CC BY
4УДК: 575.174.015.3
М.Е. Михайлова, Е.Л. Романишко
полиморфизм генов соматропиновой оси (pGH, pIGF-2, pIGF-1, pIGF-1R) у свиньи домашней (SUS SCROFA DOMESTICUS)
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, Академическая, 27
Введение
Каждый живой организм уникален, и его уникальность отражена в генетическом коде, носителем которого являются гены. Явление существования в популяции полиморфных локусов получило название генетического полиморфизма. Масштабы полиморфизма ДНК таковы, что между последовательностями ДНК двух особей существуют миллионы различий, которые и обуславливают их индивидуальные различия [1].
В основе полиморфизма ДНК лежат вставки, делеции и изменение числа тандемных повторов. Также причиной различий (полиморфизма) генов являются изменения отдельных нуклеотидов в молекуле ДНК, что приводит к изменению свойств гена. Функциональная значимость полиморфизмов связана с тем, что они расположены в кодирующих (экзоны, гены микроРНК и некоторые интроны, содержащие в себе гены микроРНК) и регуляторных (промоторы, энхансеры, инсуляторы) регионах ДНК. Вариации, затрагивающие кодирующие фрагменты генов и отражающиеся на аминокислотной последовательности их продуктов, встречаются относительно редко. Поэтому именно эти, наименее представленные типы полиморфизмов, являются предметом ассоциативных исследований генетиков [2, 3].
Одним из приоритетных направлений научно-технической деятельности в Республике Беларусь является получение особей животных, обладающих повышенной продуктивностью, и исследование генетических, физиологических и биохимических механизмов формирования продуктивности. С этой целью в мировой прак-
тике животноводства интенсивно внедряются методы маркер-сопутствующей селекции (MAS-селекции), которая является одним из современных направлений, сочетающих информацию о молекулярно-генетических полиморфизмах или маркерных генах (marker loci) с данными об их фенотипическом проявлении. Поиск потенциальных генов-кандидатов активно ведется среди генов, белковые продукты которых отвечают за проявление количественных признаков [4].
Известно, что на ростовые процессы организма влияет комплекс эндокринных, аутокринных и паратипических факторов. Наиболее важную роль в этих процессах играет гормон роста (GH - соматотропин). Регуляция синтеза гормона роста представляет собой многоуровневый каскад взаимодействий белок-рецепторов, тесно связанных между собой. Изменение, нарушение, и тем более выпадение любого из звеньев влечет за собой изменения в работе данной системы, которые могут привести к различиям в фенотипических проявлениях количественных признаков продуктивности у сельскохозяйственных животных.
Современная эффективная селекционно-племенная работа в свиноводстве требует проведения исследований, направленных на выявление полиморфизма потенциальных ДНК-маркеров у свиней различных пород в Республике Беларусь.
Цель данной работы заключалась в изучении полиморфизма генов гормонального ряда соматропиновой осирGH/MspI, pIGF-1/HhaI, рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI.
Материалы и методы
Исследован полиморфизм генов пролак-тинового рецептора рGH/MspI, pIGF-1/HhaI, рIGF-1R/SacII, рЮF-2/NciI, в выборке популяции (п = 134) хряков и свиноматок пород ландрас и йоркшир, белорусская крупная бе-
лая, белорусская черно-пестрая, разводимых в хозяйствах Республики Беларусь.
Ядерную ДНК выделяли из отщипа ушной раковины животных солевым методом [5]. Исследование фрагмента генов рGH/MspI, pIGF-1/
HhaI, рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI проводили руемом термоциклере С 1000™ Thermal Cycler. методом ПЦР-ПДРФ анализа. Амплификация Праймеры и режимы амплификации для каждого осуществлялась на автоматическом программи- гена для проведения ПЦР представлены в табл. 1.
