CC BY
38
2. Быхалов Л. С. // Сибирский медицинский журнал. — 2013 — № 8. — С. 94—97.
3. Гиллер Д. Б., Папков А. В., Гздымин Л. Е. и др. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. — 2008. — № 10. — С. 21—25.
4. Гринберг Л. М. // Фтизиатрия и пульмонология. — Екатеринбург, 2011. — № 1.
5. Ерохин В. В., Лепеха Л. Н., Гздымин Л. Е., Двораков-ская Л. В. Клеточная биология легких в норме и при патологии / Под ред. В. В. Ерохина, Л. К. Романовой. — М., 2000.
6. Макашева Е. В., Конанчук О. Н., Морозова Е. В. // Журнал инфектологии. — 2009. — № 2/3, Т 1.
7. Пантелеев А. М. // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2010. — № 1, Т 2. — С. 16—22.
8. Юдин С. А. // Сибирский медицинский журнал. — 2013, № 8. — С. 101—103.
9. Falvo J. V., Ranjbar S., Jasenosky L. D., et al. // Am J Respir Cell Mol Biol. — 2011. — Vol. 45 (6). — P 1116—1124.
10. Koo M. S., Subbian S., Kaplan G. // Cell Commun Signal. — 2012. — Vol. Jan 26; 10 (1):2.
11. Kouassi B., N’Gom A., Horo K., et al. // Rev Mal Respir. — 2013. — Vol. 30 (7). — P 549—554.
12. Sued O., Quiroga M. F., Socias M. E., et al. // Viral Immunol. — 2011. — Vol. 24 (4). — P. 347—349.
Контактная информация
Быхалов Леонид Сергеевич — к. м. н., докторант кафедры патологической анатомии, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: leonby-vgd@yandex.ru
УДК 616.151.5:618.2+616.151.5:618.39
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ТОЛЛ-РЕЦЕПТОРОВ И СЫВОРОТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН С СИНДРОМОМ ПОТЕРИ ПЛОДА В АНАМНЕЗЕ
Л. Н. Питиримова, Б. Ю. Гумилевский, Е. А. Загороднева
Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра клинической лабораторной диагностики
Исследование основано на выявлении сывороточных уровней провоспалительных цитокинов и определении распределения полиморфизмов генов толл-рецепторов среди женщин с физиологическим течением беременности и с синдромом потери плода в анамнезе; проведен сравнительный анализ с данными, полученными в контрольной группе соматически здоровых женщин.
Ключевые слова: провоспалительные цитокины, синдром потери плода, полиморфизм генов толл-рецепторов.
POLYMORPHISM OF GENES OF TOLL-LIKE RECEPTORS AND SERUM LEVELS OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINS IN PREGNANT WOMEN WITH FETAL LOSS SYNDROME IN THE PAST MEDICAL HISTORY
L. N. Pitirimova, B. Y. Gumilevskiy, E. A. Zagorodneva
The study aimed to identify the serum levels of pro-inflammatory cytokines and determine the distribution of polymorphism of genes of toll-like receptors in women with physiological gestation course and with fetal loss syndrome in the past medical history. We performed a comparative analysis of these findings with the data obtained in the control group of healthy women. Key words: pro-inflammatory cytokines, fetal loss syndrome, polymorphism of genes of toll-like receptors.
Проблема невынашивания беременности является одной из наиболее актуальных в современном акушерстве. Высокая частота ее возникновения обуславливает необходимость поиска путей предотвращения осложнений беременности, приводящих к потере плода [2, 5, 6]. В последние десятилетия внимание исследователей привлекает роль иммунных механизмов в формировании фетоплацентарной единицы и их влияние на течение гестационного процесса. В этом аспекте имеет важное значение изучение роли механизмов врожденного иммунитета, в частности , толл-подобных рецепторов (Toll-li ke receptors (TLRs)) [3, 4, 7, 8, 9, 10]. Несмотря на то, что толл-рецепторы были
открыты относительно недавно, изучена и доказана их роль в развитии ряда патологических процессов, в том числе воспаления [9, 10]. TLRs клеток моноцитарно-макрофа-гального ряда посредством передачи сигнала внутрь клетки приводят к увеличению продукции целого ряда провоспалительных цитокинов и костимуляционных молекул, которые способствуют активации Т-лимфоцитов и стимулируют развитие адаптивного иммунного ответа [7].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Сравнительный анализ особенностей распределения полиморфных локусов генов толл-рецепторов (TLR2,
Выпуск 2 (50). 2014
31
TLR3, TLR4, TLR6, TLR9) и сывороточных уровней ИЛ-1р, ИЛ-6, IFNy и TNFa у женщин с физиологической беременностью и с синдромом потери плода в анамнезе.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Обследовано 203 пациентки, наблюдающихся в МУЗ «Женская консультация № 5» и МУЗ «Женская консультация № 6» Волгограда. Все обследуемые были разделены на 3 группы. Группу контроля (группа 1) составили 100 небеременных соматически здоровых женщин репродуктивного возраста, группу 2 — 39 женщин с физиологическим течением беременности, группу 3—64 беременных с синдромом потери плода в анамнезе. Группы были репрезентативны по возрасту (29 ± 4,05) лет и сроку гестации (18 ± 3,2) недель.
