CC BY
236
УДК 612.6.052.4:616.15-055.2]-076.5 Кубанский научный медицинский вестник № 6 (111) 2009
Е. Е. ПАНКОВА1, Л. В. ЗИНЧЕНКО1, С. А. МАТУЛЕВИЧ1, В. И. ГОЛУБЦОВ2
ПОЛИМОРФИЗМ С677Т ГЕНА MTHFR
__ ** _________________________________ ____________________
КАК ФАКТОР РИСКА ВРОЖДЕННОЙ ПАТОЛОГИИ У ПОТОМСТВА
Краевая клиническая больница № 1 им. проф. С. В. Очаповского,
Кубанская межрегиональная медико-генетическая консультация,
Россия, 350086, г. Краснодар, ул. 1 Мая, 167.
E-mail: [email protected], тел. 8 (861) 274-58-57, факс 8 (861) 252-75-44;
2кафедра биологии с курсом медицинской генетики Кубанского государственного медицинского университета Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4
Мутации в гене метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR) в различных популяциях мира рассматриваются как факторы риска для развития врожденных пороков развития у потомства. Показано, что полиморфизм С677Т гена MTHFR оказывает существенное влияние на частоту у потомства таких врожденных пороков развития, как дефекты невральной трубки (генотип СТ и ТТ), множественных врожденных пороков развития (генотип СТ) и хромосомной аномалии (ТТ).
Ключевые слова: метилентетрагидрофолат редуктаза, полиморфизм, врожденные пороки развития.
E. E. PANKOVA1, L. V. ZINHENKO1, S. A. MATULEVICH1, V. I. GOLUBTSOV2
POLYMORPHISM С677Т OF GENE MTHFR AS THE RISK FACTOR CONGENITAL PATHOLOGY AT POSTERITY
1Regional clinical hospital № 1 by hym. prof. S. V. Ochapovskiy, Kuban interregional medico-genetic advice,
Russia, 350086, Krasnodar, street of 1 May, 167.
E-mail: [email protected], tel. 8 (861)274-58-57, fax 8 (861) 252-75-44;
2Departament of Biology et medico-genetic Kuban Medical University,
Russia, 350063, Krasnodar, Sedina st., 4
Mutations in a gene methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) in various populations of the world are considered as risk factors for development of congenital malformations in posterity. It is shown that polymorphism C677T of gene MTHFR makes essential impact on frequency at posterity of such congenital anomalies as neural tubae defects (genotype CT and a TT), plural congenital anomalies (genotype CT) and chromosomal anomaly (TT).
Key words: methylenetetrahydrofolate reductase, polymorphisms, congenital malformations.
Введение
Рождение ребенка с врожденными пороками развития (ВПР) ложится тяжким моральным и не менее тяжелым материальным грузом на семью и общество в целом. Перед родителями и врачами всегда возникает вопрос о причинах и условиях, которые способствовали возникновению ВПР у ребёнка. Большинство ВПР имеют мультифакториальную этиологию, что подразумевает одновременное воздействие генетической предрасположенности и дополнительных внешних воздействий [1, 2]. Определение этиологических факторов ВПР как сложной гетерогенной группы наследственных и врожденных заболеваний и синдромов является сложной задачей [1]. Применение методов молекулярной диагностики существенно расширило понимание роли генов в формировании ВПР.
В качестве одного из генетических факторов, предрасполагающих к развитию спинномозговой грыжи, анэнцефалии, расщелин губы и нёба, пороков сердца [4, 7-11], а также рождения ребёнка с хромосомной аномалией (трисомия 21 и 18) [6] рассматриваются мутации гена метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), кодирующего ключевой фермент фолатного метаболизма МТИРК.
Известно несколько вариантов мутаций в гене MTHFR. Одним из наиболее значимых признан полиморфизм С677Т: замена цитозина на тимин в 4-й эк-зоне гена, приводящая к замещению аминокислоты аланина на валин в каталитическом домене фермента MTHFR (A222V). У лиц, гетерозиготных и гомозиготных по данному полиморфному варианту, отмечаются термолабильность MTHFR и уменьшение каталитической активности фермента in vitro примерно до 30% и 60% соответственно [5]. Данный полиморфизм модулирует глобальное гипометилирование генома в лимфоцитах и лейкоцитах человека, но только при сочетании с низким уровнем поступления фолата. Такое взаимодействие генетической предрасположенности и особенностей питания приводит к повышению гомоцистеина в организме.
Гомоцистеин свободно переходит через плаценту и может оказывать прямое эмбриотоксическое действие [5]. Около половины населения является гетерозиготными носителями аллеля С677Т, частота гомозигот зависит от популяции и этнической принадлежности и колеблется от 1% (среди чернокожих Африканского континента и Америки) до 20-35% (среди жителей Италии, Испании и Мексики). В Европе частота гомозигот-
ной формы С677Т увеличивается с севера на юг. Русская популяция по частоте рассматриваемой мутации занимает промежуточное положение между азиатскими и большинством европейских популяций (табл. 1).
