию гена [24]. Как следствие, функциональные характеристики белков могут существенно измениться.
В работе быша изучена популяция лиц, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию в период с 1949 по 1960 г. вследствие сброса радиоактивных отходов в реку Теча (Южный
Урал, Россия) производственным объединением «Маяк» [3]. Ранее у жителей прибреж-ныгх сел р. Теча были отмечены повышенный риск развития ЗНО [1], увеличение числа лимфоцитов периферической крови с блоком клеточного цикла и хромосомными аберрациями [21] , увеличение частоты апопто-тической гибели клеток и мутаций в генах Т-клеточного рецептора [7; 2].
Целью данного исследования является анализ риска развития ЗНО у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, в зависимости от наличия полиморф-ныгх вариантов генов, контролирующих экс-цизионную репарацию оснований и нуклео-тидов, а также негомологичное соединение концов ДНК.
Материалы и методы
Характеристика пациентов
Были обследованы 495 членов когорты р. Теча [11], которые подверглись хроническому радиационному воздействию в период с 1949 по 1960 г. вследствие проживания на радиоактивно загрязненных территориях (Челябинская область, Россия). Население прибрежныгх сел подверглось внешнему и внутреннему облучению. Доза внешнего облучения сформировалась за счет у-излучающих радионуклидов (главным образом 137Св, 857г, 85№, 106Бн). Основными источниками внутреннего облучения населения в первые годы были 90Бг, 89Бг, 137Св и другие изотопы, поступившие в организм с речной водой и продуктами местного производства [3]. Основным до-зообразующим радионуклидом быш 90Бг из-за его способности к накоплению и сохранению в костной ткани в течение длительного времени. Высокий градиент органныгх доз быш обусловлен значительным облучением костного мозга и костной ткани [20]. Индивидуальные
кумулятивные дозы на красный костный мозг были рассчитаны для каждого донора сотрудниками биофизической лаборатории ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины» (УНПЦ РМ) ФМБА России с использованием дозиметрической системы ТИББ 2009 [9] (табл. 1).
Для проведения анализа облученных людей разделили на две группы. Первая была представлена 169 донорами, у которых на период проведения анализа в анамнезе содержались сведения о ЗНО различной локализации. Вторая группа была представлена 326 донорами, у которых не было диагностировано ЗНО на момент исследования. Информация о ЗНО у доноров получена из канцер-регистра ФГБУН УНПЦ РМ. Локализация ЗНО у обследуемых лиц была следующей: рак кожи — у 17,9% доноров, желудочно-кишечного тракта — 15,8, молочной железы — 15,3, репродуктивной системы — 14,3, щитовидной железы — 8,7, органов дыхания — 7,1%, мочевыде-лительной системы — 6,6, головы и шеи — 4,6, гемобластозы — 2,6, меланома кожи — 1,5, рак другой локализации — 5,6% доноров.
Образцы крови
Исследование проводили на замороженных образцах крови, которые хранились в банке тканей ФГБУН УНПЦ РМ. Каждый пациент подписывал информированное согласие на взятие образцов крови и проведение исследования. Протоколы исследования были одобрены этическим комитетом УНПЦ РМ. Перед исследованием образцы крови размораживали при температуре 5°С. Выделение ДНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции [15].
Генотипирование образцов ДНК
Выбор полиморфизмов для анализа происходил при изучении базы данных полноге-
номных исследований HapMap и базы данных генетических вариаций, ассоциированных с клиническими признаками MedGen. В результате были выбраны следующие полиморфизмы генов: OGG1 rs1052133, APEX rs1130409, ERRC2 rs13181, XPC rs2228001, XRCC1 rs1799782, XRCC1 rs25487, PARP1 rs1136410, NBS1 rs13312840, XRCC4 rs2075685.
Генотипирование образцов и детекцию результатов осуществляли методом полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе StepOnePlus («Applied Biosystems», США) с использованием наборов реагентов для ПЦР («Тест-ген», Россия). Реакционная смесь включала из расчета на одну амплификационную пробирку: 6,8 мкл деионизованной воды; 2,0 мкл смеси для ПЦР; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Затем в каждую пробирку добавляли 1 мкл исследуемого образца ДНК. В качестве отрицательного контроля использовали деионизованную воду.