Материалом для исследования послужила периферическая кровь пациенток, полученная при плановом посещении. Цитокины определялись с помощью наборов реактивов для иммуноферментного анализа производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург): «ИФА-IL-6», «ИФА-ILH р», «ИФА-IFN-gamma», «ИФА-TNF-alpha» на фотометре иммуноферментном планшетном «Эфос» 9305 (ОАО «Московский завод Сапфир», Москва). В наборах использован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа.
Исследование полиморфизма генов TLRs производили с помощью диагностических наборов для выявления полиморфизмов в геноме человека методом полимеразной цепной реакции «SNP-экспресс» производства НПФ «Литех»: «Мутация толл-подоб-ного рецептора 2» (ген — TLR2, полиморфизм — Arg753Gln), «Мутация толл-подобного рецептора 3» (ген — TLR3, полиморфизм — Phe412Leu), «Мутация толл-подобного рецептора 4» (ген — TLR4, полиморфизм —Asp299Glu), «Мутация толл-подобного рецептора 6» (ген — TLR6, полиморфизм — Ser249Pro), «Мутация толл-подобного рецептора 9» (ген — TLR9, полиморфизм—T-1237C).
Статистические расчеты производили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 фирмы StatSoft, Inc. (США). Значимость различий при сравне-
нии групп оценивалась непараметрическим U-критерием Манна-Уитни, достоверность различия частот встречаемости оценивали с помощью критерия %2.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате обследования выявлено, что среди женщин с синдромом потери плода в анамнезе по сравнению с женщинами, у которых беременность протекала физиологически, значимо выше частота кольпитов (44 %), сочетанных урогенитальных инфекций (19 %), эндометритов (25 %), синдрома поликистозных яичников (25 %). Кроме того, текущая беременность в исследуемой группе в 74 % случаев была осложнена угрозой выкидыша на сроках (9 ± 3,5) и (18 ± 2,27) недель, подтвержденной данными ультразвукового исследования и клиническими методами исследования.
Анализ содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 р, ИЛ-6, IFNy, TNFa) в сыворотке крови обследуемых групп женщин показал значимое увеличение количества TNFa [(18,7 ± 4,2) пг/мл, р < 0,05] в группе беременных с синдромом потери плода в анамнезе по сравнению с группой женщин с физиологическим течением беременности (7,4 ± 1,0) пг/мл и контрольной группой (4,73 ± 0,51) (табл. 1).
Для нормального развития беременности определенный уровень TNFa необходим, так как он ограничивает процессы синтеза ДНК клетками трофобласта [1]. Однако гиперпродукция TNFa приводит к нарушению микроциркуляции и тканевой гипоксии, в результате происходит снижение маточно-плацентарного кровотока и нарушение метаболической, трофической, гормональной функции плаценты [6].