Цель исследования - провести сравнительный анализ распространенности полиморфизма С677Т гена МТИРК у женщин, имевших детей (плодов) с дефектами невральной трубки, множественными врожденными пороками развития, хромосомной патологией и в контрольной группе.
Материалы и методы
Материалом для изучения распространенности вариантов полиморфизма в гене 5,10-метилентет-рагидрофолат редуктазы (вариантов аллеля С667Т) послужили образцы ДНК, полученные у 186 женщин, имеющих в анамнезе ребенка (плода) с ВПР, а именно с анэнцефалией, спинномозговой грыжей, недифференцированными МВПР, хромосомной патологией (трисомия 18 и 21). Во всех случаях диагноз врожденного порока развития у новорожденного (плода) был установлен врачом-генетиком, хромосомная патология подтверждалась цитогенетически, а в случаях летального исхода диагноз подтверждался патолого-анатоми-ческим исследованием. В качестве контрольной группы послужили образцы крови 134 женщин, имеющих двух и более здоровых детей. Все обследованные являлись жителями Краснодарского края.
Методом исследования послужил молекулярногенетический анализ, включающий в себя экстракцию ДНК из 5 мл образцов периферической крови. Анализ мутаций С677Т гена МТИРК проводили с использова-
нием диагностического набора праймеров и рекстрик-таз производства ООО «Центр молекулярной генетики» (Москва, Россия).
Анализ полиморфизма С677Т в гене MTHFR проводили в образцах крови матерей, имевших детей/ плодов с ВПР с использованием полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Наличие С677Т варианта гена обнаруживает сайт рестрикции HINFI, выявляемый рестрикционным анализом с последующим электрофорезом. Амплификация гена MTHFR полимеразной цепной реакцией и определение С677Т варианта выполнялись по методу Frosst с использованием следующих условий ПЦР:
95°- 5 мин
94°- 1 мин Ч
60°- 1 мин } 35 циклов
72°- 1 мин J
72°- 3 мин
с парой праймеров: 4f: TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA и 4r: AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG [11].
Продукты амплификации подвергали ферментативной обработке рестриктазой Hinf I («Сибэнзим», Новосибирск) в течение ночи при температуре 370 С.
Генотип 677С характеризовался наличием фрагмента длиной 198 п. н. При наличии генотипа 677T формировалось два фрагмента 175 + 23 п. н.
Результаты амплификации и рестрикции оценивали в 7%-ном полиакриламидном геле (АА/БисАА 29:1). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хТВЕ. Электрофорез проводили при напряженности
Таблица 1
Частоты генотипов и аллелей полиморфного варианта С677Т гена MTHFR у здоровых индивидов в различных популяциях
Регион Генотип (%) Аллель Автор
С/С С/Т Т/Т С Т
Россия Санкт-Петербург 49,1 46,3 4,6 72 28 О. В. Малышева и др., 2007
Ленинградская обл. 52,4 39,1 8,5 72 28 Е. А. Калашникова и др., 2006
Москва 49,1 43,9 7,0 71 29 Т. С. Бескоровайная и др., 2006
Томск 50 37 13 69 31 Е. А. Трифонова и др., 2009
Красноярск 50,0 44,0 6,0 71 29 Е. В. Маркова и др., 2008
Краснодарский край 75,4 24,6 0 88 12 Настоящее исследование
Азия Казахстан 55 44 1 77 23 Ж. С. Махмутова и др., 2007
Китай 21,4 55,3 23,3 78 22 W. L. Zhu et al., 2006
Тайвань 58,4 34,9 6,7 76 24 C. N. Lee et al., 2005
Европа Беларусь 42 48 10 66 34 А. А. Гусина и др., 2007
Нидерланды 44,5 47,3 8,2 68 32 I. M. van Beynum et al., 2006
Норвегия 49,5 41,7 8,8 70 30 E. Nurk et al., 2004
Германия 56,6 34,2 9,2 74 26 R. Junker et al., 2001
Франция 42 43,8 14,2 64 36 R. M. G-Rodriguez et al., 2006
Италия 26,0 54,0 20,0 53 47 S. Storti et al., 2003
Америка Мексика 19,7 44,6 35,7 42 58 R. M. G-Rodriguez et al., 2006
США, Канада 48 42 10 69 31 С. A. Hobbs et al., 2000
США 41,5 46,5 12 65 35 G. M. Shaw et al., 2005
Бразилия 47,4 36,8 15,8 66 34 L. C. Galdieri et al., 2007
Африка Западная 82,8 16,4 0,8 91 9,0 R. M. G-Rodriguez et al., 2006
Того 85 13,4 1,6 92 8,3
Бенин 80,6 18,8 0,6 90 10
Кубанский научный медицинский вестник № 6 (111) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 6 (111) 2009
Таблица 2
Частота генотипа по С677Т полиморфизму гена MTHFR у жительниц Краснодарского края, имевших детей (плодов) с ДНТ, МВПР и хромосомной аномалией, в сравнении с контрольной группой, %
Группы исследуемых Генотипы MTHFR
СС СТ ТТ
n % n % n %
I ДНТ, N=90 27 30±4,8 51 56,7±5,2** 12 13,3±3,6**
II МВПР, N=57 24 42,1±6,5 30 52,6±6,6** 3 5,3±3,0
III ХА, N=39 15 38,5±7,8 15 38,5±7,8 9 23,0±6,7**
IV Контроль, N=134 101 75,4±3,7** 33 24,6±3,7 0 0
Примечание: ** - p<0,001.
