CC BY
13в обеих доминируют гаплотипы А и В, а остальные минорные варианты были специфичны для O. scapulalis и O. nubilalis, то есть гаплотипы С-К встречаются только среди насекомых с кукурузы, а гаплотипы L-Q - только среди насекомых с двудольных растений. Минорные гаплотипы, встречающиеся только в пределах одной подвыборки, обозначены как «видоспецифичные»; суммарная частота их встречаемости составила 15-20 % (рис.).
Локус COI обладает достаточной разрешающей способностью для идентификации таксонов Metazoa, в том числе Insecta, ранга вида, в том числе криптических видов [Yang et al., 2012; Kirk et al., 2013]. Наличие в обеих подвы-борках, соответствующих двум видам рода Ostrinia, двух одинаковых мажорных гаплотипов указывает на очень высокий уровень родства этих таксонов, что соответствует данным морфологического анализа и представлениям о недавней дивергенции O. nubilalis от O. scapulalis, которая рассматривается как предковая форма [Frolov et al., 2012]. Установить точную видовую принадлежность одиночной особи стеблевого мотылька по локусу COI, таким образом, не представляется возможным, однако наличие от 15 до 20 % видоспецифичных гаплотипов в выборках насекомых указывает на возможность диагностировать выборки насекомых по структуре минорных гаплотипов. Данную систему можно рассматривать как дополнение к системе генотипирования с помощью микросателлитных маркеров.
Рисунок. SNP-элайнмент 18 гаплотипов локуса первой субъединицы митохондриальной цитохромокидазы (COI) гусениц Ostrinia, собранных с кукурузы (группа «Monocot», O. nubilalis), полыни и конопли (группа «Dicot», O. scapulalis). Гаплотипы А-В, встречающиеся у обоих видов, выделены прямоугольной рамкой
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №№ 15-04-01226-а и 16-54-00144-Бел_а. Библиографический список (References)
Frolov A. N. et al. From Russia with lobe: genetic differentiation in trilobed uncus Ostrinia spp. follows food plant, not hairy legs //Heredity, 2012. V. 108. N . 2. - C. 147-156.
Yang Y. et al. Increasing the data size to accurately reconstruct the phylogenetic relationships between nine subgroups of the Drosophila melanogaster species group (Drosophilidae, Diptera) // Molecular phylogenetics and evolution, 2012. V. 62. P. 214-223.
Серапионов Д.А., Дубровина А.Г., Фролов А.Н. Популяционная структура кукурузного мотылька в Краснодарском крае // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем. Вып. 5. Матер. докл. межд. научно-практич. конф., 23 сентября - 25 сентября 2008 г. Краснодар: ВНИИБЗР, 2008. С. 158-160.
Фролов, А.Н. Биотаксономический анализ вредных видов рода Ostrinia Hbn. // Этология насекомых. Л.: Наука, 1984. С. 4—100.
Kirk H., Dorn S., Mazzi D. Molecular genetics and genomics generate new insights into invertebrate pest invasions // Evolutionary Applications, 2013. V. 6. N . 5. С. 842-856.
Plant Protection News, 2016, 3(89), p. 53-54
POLYMORPHISM OF NUCLEOTIDE SEQUENCE OF MITOCHONDRIAL COI GENE OF CRYPTIC SPECIES POPULATIONS OF THE GENUS OSTRINIA (LEPIDOPTERA: PYRALOIDEA) I.V. Grushevaya, J.M. Malysh, A.G. Kononchuk, A.N. Frolov
All-Russian Institute of Plant Protection, grushevaya_12@mail.ru Aim of the study is to access level of polymorphism of nucleotide sequence of COI gene fragment of mTDNA in populations of stem borers Ostrinia nubilalis Hbn. and Ostrinia scapulalis Wlk., originating from monocotyledonous and dicotyledonous plants, respectively. It is found that 80 % of samples is represented by two major molecular haplotypes common in both species while the rest minor variants were specifis for O. nubilalis and O. scapulalis. In other words, precise determination of a single specimen using COI locus is not possible though presence of species-specific haplotypes suggests availability of genotyping of insect samplings basing upon structure of minor haplotypes.