Таблица 1
Праймеры и режимы полимеразной цепной реакции по генам соматропиновой оси
у свиньи домашней (Sus Scrofa domesticus)
Ген Последовательность праймеров Режим ПЦР
pGH/MspI F: 5-GCCAAGTTTTAAATGTCCCTG-3' R: 5-GTGTCCCTCCGGGATGTAG-3' «Горячий старт»: денатурация (95 °С - 5 мин.). 35 циклов: 95 °С -45 с, 57 °С - 45 с, 72 °С - 2 мин. Элонгация 10 мин. - 72 °С.
pIGF2/NciI (2 intron) F: 5-AGACTCTGTGCGGCGGGGAGCT-3' R: 5-CGAGTGCGGTCCCCAATGGAT-3' «Горячий старт»: денатурация (95 °С - 5 мин.). 35 циклов: 94 °С -30 , 68 °С - 30 с, 72 °С - 2 мин. Элонгация 10 мин. - 72 °С.
pIGF-1/HhaI F: 5-AGCCCACAGGGTACGGCTC-3' R: 5-CGAGTGCGGTCCCCAATGGAT-3' «Горячий старт»: денатурация (95 °С - 5 мин). 35 циклов: 94 °С -45 с, 59 °С - 45 с, 72 °С - 1 мин. Элонгация 8 мин - 72 °С.
pIGF-1R/SacII F: 5-AGCTATCTCTACCGGCATAA-3' R: 5-TCTCGAAGACCTTGCGGTACT-3' «Горячий старт»: денатурация (95 °С - 5 мин). 35 циклов: 94 °С - 30 с, 53 °С - 30 с, 72 °С - 45 мин. Элонгация 8 мин. - 72 °С.
В нашем исследовании мы изучили поли- длине рестрикционного фрагмента определя-морфизм генарGH/MspI. Амплификаты фраг- ли генотип животного (табл. 2). мента гена рGH подвергались рестрикции На рис. 1 представлены аллельные варианты эндонуклеазой MspI (Fermentas, Литва). По гена рGH/MspL
Таблица 2
Длина рестрикционнного фрагмента гена pGH/MspI в зависимости от генотипа особи
Генотип особи Величина рестрикционного фрагмента, п.н.
AA 222, 147, 137
AB 284, 222, 147, 137
ВВ 284, 222
Рис. 1. Аллельные варианты генарGH/MspIсвиньи домашней (Sus scrofa domesticus). Стрелками указаны длины рестрик-ционных фрагментов; М - маркер GeneRuler Low Range DNA Ladder #SM1191 ; АА, АВ, ВВ - генотипы животных
Амплификаты фрагмента гена pIGF-2 По длине рестрикционного фрагмента во 2 интроне подвергались рестрикции определяли генотип животного (табл. 3, эндонуклеазой NciI (Fermentas, Литва). рис. 2).
Таблица 3
Длина рестрикционнного фрагмента гена pIGF-2/NciI в зависимости от генотипа особи
Генотип особи Величина рестрикционного фрагмента, п.н.
AA 900, 450
АВ 900, 800, 450
ВВ* 800, 450
* - желательный генотип
А АА АВ ВВ ВВ АА М АА ВВ
В 900 п.н. H 800 п.н.
Щ 450 п.н.
Рис. 2. Аллельные варианты гена pIGF-2/ Neil свиньи домашней (Sus scrofa domesticus). M - маркер;
АА, AB, ВВ - генотипы животных
В данном исследовании мы также изучили полиморфизм гена pIGF-1/HhaI и рецептора инсулиноподобного фактора роста (pIGF-1R/ SacII) у разных пород свиней, разводимых в Республике Беларусь. Амплификаты фрагмента гена рIGF-1 и pIGF-1R подвергались
рестрикции эндонуклеазами HhaI и SacII (Fermentas, Литва). По длине рестрикционно-го фрагмента определяли генотип животного (табл. 4, 5). На рис. 3, 4 представлены аллельные варианты генов pIGF-1/Hha и pIGF-1R/ SacII.
Таблица 4
Длина рестрикционнного фрагмента гена рIGF-1/HhaI в зависимости от генотипа особи
Генотип особи Величина рестрикционного фрагмента, п.н.
