CC BY
5УДК 575.174.015.3
В.Н. Кипень1, А.О. Рябцева1, С.А. Котова1, Н.В. Журина2, А.И. Ганджа2, И.С. Цыбовский1
ОЦЕНКА ИНТРОГРЕССИИ ГЕНОВ СВИНЬИ ДОМАШНЕЙ (SUS SCROFA DOMESTICUS) В ГЕНОФОНД ДИКОГО КАБАНА (SUS SCROFA SCROFA) НА ОСНОВЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ MC1R И NR6A1
1Научно-практический центр Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь Республика Беларусь, 220114, г. Минск, ул. Филимонова, 25 2Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству Республика Беларусь, 222160, г. Жодино, ул. Фрунзе, 11
Методом ПЦР-ПДРФ исследован полиморфизм генов MC1R и NR6A1 у дикого кабана (n= 719) и свиньи домашней (n = 304, 6 пород). Уровень интрогрессии «домашних» генов в исследованной выборке дикого кабана по сайту c.367G>A гена MC1R составил 6,8 ± 0,9%; по сайту c.729G>A полиморфизм не выявлен. По гену NR6A1 уровень гибридизации составил 1,5 ± 0,5%. Породы белорусская мясная, ландрас, йоркшир, белорусская крупная белая относятся к свинье домашней типа А (ген MC1R). Для 12,5% особей породы дюрок установлен нетипичный для породы тип А. Порода белорусская черно-пестрая на 80% представлена типом А, на 5% — типом В и на 15% - типом А/В. В породах белорусская крупная белая и черно-пестрая выявляются аллели дикого типа, что может свидетельствовать об обратной интрогрессии генов — от дикого кабана к свиньям домашним.
Ключевые слова: гены MC1R и NR6A1, полиморфизм, интрогрессия, кабан дикий, свинья домашняя, гибридизация.
Введение
Дикий кабан становится ключевым видом многих европейских экосистем по причине стремительного увеличения численности в большинстве стран Европы [1]. Например, в соседней Польше поголовье дикого кабана удвоилось в течение 15 лет — с 118 000 особей в 2000 году до 264 000 особей в 2015 году [2]. В настоящее время этот вид достигает в Европе почти четырех миллионов особей и уже считается вредителем во многих регионах, оказывая влияние не только на экосистемы, но и на местную экономику. Действительно, дикий кабан может вызвать обширные повреждения сельскохозяйственных культур, лесных угодий и растительности пастбищ, а также провоцировать столкновения транспортных средств и другие проблемы в урбанизированных регионах [3, 4].
Домашний аналог дикого кабана — свинья домашняя — считается одним из самых ценных одомашненных животных, имеющих важное экономическое значение. Приручение способствовало появлению новых фенотипи-ческих и поведенческих признаков у одомаш-
ненных животных по сравнению с их дикими предками, тем не менее между кабаном и свиньей домашней в Европе сохранилось тесное генетическое сходство [5-8]. Дикий кабан может свободно скрещиваться с домашними свиньями в естественных условиях с рождением плодовитого потомства. В настоящее время интрогрессия генов свиньи домашней в генофонд диких кабанов подтверждена многими исследованиями и не оспаривается [9-11].
Активно обсуждаемыми аспектами остаются количественная оценка уровня интрогрессии «домашних» генов, причины гибридизации, наличие обратного потока генов от диких к домашним животным, физиологические, экологические и т. п. последствия взаимной интрогрес-сии генов между дикой и домашней формами. Предполагается, что генетическая интрогрес-сия от домашних свиней в генофонд диких кабанов, показанная рядом авторов [12, 13], может быть причиной возникновения различных поведенческих и физиологических эффектов (например, изменения репродуктивных моделей), поскольку изменяет такие видовые характери-
стики дикого кабана, как скорость размножения и его иммунные реакции [10, 11].
В условиях отсутствия естественных хищников основным фактором, сдерживающим рост численности кабана, является охота. Незаконная охота, в том числе на кабана, относится к правонарушениям, за которые субъекты незаконной охоты несут административную, уголовную и иную ответственность в соответствии с законодательными актами. При этом с неизбежностью должен быть установлен сам факт добычи дикой (свободно живущей) особи, что в условиях повсеместного распространения мясопродуктов из свиньи домашней представляет непростую задачу для судебных экспертов. Для генов MCR1 и NR6A1 ранее было показано наличие устойчивых различий между дикими и домашними формами кабана, что позволяет использовать их как ДНК-маркеры при дифференциации биологических образцов дикого кабана и домашней свиньи [14].
В данной работе проведено сравнительное исследование полиморфизма генов MCR1 и NR6A1 в популяциях дикого кабана и в выборках пород свиньи домашней, обитающих/ разводимых на территории Республики Беларусь. Прикладной задачей исследования являлось выявление молекулярных различий данных генов, достаточных для дифференциации биологических образцов свиней по типу «дикий»/«домашний», в ходе их судебно-экспертного исследования в Республике Беларусь.