УДК 632.4
ПОЛИМОРФИЗМ ГРИБА РиСС1МЛ ТЫПСШЛ ПО ВИРУЛЕНТНОСТИ И МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ НА ВИДАХ ПШЕНИЦЫ И ЭГИЛОПС
Е.И. Гультяева, Е.Л. Шайдаюк, М.К. Аристова, И.А. Казарцев
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург, Пушкин, Россия, eigultyaeva@gmail.com Цель исследований - оценить полиморфизм изолятов гриба Р. Мйста по вирулентности и микросателлитным локусам на растениях-хозяевах родов ТгШсит и Aegilops разной плоидности, собранных в географически отдаленных регионах России (Дагестан, Новосибирск) и Казахстане. Выявлено влияние генома и плоидности растения-хозяина на
«Эколого-генетические основы современных агротехнологий». СПб, 27-29 апреля 2016 г.
55
генетическую изменчивость гриба по вирулентности. Изоляты с тетраплоидных видов были менее вирулентные, чем с диплоидных и гексаплоидных. Сходство между изолятами с гексаплоидных видов было выше, чем с тетраплоидных. С использованием микросателлитных маркеров не выявлено существенных различий между дагестанскими изолятами с тетраплоидных, диплоидных и гексаплоидных видов. При этом западно-азиатские (новосибирские) популяции с Т. ¡Лсоссит и Т. aestivum, и казахстанские с твердой отличались от кавказских (дагестанских) по вирулентности и микросателлитным маркерам.
Ключевые слова: бурая ржавчина, SSR-маркеры, ТгШсит spp., Aegilops spp.
Коэволюция возбудителя бурой ржавчины пшеницы (Puccinia triticina Erikss.) и его растений - хозяев - видов пшеницы и эгилопс в процессе доместикации пшениц несомненно предопределила генетическую дивергенцию гриба. При этом большинство популяционных исследований гриба выполнено с использованием инфекционного материала с Triticum aestivum и T. durum. В мировой литературе имеется ограниченная информация о вирулентности и составе популяций P. triticina на других видах Triticum и Aegilops.
Цель настоящих исследований - оценка полиморфизма популяций P triticina по вирулентности и микросател-литным локусам на растениях-хозяевах родов Triticum и Aegilops разной плоидности.
Инфекционным материалом служили монопустуль-ные изоляты гриба Р. triticina, выделенные с 17 видов пшеницы и эгилопс (диплоидного Ae. tauschii, тетраплоидных - Ae. crassa 4x, T. aethiopicum,T. dicoccum, T. dicoccoides, T. turanicum, T. durum, гексаплоидных - Ae. juvenalis, Ae. trivialis, T. compactum, T. macha, T. petropavlovskyi, T. spelta, T. sphaerococcum, T. vavilovii, T. durum, T. aestivum) и собранные в географически отдаленных точках России (Дагестане, Новосибирске) и Северном Казахстане в 2014 г.
Вирулентность тестировали на 20 почти изогенных Tcir-линиях. Для обозначения фенотипов использована буквенная северо-американская номенклатура [Long, Kolmer, 1989]. Работа выполнена по методикам лабораторного культивирования Р. triticina [Михайлова и др., 2003]. Статистическая обработка результатов анализа вирулентности выполнена с помощью пакета программ Virulence Analysis Tool (VAT) (http://www.tau.ac.il/lifesci/ departments/plants/members/ kosman/VAT.html).
Выделение ДНК из спорового материала гриба проводили по методике А. Justesen и соавторов [2002]. Для SSR-анализа использовали 18 микросателлитных маркеров (PtSSR13, PtSSR50, PtSSR55, PtSSR61, PtSSR76, PtSSR91, PtSSR92, PtSSR151, PtSSR152, PtSSR158, PtSSR161, PtSSR164, PtSSR173, PtSSR186, PtSSR13, RB8, RB26, RB35 [Szabo, Kolmer, 2007; Duan et al., 2003]. Фрагментный анализ выполнен на генетическом анализаторе ABI3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Определение размеров SSR-аллелей осущест-
вляли в программе GeneMapper v4.1. Частоты аллелей и индексы генетических различий рассчитаны c помощью пакета программ GeneAlEx (Genetic analysis in Excel, 6.5 http://biology.anu.edu.au/Ge nAlEx/).