AA 151, 28
АВ 151, 116, 35, 28
ВВ 116, 35, 28
Таблица 5
Длина рестрикционнного фрагмента гена pIGF-1R/SacII в зависимости от генотипа особи
Генотип особи Величина рестрикционного фрагмента, п.н.
AA 379
АВ 379, 235, 144
ВВ 235, 144
ВВ ВВ ВВ AB ВВ A M Е В ВВ BE KB В В
Рис. 3. Аллельные варианты генарIGF-1/HhaI свиньи домашней (Sus scrofa domesticus). М - маркер (FastRulerUltra Low Range DNA Ladder #SM1233); АА, AB, ВВ - генотипы животных; А - амплификат
Рис. 4. Аллельные варианты генарIGF-1R/SacII свиньи домашней (Sus scrofa domesticus). М - маркер (FastRulerUltra Low Range DNA Ladder #SM1233); АА, АВ, ВВ - генотипы животных
Результаты и обсуждение
Гормон роста - это полифункциональный эндогенный фактор, главная функция которого направлена на стимуляцию роста и развитие животного [9]. Ген гормона роста отвечает за синтез соматотропина. Ген рGH локализован на 12 хромосоме р1.4 и включает 5 экзонов и 4 интрона [6, 7, 8]. Кодирующая область состоит из пяти экзонов, общая площадь транскрипции, около 1,7 Кб. рGH - один из наиболее исследованных среди QTL-генов. Его можно
считать прямым молекулярно-генетическим маркером, поскольку он является структурным геном.
В нашем исследовании мы изучили полиморфизм фрагмента гена рGH/MspI длиной 506 п.о. Данные о распределении частот аллелей и генотипов по локусу гена рGH/MspI у хряков породы белорусская черно-пестрая (п = 17) представлены в табл. 6.
В выборке из популяции свиней белорусской
Таблица 6
Частоты аллелей и генотипов по локусу гена pGH/MspI
Предприятия Группа животных Количество особей Всего генотипов Частота генотипов, % Частота встречаемости аллелей
АА АВ ВВ АА АВ ВВ А В
СГЦ «Заречье, «Вихра», п/з «Ленино» Хряки 17 14 3 - 82,35 17,65 - 0,912 ±0,069 0,088 ±0,069
черно-пестрой породы выявлен полиморфизм гена рGH/MspI. Частота гомозигот АА-рGH/ MspI была выше, чем гетерозигот АВ-рGH/ MspI. Животных с гомозиготным генотипом ВВ-рGH/MspI выявлено не было. Аллель А встречался с частотой 0,912, а аллель В - 0,088.
У свиньи ген инсулиноподобного фактора роста-2 (рIGF2) локализован на 2-й хромосоме. Этот ген определен как ген-кандидат увеличения мышечной массы и отложения жира [10]. Ген IGF2 в геномах свиней может быть представлен несколькими аллельными вариантами, появление которых связано с одиночными нуклеотидными заменами во втором интроне (замена G^A), аллели А и В [11, 12]. Влияние полиморфизма, находящегося вне кодирующей области гена, на хозяйственно-ценные качества свиней объясняется способ-
Предпочтительным является генотип ВВ-рIGF-2/NciI. Согласно литературным данным, для популяции свиней крупной черной породы, отличающейся относительно высоким уровнем осаленности туши, характерны животные только с генотипом АА-рIGF-2/NciI, а в ультрамясной породе пьетрен аллель А не обнаруживается вовсе [11]. В нашем исследовании гено-
ностью аллеля дикого типа (О) связываться с репрессорными ядерными белками и, таким образом, подавлять транскрипцию гена IGF2. Замена нуклеотида ингибирует это взаимодействие, что в результате сказывается на экспрессии гена. В наследовании гена IGF-2 проявляется патернальный эффект - у потомства проявляется действие только отцовского аллеля, что значительно облегчает селекцию по данному гену, так как для достижения положительного эффекта у потомства достаточно тестировать только хряков.