Ген MC1R (the melanocortin-1 receptor, NCBI Gene ID 494018), отвечающий за выработку меланина, у дикого кабана и свиньи домашней хорошо изучен на молекулярном уровне. Было показано, что фенотипическое проявление основных идентифицированных аллелей гена MC1R связано с различной окраской волосяного покрова и кожи животных (черной, пятнистой, рыжей); анализ последовательности гена позволил выявить несколько дополнительных аллельных вариантов [15].
Дикий тип аллелей гена MC1R идентифицируется исключительно у диких кабанов, в то время как у свиней домашних имеются другие варианты аллелей, отличные от дикого типа [16].
Другим признаком, который отличает диких кабанов и европейские промышленные породы свиней, является число позвонков: 19 у кабана и 21-23 у представителей современ-
ных пород. Мутантный аллель гена NR6A1 (the nuclear receptor subfamily 6, group A, member 1, NCBI Gene ID 100038028) обнаружен у большинства европейских промышленных пород свиней, тогда как в популяции диких кабанов выявляется только аллель дикого типа.
Гены MC1R и NR6A1 влияют на фенотипиче-ски выраженные признаки — цвет шерсти и количество позвонков у Sus scrofa, соответственно, в связи с чем оба гена были подвергнуты длительному жесткому отбору как во время приручения, так и в природе. Например, маскировочный окрас в естественной среде обеспечивал большие шансы на выживание [15, 17].
Материалы и методы
Исследование полиморфизма генов MC1R и NR6A1 у дикого кабана проводили на основе коллекционных образцов мышечной и/или хрящевой ткани животных. Коллекция образцов диких животных была сформирована в осенне-зимние охотничьи сезоны 2010-2011 гг. при содействии Министерства лесного хозяйства Республики Беларусь, Республиканского государственного общественного объединения «Белорусское общество охотников и рыболовов» и Государственной инспекции охраны животного и растительного мира при Президенте Республики Беларусь во исполнение поручения Совета министров № 06/226-189 от 07 июня 2010 г. Выборка диких кабанов представляла собой в общей сложности 719 образцов из различных регионов Республики Беларусь (рис. 1).
Коллекция образцов ДНК свиньи домашней (n = 304, 6 пород: белорусская крупная белая, белорусская мясная, белорусская черно-пестрая, йоркшир, ландрас, дюрок) предоставлена РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству».
ДНК из образцов мышечной и хрящевой ткани диких кабанов выделяли по общепринятой методике, основанной на высвобождении нуклеиновых кислот в ходе инкубации образцов при 37 °С в течение 18-20 часов в лизиру-ющем буфере, содержащем 2% додецилсуль-фата натрия (SDS), 20 мМ Tris-HCl, 100 мМ NaCl, 20 мМ EDTA, pH 7,5 и протеиназу К в конечной концентрации 50 мкг/мл. Очистку препарата ДНК проводили с использованием силикагеля по методике, описанной в работе Boom R и др. [18].
Рис. 1. Места сбора образцов дикого кабана (административные районы); цифрами обозначено количество
исследованных образцов кабана
Дифференциацию биологических образцов по происхождению от диких или домашних особей кабана проводили на основе различий длин фрагментов, полученных при рестрикции продуктов амплификации генов MC1R или #^6^7(полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, ЩР-ПДРФ) [14].
Для амплификации участков генов MC1R и NR6A1 использовали 10 мМ Трис-HCl буфер рН 8,8, содержащий 50 мМ KCl, 0,08% Nonidet P40, 3,0 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из дезок-синуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), 0,08 мкМ каждого из пары праймеров, 0,2 ед. SynTaq-полимеразы (ООО «Синтол», РФ) и 10 нг ДНК; конечный объем смеси составил 15 мкл. Реакцию проводили в контролируемых температурных условиях на тер-моциклере iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) в следующем режиме: инициальная денатурация — 95 оС, 15 с; амплификация — 35 циклов [денатурация 95 оС, 5 с; отжиг праймеров 56 оС, 20 с, элонгация 72 оС, 40 с]; финальная элонгация — [72 оС, 300 с]. Эффективность ПЦР контролировали гель-электрофорезом в 2,0% агарозном геле.
В работе использовали олигонуклеотиды, смоделированные при помощи онлайн-серви-
са NCBI/Primer-BLAST© (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/tools/primer-blast/). Информация об условиях экспериментального исследования полиморфных вариантов генов MC1R и NR6A1 методом ПЦР-ПДРФ представлена в табл. 1.
Реакцию рестрикции проводили в трех отдельных пробирках с использованием эндону-клеазы рестрикции BspHI для сайта c.367G>A гена MCiR, эндонуклеазы рестрикции BstUI для сайта c.729G>A гена MC1R и эндонуклеазы рестрикции MspI для сайта g.299084751C>T гена NR6A1 согласно протоколам производителя (Thermo Scientific Fermentas, EU — для BspHI и BstUI; NEB, США — для MspI) с модификациями при 37 °С в течение 2 часов. Регистрацию результатов рестрикции осуществляли путем разделения полученных фрагментов в 8% полиакриламидном геле в течение 1,5-2,5 часов при постоянном напряжении 220 V с последующей детекцией флуоресценции комплекса ДНК с интеркалирующим красителем (бромистый этидий) в ультрафиолетовом свете.