Все изоляты показали авирулентность на линиях с генами Lr9, Lr19, Lr24 и вирулентность на линиях с генами Lr11, Lr14a, Lr17a, Lr30. Варьирование в частотах вирулентности отмечено на линиях TcLr1, Lr2a, Lr2b, Lr2c, Lr3a, Lr3bg, Lr15, Lr16, Lr18, Lr20 и Lr26. Среди 187 изолятов выявлено 40 фенотипов. Число фенотипов варьировало у разных видов пшеницы и эгилопс от 1 (T petropavlovskyi, Ae. trivialis, T. dicoccum, T. dicoccoides, Ae. crassa, T. durum) до 12 (Ae. tauschii). Только 7 фенотипов встречались на 2 и более растениях-хозяевах. Выявлены значимые различия по вирулентности между изо-лятами с диплоидных, тетраплоидных и гексаплоидных видов. Среднее число аллелей вирулентности (Average virulence complexity (AVC)) различалось в азиатских (Новосибирск - 17, Казахстан - 16.3) и кавказских (Дагестан - 13.2) популяциях с T. aestivum и c тетраплоидно-го вида T. dicoccum (Новосибирск - 13, Дагестан - 10.8). Для популяций с гексаплоидных видов показатель AVC варьировал от 15.3 (Ae. juvenalis) до 11 (Ae. trivialis, T. vavilovii), а с тетраплоидных от 8.4 (T turanicum) до 10.8 (T. dicoccum). Изоляты P. triticina с гексаплоидных видов имели большее сходство с изолятами с мягкой пшеницы, по сравнению с тетраплоидными и диплоидными.
При SSR-анализе выявлен 61 генотип, из них 38 встречались на 2 и более видах пшеницы и эгилопс. Полиморфизм наблюдали по 42 аллелям. Уровень наблюдаемой гетерозиготности (Но) был ниже ожидаемой (Не). Согласно индексам генетических расстояний (Fst, Nei Genetic Distance) различия по микросателлитным локусам между дагестанскими изолятами с тетраплоид-ных и гексаплоидных видов были незначительные. На UPGMA-дендрограмме все они кластеризовались в одну близкородственную группу. При этом, как и по вирулентности, выявлены различия между географическими популяциями: западно-азиатские (новосибирские) с T. dicoccum и T. aestivum, и казахстанские с твердой отличались от кавказских (дагестанских).
Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект №14-26-00067).
Михайлова Л.А., Гультяева Е.И., Мироненко Н.В. Методы исследования генетического разнообразия популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы Puccinia recondita Rob.ex Desm.f.sp.tritici. Санкт-Петербург, РАСХН, ВНИИЗР, Инновац. центр защиты растений. 2003. 24с.
Duan X., Enjalbert J., Vautrin D., Solignac C., Giraut T. Isolation of 12 microsatellite loci, using an enrichment protocol, in the phytopathogenic fungus Puccinia triticina // Mol. Ecol. Notes. 2003.Vol.3. P. 65-67.
Библиографический список (References)
Justesen A.F., Ridout C. J., Hovm0ller M. S. The recent history of Puccinia striiformis f. sp. tritici in Denmark as revealed by disease incidence and AFLP markers // Plant Pathology. 2002. V. 51. P. 13-23. Long D.L., Kolmer J. A. North American system of nomenclature for Puccinia
recondita f.sp. tritici // Phytopathology, 1989. V.79. P. 525-529. Szabo L. S., Kolmer J.A. Development of simple sequence repeat markers for the plant pathogenic rust fungus Puccinia triticina // Mol.Ecol. Notes. 2007. N 7. Р. 708-710.
Plant Protection News, 2016, 3(89), p. 54-56
POLIMORPHISM OF PUCCINIA TRITICINA FUNGUS FOR VIRULENCE AND MICROSATELLITE LOCI ON TRITICUMAND AEGILOPS SPECIES E.I. Gultyaeva, E.L. Shaydayuk, M.K. Aristova, I.A. Kazartsev
All-Russian Institute of Plant Protection, eigultyaeva@gmail.com The aim of researche is to evaluate the polymorphism of P. triticina isolates for virulence and microsatellite loci on the different ploidy host plants (Triticum spp. and Aegilops spp.) collected in geographically distant regions of Russia (Dagestan, Novosibirsk) and Kazakhstan. The influence of host plant genome and ploidy on genetic variability of fungus for virulence was revealed. Isolates from tetraploid species were less virulent than from the diploid and hexaploid ones. The similarity between isolates from hexaploid wheats were higher than from tetraploid ones. Differences between Dagestan isolates from tetra- hexa- and diploid species for microsatellite loci were less significant than in virulence. West Asian populations collected in Novosibirsk from T. dicoccum and T. aestivum, and in Kazakhstan from durum wheat were differed from the Caucasus isolates collected in Dagestan for virulence and microsatellite markers.