Таблица 3
Частота аллелей С677Т полиморфизма гена MTHFR у жительниц Краснодарского края, имевших детей (плодов) с ДНТ, МВПР и хромосомной аномалией, в сравнении с контрольной группой, %
Аллели
Группы исследуемых Абс. С Т X2 Р
Абс. % Абс. %
I ДНТ 180 105 58,3 75 41,7 50,71 <0,001
II МВПР 114 78 68,4 36 31,6 20,06 <0,001
III ХА 78 45 57,7 33 42,3 35,21 <0,001
IV Контроль 268 235 87,7 33 12,3
поля 16 В/с в течение 1,5-2,0 часа. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага ^РвА. Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,1 мкг/мл) и фотографировали в УФ-свете.
Соответствие распределения частот генотипов гомозигот ТТ (два аллеля С677Т), гетерозигот СТ (один аллель С677Т) и гомозигот СС (нет аллеля С677Т) равновесию Харди-Вайнберга оценивалось с помощью критерия хи-квадрат (х2) [9].
Результаты и обсуждение
В контрольной группе матерей настоящего исследования частота гетерозиготного (С/Т) носительства полиморфизма С677Т составила 24,6%, гомозиготного Т/Т не зарегистрировано. При сравнении частоты полиморфизма С677Т в различных популяциях (табл. 1) выявлены более низкие частоты аллеля Т (12,3%) в нашем исследовании. Вероятно, эти различия обусловлены разными подходами к формированию контрольной группы. У большинства исследователей в контрольную группу входило взрослое население, не имеющее сердечно-сосудистых заболеваний и тромбозов [2, 4, 6-11]. Контрольную группу нашего исследования составляли женщины, имеющие двух и более здоровых детей, без отягощённого акушерского анамнеза.
С целью определения клинико-диагностической значимости полиморфизма С677Т гена MTHFR на территории Краснодарского края были определены час-
тоты генотипов по данному полиморфизму в 3 группах матерей, имевших в анамнезе детей (плодов) с различными формами ВПР, в сравнении с группой контроля (табл. 2).
Нами установлено, что более высокая частота генотипа ТТ зарегистрирована в III и I группах женщин, имевших в анамнезе рождение ребёнка с хромосомной аномалией (23,0%) и ДНТ (13,3%), а генотип СТ чаще определен у матерей, имевших детей с ДНТ (56,7%), МВПР (52,6%) и в 38,5% при ХА. Таким образом, полученные данные (табл. 2) показывают, что у матерей, имевших в анамнезе ребенка (плод) с ДНТ, статистически достоверно чаще встречались генотипы СТ и ТТ по сравнению с контрольной группой. В группе женщин, родивших детей с МВПР, преобладало гетерозиготное носительство (СТ), а в группе матерей, дети которых имели хромосомную патологию, - гомозиготное носи-тельство (Т/Т).
Распределение аллелей MTHFR в исследуемых группах изучалось в соответствии с законом равновесия Харди-Вайнберга. Из таблицы 3 следует, что частота Т аллеля полиморфизма С677Т гена MTHFR была значительно выше в III, I и II группах матерей, чем среди матерей IV группы. Так, в группе III частота Т аллеля составила 42,3% (33/78 аллелей) при 12,3% (33/235 аллелей) в группе контроля (р<0,001).
Полученные результаты подтверждают важную этиологическую роль носительства матерями мутации
С677Т в гене MTHFR при формировании таких ВПР, как ДНТ, МВПР и ХА у плода, что может быть использовано как прогностический тест в проспективном медикогенетическом консультировании.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов О. В. Полиморфизм генов, ассоциированных с врожденными пороками развития у детей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 4. - С. 19-20.