В нашем исследовании изучена выборка из популяции (п = 174) хряков-производителей по гену рIGF-2/NciI (т№оп2). В табл. 7 приведены данные о распределении частот аллелей и генотипов рIGF-2/NciI в зависимости от породы свиньи.
тип ВВ-рIGF-2/NciI встречается с наибольшей частотой 80,49 % у хряков породы ландрас канадской селекции. И напротив, частота генотипа АА-рIGF-2/NciI была выше у пород крупная белая и йоркшир белорусской селекции и составляла соответственно 61,54% и 70%.
Инсулиноподобный фактор роста IGF-1 -еще один из важнейших представителей се-
Таблица 7
Частоты аллелей и генотипов гена pIGF-2/NciI в выборках популяций свиней
разных пород в Республике Беларусь
Порода Количество особей Всего генотипов Частота встречаемости генотипов, % Частота аллелей
АА АВ ВВ АА АВ ВВ А В*
Ландрас 41 1 7 33 2,44 17,07 80,49 0,110 0,890
Йоркшир 5 - 4 1 - 80,0 20,0 0,4 0,6
Белорусская крупная белая 26 16 6 4 61,54 23,08 15,38 0,731 0,269
Белорусская черно-пестрая 20 14 3 3 70,00 15,00 15,00 0,775 ±0,093 0,225 ±0,093
Белорусский заводской тип породы йоркшир 21 - 4 17 - 19,05 80,95 0,095 ±0,064 0,905 ±0,604
Всего 113 31 24 58 27,43 21,24 51,33 0,381 ±0,046 0,619 ±0,046
* - желательный аллель гена
мейства инсулиноподобных факторов роста, осуществляющих эндокринную, аутокринную и паракринную регуляцию процессов роста, развития и дифференцировки клеток и тканей организма. Инсулиноподобными эти факторы названы в связи с их способностью стимулировать поглощение глюкозы мышечной и жировой тканью аналогично инсулину. Одним из важных эффектов IGF-1 является стимуляция роста костей в длину. Рост-стимулирующий эффект гормона роста (GH) опосредуется IGF-гормонами, которые образуются под влиянием GH в печени и других тканях. Выделены два вида IGF: инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) и инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF-2). Это близкие по строению белки, сходные с проинсулином. IGF-1 и IGF-2 присутствуют в сыворотке крови преимущественно в виде комплексов со связывающими белками.
Как показал анализ генетической структуры популяций Sus Scrofa domesticus по гену pIGF-1/HhaI у свиней пород йоркшир и ландрас канадской селекции, полиморфизм по данному локусу гена рIGF-1/HhaI не выявлен. В популяциях свиней пород белорусская черно-пестрая и белорусская крупная белая был выявлен полиморфизм рIGF-1/ HhaI. Частота аллели А составила 0,022. Частота
Так же как и гормон роста, оба IGF действуют на гипоталамус и аденогипофиз по принципу обратной связи, контролируя синтез сомато-либерина и соматостатина и секрецию гормона роста. При низком уровне IGF-1 в крови секреция соматолиберина и соматотропина возрастает, при высоком - снижается. Таким образом, гормон роста осуществляет биологическое действие через секрецию соматоме-динов (IGF-1 и IGF-2), которые образуются в печени и других периферических тканях и являются посредниками анаболического и ростового влияния соматотропного гормона [13, 14]. Ген рIGF-1 у свиньи находится на хромосоме 5q23-24 [15].
В нашем исследовании изучена замена G201A в 3 экзоне рIGF-1/HhaL В табл. 8 пре-ведены данные о распределении частот аллелей и генотипов pLGF-1/HhaL.
генотипа АА-рIGF-1/HhaI равна 0,75 (п = 1), АВ-рIGF-1/HhaI соответственно равна 2,98 (п = 4).
Согласно литературным данным, аллель А рIGF-1/HhaI, является нежелательным и его частота превышает частоту аллеля В в популяции тибетских свиней. Аллель А предположительно связан с низкой скоростью роста у карликовых свиней [16].