Статистический анализ
Сравнение групп по частотам аллелей изученных полиморфизмов проводили методом вычисления отношения шансов (ОШ) и доверительного интервала (ДИ) с применением веб-инструмента SNPStats [18]. Отношения шансов рассчитывали по четырем моделям взаимодействия аллелей в генотипе (кодоминирование, доминирование, рецессивное проявление и сверхдоминирование) для всех исследуемых генов. Доминантная модель
— сравнение гомозигот по мажорному аллелю против объединенных гомозигот по минорному аллелю и гетерозигот; рецессивная модель
— сравнение гомозигот по минорному аллелю против объединенных гомозигот по мажорному аллелю и гетерозигот; кодоминантная модель — сравнение гомозигот по мажорному аллелю против гетерозигот и против гомозигот по минорному аллелю; сверхдоминантная
Таблица 1 Характеристика обследованных лиц
Группы Количество человек Пол, % (n) Национальность, % (n) Возраст на 2016 г., mean±SD (min—max) Доза облучения красного костного мозга, Гр, mean±SD (min—max)
Мужчины Женщины Тюрки Славяне
Облученные с ЗНО 169 36,7 (62) 63,3 (107) 50,9 (86) 49,1 (83) 78±0,5 (66-100) 0,79±0,06 (0,004—3,96)
Облученные без ЗНО 326 32,5 (106) 67,5 (220) 65,6 (214) 34,4 (112) 77±0,4 (66-99) 1,0±0,04 (0,002—4,46)
Е.А. Блинова, A.B. Аклеев
модель — сравнение гомозигот по мажорному и минорному аллюлею против гетерозигот. Конечный выбор модели осуществляли в соответствии с наименьшими значениями показателей р-уа1ие и А1С-фактора.
Результаты исследования
Было выявлено два полиморфизма, статистически значимо ассоциированных с риском развития рака: полиморфизм гена эксцизионной репарации оснований 0001 Г81052133 и полиморфизм гена негомологичного соединения концов ДНК ЫББ1 ге13312840 (табл. 2).
Носительство генотипа С/О по полиморфному аллелю Г81052133 гена эксцизионной репарации оснований 0001 согласно ко-доминантной модели статистически значимо ассоциировано с повышенным риском развития ЗНО (ОШ - 2,00, 95% ДИ - 1,352,96, р=0,002 без учета факторов; ОШ — 2,14, 95% ДИ - 1,43-3,22, р=0,0001 с учетом факторов пола и национальности).
Для полиморфизма гена негомологичного соединения концов ДНК МББ1 ^13312840 в соответствии с кодоминантной моделью наблюдается статистически значимое повышение риска развития ЗНО у гетерозигот С/Т по сравнению с гомозиготами С/С и Т/Т
(ОШ - 2,23, 95% ДИ - 1,13-4,44, р=0,003 без учета факторов; ОШ - 2,25, 95% ДИ -1,12-4,51, р=0,003 с учетом факторов пола и национальности). При этом для гомозигот С/С наблюдается статистическое снижение риска развития рака (ОШ - 0,24, 95% ДИ - 0,07-0,85, р=0,003 без учета факторов; ОШ - 0,27, 95% ДИ - 0,08-0,96, р=0,003 с учетом факторов пола и национальности) (табл. 2).
Для остальных генов не было выявлено статистически значимого влияния на риск развития рака по исследуемым моделям.
Обсуждение результатов
Трансформация нормальной клетки в злокачественную представляет собой сложный многоступенчатый процесс, начинающийся с повреждений ДНК, которые могут приводить к мутациям. Эти изменения в норме испытывают на себе корректирующее воздействие ряда репарационных белков. Если репарационные механизмы эффективны, то нарушения большей частью исправляются, если же то или иное звено системы репарации недостаточно функционирует, то существует вероятность передачи геномных нарушений следующим поколениям и интенсификации мутагенеза.