2. Гусина А. А. Роль мутации С677Т гена метилентетрагидро-фолат редуктазы в развитии венозных тромбозов у жителей Республики Беларусь / А. А. Гусина и соавт. // Медицинская панорама. -2007. - № 3. - С. 77-81.
3. Махмутова Ж. С. Полиморфизм гена метилентетрагидро-фолат-редуктазы при открытых дефектах невральной трубки в популяции казахов / Ж. С. Махмутова, Г. С. Святова // Мед. генетика. -2007. - Т. 6, № 12 (66). - С. 39-41.
4. Brandalize A. P. Polymorphisms in genes MTHFR, MTR and MTRR are not risk factors for cleft lip/palate in South Brazil / A. P. Brandalize, E. Bandinelli, J. B. Borba (et al.) // Braz. J. Med. Biol. Res. -2007. - V. 40, № 6. - Р. 787-791.
5. Frosst P. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase [letter] / P. Frosst, H. J. Blom, R. Milos [et al.] // Nat. Genet. - 1995. - V. 10. -P. 111-113.
6. Hobbs C. A. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism as maternal risk factors for Down syndrome / C. A. Hobbs,
S. L. Sherman, P. Yi, S. E. Hopkins (et al.) // Am. J. Hum. Genet. -2000. - V. 67. - P. 623-630.
7. Galdieri L. C. Homocysteine concentrations and molecular analysis in patients with congenital heart defects / L. C. Galdieri, R. A. Santiago, C. M. C. Silva (et al.) // Arch. Med. Res. - 2007. -V. 38. - P. 212-218.
8. Lee C. N. Association of the C677T methylenetetrahydrofolate reductase mutation with congenital heart diseases / C. N. Lee, Y. N. Su, W. F. Cheng (et al.) // Acta Obstet. Gynecol. Scand. - 2005. -V. 84. - P. 1134-1140.
9. Storti S. Association between 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C polymorphisms and conotruncal heart defects / S. Storti, S. Vittorini, M. R. lascone (et al.) // Clin. Chem. Lab. Med. - 2003. - V. 41. - P. 276-280.
10. Van Beynum I. M. Maternal MTHFR 677C>T is a risk factor for congenital heart defects: effect modification by periconceptional folate supplementation / I. M. van Beynum, L. Kapusta, M. den Heijer (et al.) // Eur. Heart. J. - 2006. - V. 27. - P. 981-987.
11. Zhu J. Variable contribution of the MTHFR C677T polymorphism to non-syndromic cleft lip and palate risk in China / J. Zhu, A. Ren, L. Hao (et al.) // Am. J. Med. Genet. - 2006. - V. 140, № 6. - P. 551-557.
Поступила 01.09.2009
В. В. СОРОКИНА
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ПОРАЖЕНИЯ ПОЧЕК В СЛУЧАЯХ СМЕРТИ ПРИ ГЕРОИНОВОЙ НАРКОМАНИИ
Кафедра судебной медицины с курсом правоведения,
ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия»,
Россия, 644043, г.Омск, ул. Партизанская, 20. E-mail: [email protected], тел. (3812) 236207
В работе впервые представлено описание морфологических форм героинового поражения почек. Впервые определены морфологические критерии героиновой нефропатии. Выявлен спектр структурных изменений в почках в зависимости от стажа употребления опийных наркотиков внутривенно и дана морфологическая характеристика с применением морфометрических методов исследования.
Ключевые слова: опийная наркомания, героиновая нефропатия.
V. V. SOROKINA
MORPHOLOGICAL VARIANTS OF DEFEAT OF KIDNEYS IN DEATH CASES AT THE HEROIN NARCOTISM
Chair of forensic medicine with a course of jurisprudence, Omsk state medical academy,
Russia, 644043, Omsk, Partizanskaya street, 20. E-mail: [email protected], tel. (3812) 236207
In work the description of morphological forms of heroin defeat of kidneys for the first time is presented. For the first time morphological criteria heroin nephropathies’ are defined. The spectrum of structural changes in kidneys depending on the use experience opioid drugs intravenously is revealed and the morphological characteristic with application morphological research methods is given.
Key words: opioid a narcotism, heroin nephropathies.
Поражения почек, возникающие у лиц, употребляющих наркотические вещества, достаточно полиморфны, встречаются практически у всех наркопотребителей. Низкое качество употребляемого наркотика, содержащего значительное количество токсических примесей, приводит к развитию картины хронического отравления
последними [1, 3]. Почки в этой связи превращаются в один из самых уязвимых органов-мишеней, и их поражение приводит к быстрой инвалидизации субъекта, с одной стороны, и развитию сразу нескольких порочных кругов для метаболизма наркотика как типичного ксенобиотика, с другой [2, 4].
Кубанский научный медицинский вестник № 6 (111) 2009