Таблица 8
Частоты аллелей и генотипов гена рIGF-1/HhaI в выборках популяций свиней
разных пород в Республике Беларусь
Порода Количество особей Всего генотипов Частота встречаемости генотипов, % Частота аллелей
АА АВ ВВ АА АВ ВВ А В
Ландрас 40 - - 40 - - 100 - 1
Йоркшир 38 - - 38 - - 100 - 1
Белорусская крупная белая 26 - 2 24 - 7,69 92,31 0,038 ±0,038 0,962 ±0,038
Белорусская черно-пестрая 19 1 2 16 5,26 10,53 84,21 0,105 ±0,07 0,895 ±0,07
Белорусский заводской тип породы йоркшир 11 - - 11 - - 100 - 1
Всего 134 1 4 129 0,75 2,98 96,27 0,022 ±0,013 0,978 ±0,013
Ген, кодирующий рецептор инсулиноподоб-ного фактора роста-1 (рIGF1R), локализован на хромосоме 1 в области q1.7-p2.1 [17]. Ю-FIR состоит из 1367 остатков аминокислот. Ген рIGF1R - новый маркер для репродуктивных качеств свиноматок. Согласно результатам исследований польских ученых, у свиноматок с
генотипом ВВ приплод был выше по сравнению со свиноматками с генотипами АВ и АА [18].
В нашем исследовании мы изучили полиморфизм в 9 интроне локуса гена рIGF-1R/ SacII. Данные о распределении частот аллелей и генотипов по локусу гена рIGF-1R/SacII по отдельным хозяйствам представлены в табл. 9.
Таблица 9
Частоты аллелей и генотипов по локусу гена pIGF-1R/SacII
Предприятие Группа животных Порода Количество особей Всего генотипов Частота встречаемости генотипов, % Частота аллелей
АА АВ ВВ АА АВ ВВ А В
ОАО «Журавлиное» Свиньи Йоркшир 4 4 - - 100 - - 1 -
Ландрас 4 2 2 - 50 50 - 0,75± 0,216 0,25± 0,216
Хряки Йоркшир 1 1 - - 100 - - 1 -
Ландрас 1 1 - - 100 - - 1 -
В среднем по хозяйству 10 8 2 - 80 20 - 0,9± 0,095 0,1± 0,095
СГЦ «Заднепровский» Хряки Белорусская крупная белая 10 5 4 1 50 40 10 0,7± 0,145 0,3± 0,145
Всего 20 13 6 1 65 30 5 0,8± 0,089 0,978 ±0,013
Как показал генетический анализ, в выборке частота гетерозиготного генотипа (20%). Особей
из популяции свиней пород йоркшир и ландрас с гомозиготным генотипом ВВ-рЮF-1R/SacП об-
канадской селекции частота гомозиготного гено- наружено не было. У породы белорусская круп-
типа АА-рЮF-1R/SacП была выше (80%), чем ная белая выявлены все возможные генотипы.
Заключение
Изучен полиморфизм генов гормонального ряда соматропиновой оси рGH/MspI, pIGF-1/ ЕШ, рIGF-1R/SacII, рIGF-2/NciI. Определены частоты аллелей и генотипов изученных генов в выборках пород свиньи домашней, разводимых в Республике Беларусь. Изученные гены потенциально могут быть использованы в качестве маркеров. Такой подход является оправданным, когда выявленные
гены имеют функции, связанные с чертами, представляющими интерес в свиноводстве. Поэтому в дальнейшем нами планируется поиск ассоциаций аллельных вариантов изученных генов с хозяйственно-полезными признаками у свиньи домашней (Sus Scrofa domesticus).
Работа частично финансировалась грантом Б11-БРУ-014.
Список использов
1. Алтухов, Ю.П. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике / Ю.П. Алтухов, Е.А. Салменкова // Генетика. - 2002. - Т. 38, №, 9. - С. 1173-1195.