При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Arg753Gln гена TLR2 обнаружено преобладание частоты аллели Gln в группе женщин с синдромом потери плода в анамнезе (18 %) над частотой того же аллеля в группе женщин с физиологической беременностью (4 %) и контрольной группой (5 %). Кроме того, встречаемость генотипа Arg/Gln (27 %) в группе 3 преобладала над встречаемостью этого гено-
Таблица 1
Содержание цитокинов в сыворотке обследованных женщин
Показатель, пг/мл Группа 1 небеременные соматически здоровые женщины (M ± m) n = 89 Группа 2 женщины с физиологическим течением беременности(M ± m) n = 39 Группа 3 беременные женщины с синдромом потери плода в анамнезе(M ± m) n = 64
ИЛ-1Р 7,4 ± 0,8 8,00 ± 1,04 5,90 ± 0,87
ИЛ-6 5,04 ± 1,54 4,3 ± 1,1 6,3 ± 1,5
IFNy 2,18 ± 1,40 4,1 ± 1,4 4,2 ± 1,0
TNFa 4,73 ± 0,51 7,4 ± 1,0 18,7 ± 4,2*#
*Статистически значимые отличия от группы 2 (р < 0,05; по U-критерию Манна-Уитни); #статистически значимые отличия от группы 1 (р < 0,05; по U-критерию Манна-Уитни).
32
Выпуск 2 (50). 2014
типа в группе 1 (9 %) и группе 2 (8 %). Количество нормальных гомозигот Arg/Arg оказалось выше в контрольной группе (90 %) и среди женщин с физиологической беременностью (92 %), чем в группе 3 (69 %) (табл. 2).
Частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR3 (Phe412Leu) и TLR6 (Ser249Pro) в исследуемых группах статистически не отличались.
В группе женщин с синдромом потери плода в анамнезе аллель Gly полиморфного маркера гена TLR4 Asp299Gly встречалась чаще (25 %), чем в группе 2 (25 %) и контрольной группе (9 %). Генотип Asp/ Gly в группе 3 также встречался чаще (31 %), чем в группе 1 (14 %) и группе 2 (10 %). Нормальные гомозиготы Asp/Asp среди женщин с синдромом потери плода в анамнезе, напротив, встречались реже (67 %), чем среди женщин группы 1 (84 %) и группы 2 (87 %) (табл. 3).
В группе 3 гетерозиготы ТС по полиморфному маркеру гена TLR9 (T-1237C) встречались реже (44 %), чем в группе 2 (69 %) и контрольной группе (64 %). Количество мутантных гомозигот СС в группе женщин с синдромом потери плода в анамнезе было статистически выше, чем в группе 2 (9 % против 0 % соответственно) (табл. 4).
Таким образом, в ходе исследования выявлено преобладание гетерозиготного генотипа по полиморфным маркерам генов TLR2 и TLR4 в группе женщин с синдромом потери плода в анамнезе, а также большее количество мутантных гомозигот СС по полиморфному маркеру гена TLR9 в сравнении с группами 1 и 2. Также установлено наличие высокого уровня TNFa среди женщин с синдромом потери плода в анамнезе в сравнении с его уровнем у женщин с физиологической беременностью, что свидетельствуют о неустановившемся ко второму триместру иммунном балансе в системе мать-плод-плацента. Боль-
Таблица2
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR2 Arg753Gln
в исследуемых группах, (%)
Показатель Группа 1 небеременные соматически здоровые женщины, n Группа 2 женщины с физиологическим течением беременности, n Группа 3 беременные женщины с синдромом потери плода в анамнезе, n
Аллели 105 (82)*#
Arg 189 (95) 75 (96)
Gln 11 (5) 3 (4) 23 (18)*#
Всего 200 78 128
Генотип 44 (69)*#
Arg/Arg 90 (90) 36 (92)
Arg/Gln 9 (9) 3 (8) 17 (27)*#
Gln/Gln 1 (1) 0 (0) 3 (4)
Всего 100 39 64
*Статистически значимые отличия по сравнению с группой 2 (р < 0,05; по критерию х2); Статистически значимые отличия по сравнению с группой 1 (р < 0,05; по критерию х2).
Таблица 3
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR4 Asp299Gly
в исследуемых группах, (%)
Показатель Группа 1 небеременные соматически здоровые женщины, n Группа 2 женщины с физиологическим течением беременности, n Группа 3 беременные женщины с синдромом потери плода в анамнезе, n
Аллели 106 (75)*#
Asp 182 (91) 72 (92)
Gly 18 (9) 6 (8) 22 (25)*#
Всего 200 78 128
Генотип 53 (67)*#
Asp/Asp 84 (84) 34 (87)
Asp/Gly 14 (14) 4 (10) 10 (31)*#
Gly/Gly 2 (2) 1 (3) 1 (2)
Всего 100 39 64
‘Статистически значимые отличия по сравнению с группой 2 (р < 0,05; по критерию х2); Статистически значимые отличия по сравнению с группой 1 (р < 0,05; по критерию х2).