Таблица 2 Ассоциация полиморфизмов с риском развития рака
Ген БОТ Аллели1 Генетическая модель/генотип2 Риск без учета факторов Риск с учетом факторов3
ОШ 95% ДИ р -уровень ОШ 95% ДИ р -уровень
ООО1 ге1052133 С/О Кодоминантная С/О 2,00 (1,35-2,96) 0,002 2,14 (1,43-3,22) 0,0001
АРЕХ ^1130409 А/С Рецессивная С/С 0,65 (0,40-1,07) 0,09 0,63 (0,38-1,04) 0,07
ЕИСС2 ге13181 О/Т Рецессивная Т/Т 0,84 (0,46-1,52) 0,56 0,81 (0,44-1,48) 0,49
ХРС ге2228001 А/С Рецессивная С/С 0,85 (0,48-1,49) 0,56 0,81 (0,46-1,43) 0,47
ХИСС1 ге1799782 С/Т Доминантная С/С 0,73 (0,41-1,30) 0,28 0,71 (0,40-1,27) 0,24
ХИСС1 ге25487 С/Т Доминантная С/С 1,41 (0,93-2,13) 0,1 1,45 (0,95-2,21) 0,081
РАИР1 ^1136410 С/Т Доминантная С/С 0,79 (0,51-1,21) 0,28 0,82 (0,53-1,26) 0,36
N881 ге13312840 С/Т Кодоминантная Т/С 2,23 (1,13-4,44) 0,003 2,25 (1,12-4,51) 0,003
Доминантная С/С 0,24 (0,07-0,85) 0,003 0,27 (0,08-0,96) 0,003
Примечание: 1 мажорный/минорный аллели; 2 значимый генотип; 3 учет факторов пола (две группы) и национальности (две группы).
Полученные нами результаты согласуются с литературными данными, которые свидетельствуют о том, что полиморфизмы генов ферментов репарации ДНК могут влиять на функцию или эффективность процессов репарации поврежденной ДНК и тем самым определять риски развития ЗНО. Так, для гетерозиготного генотипа С/G полиморфизма rs1052133 гена OGG1 регистрируется повышение риска развития рака желчного пузыря [10], рака поджелудочной железы [22], а для гомозигот G/G наблюдается повышение риска развития рака желудка [12] и рака груди [4]. Полиморфизм rs13312840 гена NBS1 ассоциирован с повышенным риском развития рака почки [13] и рака простаты [16].
Следует отметить, что исследованные нами гены принимают непосредственное участие в процессах репарации повреждений ДНК и играют определяющую роль в ответе организма на действие ионизирующего излучения. Так, в результате радиационного воздействия одним из возможных повреждений является окислительное повреждение ДНК. Среди многих типов окислительных повреждений ДНК 8-оксогуанин является одним из самых мутагенных повреждений [8]. Фермент OGG1 кодируемый геном OGG1 может непосредственно удалить 8-ок-согуанин из поврежденной ДНК [5], однако наличие минорного аллеля, вероятно, приводит к неэффективной репарации и как следствие — к сохранению повреждений ДНК.
Ключевую роль в репарации двуните-вых разрывов ДНК, которые являются одними из основных видов повреждений, вызванных действием ионизирующего излучения, играет белок NBS1. Мутации в гене NBS1 значительно подавляют функцию комплекса белков, принимающих участие в процессе репарации путем негомологичного соединения концов ДНК [5], что также может отражаться в эффективности процессов репарации.
Таким образом, учитывая, с одной стороны, роль ОНП в механизме канцерогенеза, а с другой — генотоксическое действие ионизирующего излучения, можно ожидать повышения риска развития отдаленной онкопато-логии у лиц, имеющих неблагоприятный генотип по исследуемым в данной работе генам.
Выводы
1. Носительство гетерозиготного генотипа C/G по полиморфизму гена эксцизионной репарации оснований OGG1 rs1052133 в соответствии с кодоминантной моделью статистически значимо ассоциировано с повышенным риском развития ЗНО в 2 раза.
2. Для полиморфизма гена негомологичного соединения концов ДНК NBS1 rs13312840 в соответствии с кодоминантной моделью наблюдается статистически значимое повышение риска развития ЗНО у гетерозигот C/T в 2 раза по сравнению с гомозиготами C/C и T/T, при этом для гомозигот C/C регистрируется снижение риска развития рака.
Литература
1. Крестинина Л. Ю., Cилкин C. C., Микрюко -ва Л.Д. и др. Cравнительный анализ риска смерти от солидных злокачественных новообразований у населения, облучившегося на реке Теча и Восточно-Уральском Радиактивном ^еде // Радиация и риск (Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра). 2017. Т. 26. № 1. C. 100-114.
2. Маркина Т.Н., Веремеева Г. А., Блинова Е.А., Аклеев А.В. Блок клеточного цикла и активность апоптоза лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частота мутаций в генах TCR в отдаленные сроки у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию // Вопросы радиационной безопасности. 2011. № 1. C. 41-49.
3. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Теча / Под ред. А.В. Аклеева, М.Ф. Киселева. М: ФУ «Медбиоэкстрем», 2000. C. 530.