2. Ibeagha-Awemu, E.M. A critical analysis of disease-associated DNA polymorphisms in the genes of cattle, goat, sheep, and pig / E.M. Ibeagha-Awemu, P. Kgwatalala,
A.Е. Ibeagha, X. Zhao // Mamm. Genome. -2008. - V. 19. - P. 226-245.
3. Smith, C. The use of genetic polymorphisms in livestock improvement / C. Smith, S.P. Simpson // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 1986. - V. 103. - P. 205-217.
4. Калашникова, Л.А. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий / Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глаз-ко. - Московская обл, Лесные Поляны, ВНИИплем, 2000. - 31 с.
5. Miller, S. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S. Miller, D. Dykes, H.F. Polesky // Nucleic Acids Research. - 1988. - V. 16. - P. 12-15.
6. LI Jing. Identification and function of the growth hormone gene in Rongjiang pig of China / LI Jing, Ran Xue-Qin, Wang Jia-Fu // Acta Physiologica Sinica. - 2006. - V. 58 (3). -P. 217-224.
7. Location of the porcine hormone gene to chromosome 12p1.2~p1.5 / M. Yerle [et al.] // Journal of Animal Genetics. - 1993. - V. 24. -P. 129-131.
8. Growth hormone gene polymorphisms and growth performance traits in Duroc, Landrace and Tao-Yuan pigs / W.T.K. Cheng, C.H. Lee, C M. Hung, I.T.J. Chang, C M. Chen // Therio-genology. - 2000 - V. 54. - P. 1225-1237.
9. Балацкий, В.Н. Полиморфный BsuRI -сайт рестрикции гормона роста свиньи /
B.Н. Балацкий, К.Ф. Почерняев // Цитология и генетика. - 1995. - Т. 29, № 1. - С. 45-48.
10. An imprinted QTL with majoreffect on muscle mass and fat deposition maps to the IGF2
1нных источников
locus in pigs / C. Nezer, [et al.] // Nature Genetics. - 1999. - V. 21. - P. 155-156.
11. Балацкий, В.Н. Распеделение IGF2-аллелей и генотипов в породах свиней разного направления продуктивности / В.Н. Балацкий, Т.В. Овсяник // 7-я Международная научная конференция-школа: «Современные дости жения и проблемы биотехнологии сельско хозяйственных животных: роль нано технологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», БиоТехЖ. - 2008. -Дубровицы. - 2008. - C. 125-129.
12. A NciI PCR-RFLP within intron 2 of the porcine insulin-like growth factor 2 (IGF2) gene / A. Knoll [et al.] // Journal of Animal Genetics. - 2000. - V. 31. - P. 150-151.
13. Possible role of growth hormone, IGFs, and IGF-binding proteins in the regulation of ovarian function in large farm animals / D. Schams [et al.] / Domestic Animal Endocrinology. - 1999. - V. - 17. - P. 279-285.
14. Developmental expression and location of IGF-I and IGF-II mRNA and protein in skeletal muscle / D.E. Gerrard [et al.] // Journal of Anim. - 1998. V. 76. - P. 1004-1011.
15. Assignment of the gene for porcine insulinlike growth factor 1 (IGF1) to chromosome 5 by linkage mapping / A.K. Winteroe [et al. // Journal of Animal Genetics. - 1994. - V. 25. - P. 37-39.
16. Polymorphisms of the Porcine Growth Hormone Gene (pGH) in Tibet Pig / Zhang Hao [et. al.] // Acta Agriculturae Boreali-accidentalis Sinica. - 2010. - V. 19 (2). - P. 15-19.
17. Localization of IGF1R and EDN genes to pig chromosomes 1 and 7 by in situ hybridization / Y. Lahbib-Mansais, M. Yerle, J. Gellin // Cytogenetic Cell Genetics. - 1995. - V. 71 (3). -P. 225-227.
18. Terman, A. The IGF1R gene: A new marker for reproductive performance traits in sows? / A. Terman // Acta Agriculturae Scandinavica, Section A - Animal Science. - 2011. - V. 61. -P. 67-71.
Дата поступления статьи 14 декабря 2012 г.