Выпуск 2 (50). 2014
33
Таблица 4
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR9 (T-1237C)
в исследуемых группах, (%)
Показатель Группа 1 небеременные соматически здоровые женщины, n) Группа 2 женщины с физиологическим течением беременности, n Группа 3 беременные женщины с синдромом потери плода в анамнезе, n
Аллели
T 130 (65) 51 (65) 88 (72)
C 70 (35) 27 (35) 40 (28)
Всего 200 78 128
Генотип
TT 33 (33) 12 (31) 30 (47)
TC 64 (64) 27 (69) 28 (44)*#
CC 3 (3) 0 (0) 6 (9)*
Всего 100 39 64
*Статистически значимые отличия по сравнению с группой 2 (р < 0,05; по критерию х2); #статистически значимые отличия по сравнению с группой 1 (р < 0,05; по критерию х2).
шой процент хронических инфекционных и неинфекционных заболеваний урогенитального тракта среди обследуемых женщин может служить важным патогенетическим фактором в нарушении иммунной реактивности при беременности и формировании угрозы выкидыша.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выявленный повышенный уровень TNFa в сыворотке крови беременных женщин с синдромом потери плода в анамнезе, свидетельствует о наличии серьезного провоспалительного фактора в механизме развития осложнений второго триместра беременности в виде угрозы выкидыша у большинства женщин с синдромом потери плода в анамнезе. Это может быть обусловлено негативным влиянием системного воспаления на трофобласт. В большинстве случаев, увеличенный уровень TNFa в сыворотке крови женщин с синдромом потери плода в анамнезе был связан с наличием гетерозиготного аллельного варианта генов TLR2 Arg753Gln и TLR4 Asp299Gly. Аддитивный эффект такого сочетания приводит к нарушению формирования адаптивного иммунного ответа при беременности, особенно на фоне хронических воспалительных неинфекционных и инфекционных заболеваний. Это увеличивает вероятность осложнений во время беременности, в том числе приводит к синдрому потери плода.
Следовательно, оценка уровней провоспалительных цитокинов в сыворотке крови наряду с типировани-ем аллельных вариантов генов толл-рецепторов, позволяет своевременно предупредить развитие осложнений во время беременности, в том числе во втором триместре. Особенно значимым представляется тщательный сбор акушерско-гинекологического анамнеза и проведение исследования на этапах прегравидарной подго-
товки, что позволит провести своевременную профилактику нарушения течения беременности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абаева И. Ш., Баймурадова С. М., Бицадзе В. О. Роль провоспалительных цитокинов в патогенезе синдрома потери плода // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России. — М., 2008. — С. 3.
2. Баранов В. С., Айламазян Э. К. Определение наследственной предрасположенности к некоторым частым заболеваниям при беременности. — СПб.: Н-Л, 2009. — 66 с.
3. Гумилевский Б. Ю., Гумилевская О. П. // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. — 2010. — № 3 — С. 62—65.
4. Ковальчук Л. В., Ганковская Л. В., Ганковская О. А., и др. // ЖМЭИ. — 2008. — № 1. — С. 46—50.
5. Радзинский В. Е., Запертова Е. Ю., Мисник В. В. // Акушерство и гинекология. — 2005. — № 6. — С. 24—29.
6. Сидельникова В. М., Сухих Г. Т. // Мать и дитя: Материалы 5-го Рос. форума. — М., 2003. — С. 202—203.
7. Симбирцев А. С. // Иммунология. — 2005. — С. 68—77.
8. Abrahams V. M., Моg G. t // Placenta. — 2005. — Vol. 26. — P 540—547.
9. Fazelil A., Bruce С., Anumba D. O. // Human Reprod. — 2005. — Vol. 20 (5). — P 1372—1378.
10. Zhang D. Zhang G. Hoyden M. S., et al. // Science. — 2004. — Vol. 303. — P 1522.
Контактная информация
Питиримова Любовь Николаевна — аспирант, ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом ФУВ КЛД, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: Gatyzhskaya@mail.ru
34
Выпуск 2 (50). 2014