УДК 632.4
СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ РиСС1МЛ ТШТ1СтЛ В ЕВРОПЕЙСКИХ РЕГИОНАХ РОССИИ Е.И. Гультяева, Е.Л. Шайдаюк, М.К. Аристова, И.А. Казарцев
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург, Пушкин, Россия, eigultyaeva@gmail.com Цель исследований: охарактеризовать полиморфизм популяций Рисатс1 Мйстс1 по микросателлитным локусам в европейских регионах России в 2006-2014 гг Выявлено высокое сходство между популяциями Поволжья, Центрального, Центрально-Черноземного и Северо-Западного регионов, что подтверждает гипотезу о существовании единой популяции гриба на данной территории, выдвинутую ранее на основании анализа вирулентности.
Ключевые слова: бурая ржавчина, SSR-маркеры, Triticum spp., Aegilops spp.
Возбудитель бурой ржавчины пшеницы (Puccinia triticina Erikss.) встречается практически ежегодно во всех зернопроизводящих областях европейской части России. По данным ряда исследователей [Михайлова, 2006; Сорокина и др., 1990; Гультяева и др., 2011; Коваленко и др., 2012] на данной территории существует европейская популяция гриба. Однако в результате анализа вирулентности в отдельные годы выявляются определенные различия в составе популяций между региональными европейскими популяциями [Гультяева и др., 2015], что может являться следствием естественного отбора по вирулентности на возделываемых генетически разнородных сортах. Микро-сателлитные маркеры являются селективно-нейтральными, связи с чем, представляло интерес оценить SSR-поли-морфизм популяций P. triticina в Европейской части РФ.
Инфекционный материал был собран в 2006-2014 гг. Материалом служили 32 изолята из Северо-Западного региона (СЗ) (Калининградская, Псковская, Ленинградская обл.), 8 из Центрального (Ц) (Тульская, Смоленская, Владимирская, Брянская обл.), 37 из ЦЧР (Курская, Липецкая, Воронежская, Тамбовская, Белгородская обл.) и 32 из Поволжья (В) (Чувашия, Нижегородская, Самарская, Саратовская обл.). Все изоляты охарактеризованы по признаку вирулентности на 20 почти изогенных Zr-линиях Thatcher (Tc). Выделение ДНК проводили по методике А. Justesen и соавторов [2002]. Для SSR-анализа использовали 18 ми-кросателлитных маркеров (PtSSR13, PtSSR50, PtSSR55, PtSSR61, PtSSR76, PtSSR91, PtSSR92, PtSSR151, PtSSR152, PtSSR158, PtSSR161, PtSSR164, PtSSR173, PtSSR186, PtSSR13, RB8, RB26, RB35 [Szabo, Kolmer, 2007; Duan et al., 2003]. Фрагментный анализ проводили на генетическом
анализаторе ABI3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Определение размеров SSR-аллелей осуществляли в программе GeneMapper v4.1. Частоты аллелей, показатели разнообразия и индексы генетических различий рассчитаны c помощью пакета программ GeneAlEx (Genetic analysis in Excel, 6.5). UPGMA-дендрограммы сходства по вирулентности и SSR-маркерам построены с помощью пакета программ NTSYSpc, Version 2.2.
Все изоляты показали устойчивый тип реакции на линии с геном Lr24 и восприимчивый на линиях TcLrll, TcLr14a, TcLr16, TcLr17a. Варьирование в частотах вирулентности отмечено на линиях TcLr1, Lr2a, Lr2b, Lr2c, Lr3a, Lr3bg, Lr3ka, Lr9, Lr14b, Lr15, Lr16, Lr18, Lr19, Lr20, Lr26 и Lr30. 109 изученных изолятов были представлены 45 фенотипами вирулентности, из них 10 встречались в двух и более регионах. Изоляты из Поволжья были представлены 15 фенотипами, из ЦЧР - 19, из Центрального - 5, Северо-Западного - 19. Согласно индексу Нея (Nei Genetic Distance) и показателю межпопуляционной изменчивости PhiPT (AMOVA), изоляты из Центрального и Центрально-Черноземного регионов характеризовались высоким межпопуляционным сходством, и умеренно отличались от изолятов с Поволжья и Северо-Запада (табл. 1).
С использованием микросателлитных маркеров выявлено 29 генотипов, из них 14 отмечены в двух и более регионах. Среди волжских изолятов выявлено 18 SSR-ге-нотипов, центральных - 3, центрально-черноземных - 18, северо-западных - 13. Для всех популяций уровень наблюдаемой гетерозиготности (Но) был выше ожидаемой (Не). Число аллелей на локус (Na) варьировало от 1 (локус SSRPt76) до 4 (SSRPt158, SSRPt68); среднее значение (Na)