4. Alanzi M., Pathan A.A.K., Shaik J.P. et al. The hOGG1 Ser326Cys gene polymorphism and breast cancer risk in Saudi Population // Pathology Oncology Research. 2017. Vol. 23. No. 3. P. 525-535.
5. Araki K., Yamashita T., Reddy N. et al. Molecular disruption of NBS1 with targeted gene delivery enhances chemosensitisation
E.A. Блинова, A.B. Aклeeв
in head and neck cancer // British Journal of Cancer. 2010. No. 103. P. 1822-1830.
6. Barnett G.C., Kerns S.L., Noble D.J. et al. Incorporating genetic biomarkers into predictive models of normal tissue toxicity // Clinical Oncology. 2015. Vol. 27. No. 10. P. 579-789.
7. Blinova E.A., Veremeyeva G.A., Akle-yev A.V. Apoptosis of peripheral blood lymphocyties and mutations in the gene of the T-cell receptor in survivors of chronic radiation exposure // Health Physics. 2012. No. 103. P. 58-60.
8. Cheng K.C., Cahill D.S., Kasai H. et al. 8-Hydroxyguanine, an abundant form of oxidative DNA damage, causes G-T and A—C substitutions // British Journal of Cancer. 1992. No. 267. P. 166-172.
9. Degteva M.O., Shagina N.B., Tolstykh E.I. et al. Individual dose calculations with use of the Revised Techa River Dosimetry System TRDS-2009D / Chelyabinsk and Salt Lake City: Urals Research Center for Radiation Medicine and University of Utah. Final Report for Milestone. 2009. P. 22.
10. Jiao X., Huang J., Wu S. et al. hOGG1 Ser326Cys polymorphism and susceptibility to gallbladder cancer in a Chinese population // International Journal of Cancer. 2007. No. 121. P. 501-505.
11. Kossenko M.M., Thomas T.L., Akleyev A.V. et al. The Techa River Cohort: Study design and follow-up methods // Radiation Research. 2005. Vol. 164. No. 5. P. 591601.
12. Lu J., Yin Y., Du M. et al. The association analysis of hOGG1 genetic variants and gastric cancer risk in a Chinese population // Oncotarget. 2016. No. 4 (40). P. 6606166068.
13. Margulis V., Lin J., Yang H. et al. Genetic susceptibility to renal cell carcinoma: The role of DNA double-strand break repair pathway // Cancer Epidemiology, Biomarkers, and Prevention. 2008. Vol. 17. No. 9. P. 2366-2373.
14. Report to the General Assembly, with Scientific Annex. Biological mechanisms of
radiation actions at low doses. New York, 2012. P. 45.
15. Sambrook J., Russell D.W. Purification of nucleic acids by extraction with phenolchloroform // Cold Spring Harbor Protocols. 2006.
16. Silva J., Teixeira A.L., Lobo F. et al. DNA repair system and prostate cancer progression: The role of NBS1 polymorphism (rs1805794) // DNA and Cell Biology. 2012. Vol. 31. No. 7. P. 1182-1186.
17. Simonelli V., Mazzei F., D'Errico M. et al. Gene susceptibility to oxidative damage: from single nucleotide polymorphisms to function // Mutation Research. 2012. No. 731. P. 1-13.
18. Sole X., Guino E., Valls J. et al. SNPStats: A web tool for the analysis of association studies // Bioinformatics. 2006. No. 22. P. 1928-1929.
19. The Recommendations of the International Commission on Radiological Protection. ICRP Publication 103. 2007. Ann. ICRP 37 (2-4).
20.Tolstykh E.I., Degteva M.O., Peremyslo-va L.M. et al. Reconstruction of long-lived radionuclide intakes for Techa riverside residents: strontium-90 // Health Physics. 2011. № 101. P. 28-47.
21. Veremeyeva G., Akushevich I., Blinova E. et al. Long-term cellular effects in humans chronically exposed to ionizing radiation // Health Physics. 2010. No. 99. P. 337-346.
22.Zhang J., Zhang X., Dhakal I.B. et al. Sequence variants in antioxidant defense and DNA repair genes, dietary antioxidants, and pancreatic cancer risk // International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2011. No. 2. P. 236-244.
Контакты:
Блинова Евгения Андреевна.
научный сотрудник лаборатории радиационной генетики ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины» ФМБА России, кандидат биологических наук. Тел.: раб.: (351) 778-08-16. E-mail: [email protected]