Статистический анализ был проведен с использованием программы SPSS v.20.0 (IBM, США). С помощью критерия х2 было определено соответствие частот встречаемости аллелей закону Харди-Вайнберга.
Таблица 1
Последовательности олигонуклеотидов для амплификации участков генов МС1Я и N.Я6Л1,
ферменты и диагностируемые генотипы
Ген, полиморфизм Последовательность олигонуклеотида 5'>3' T , oC m' Эндонуклеаза рестрикции Диагностируемые генотипы (фрагменты рестрикции, п. н.)
MC1R c.367G>A F: 5'-TACTACTTCGTCTGCTGCCT-3' R: 5'-GCGCGTAGAAGATGGACAC-3' 58,16 58,71 BspHI GG (229) GA (90,139,229) AA (90,139)
MC1R c.729 G>A F: 5'-TCATCGCCTACTACCACCAC-3' R: 5'-AGATGACGAGGGCCAGAAAG-3' 58,89 59,46 BstUI GG (147,183) GA (147,183,330) AA (330)
NR6A1 g.299084751C>T F: 5'-AGGATTATGTCTGGGCAGGA-3' R: 5'-GTGATCCCTAGATGACCCCT-3' 57,80 57,59 MspI CC (66,113) CT (66,113,179) TT (179)
Результаты и обсуждение
Проблема дифференциации биологических образцов диких и домашних свиней первоначально вытекала из необходимости контроля качества мясопродуктов. Мясо дикого кабана по своим свойствам (низкое содержание жиров, большее количество полиненасыщенных жирных кислот, отсутствие гормонов и антибиотиков и т. д.) относится к деликатесной продукции, в связи с чем возникает интерес в подмене его более дешевым мясом свиньи домашней [14, 16]. Обеспечение здоровой и безопасной продукции и борьба с мошенничеством требовала разработки методик контроля, которые, как оказалось, позволяют изучать природные процессы фундаментального характера.
В настоящее время исследования процесса гибридизации дикой и домашней форм кабана проведены во многих странах, поскольку становится понятен масштаб экономических и управленческих последствий, сопутствующих гибридизации внутри вида Sus scrofa. Методические подходы для дифференциации биологических образцов диких и домашних свиней экспериментально обоснованы и не представляют сложности.
Дифференциацию биологических образцов на «дикие» или «домашние» проводили методом ПЦР-ПДРФ, как описано в работе [14], с модификацией: смоделированные нами прай-меры позволяли получать исходные ампли-коны и рестрикты с удобными для анализа размерами (табл. 1). Типичные результаты ре-
стрикции ампликона гена ЫСШ эндонуклеа-зами рестрикции BstUI для сайта c.729G>A и BspHI для сайта c.367G>A у различных представителей вида Кабан приведены на рис. 2.
Коллекция образцов дикого кабана формировалась в 2010-2011 годах, когда популяция дикого кабана, обитающая на территории Беларуси, находилась на пике численности. Формирование коллекций проводили с учетом наличия в том или ином регионе лесных массивов как среды обитания дикого кабана (рис. 1). Суммарно в Гомельской области отобрано 67 образцов дикого кабана, в Минской области — 98 шт., в Витебской области — 133 шт., в Могилевской области — 141 шт., в Гродненской области — 132 шт., в Брестской области — 148 шт.
В результате генотипирования 719 образцов дикого кабана по полиморфным сайтам c.367G>A и c.729G>A гена МСЖ и сайту g.299084751C>T гена Ш6А1 были получены результаты, представленные в табл. 2.
В общем итоге в коллекции из 719 образцов дикого кабана для полиморфного варианта гена МС1Я c.367G>A установлено наличие только двух генотипов — GG и GA. При этом аллель «^» в данной выборке является мажорным и встречается с частотой 96,6%. Из 719 образцов дикого кабана для 49 особей в полиморфном сайте c.367G>A был определен генотип GA — профиль, характерный для гибридов дикого кабана и свиньи домашней типа А. Распределение гибридных особей по территории республики приведено в табл. 3.
08*.в 08 1Л О«*. А/В \\В \\В
<-> <-> <-> <-> <->
330
229 183 147 —> —> —> кМ кМ и м и-
139
90
1 234567 89 10
Рис. 2. Электрофоретическое разделение рестриктов гена МС1К для пяти выявленных генотипов: свинья домашняя, тип В; свинья домашняя, тип А; гибрид свинья домашняя, тип А / свинья домашняя, тип В; гибрид
дикий кабан/ свинья домашняя типа А; дикий кабан 1,2 — свинья дом. тип В: 1 — рестриктаза BstUI (330 п. н.); 2 — рестриктаза BspHI (229 п. н.); 3,4 — свинья дом. тип А: 3 — рестриктаза BstUI (147/183 п. н.); 4 — рестриктаза BspHI (90/139 п. н.); 5,6 — гибрид свинья дом. тип А/ свинья дом. тип В, 5 — рестриктаза BstUI (147/183/330 п. н.); 6 — рестриктаза BspHI (90/139/229 п. н.); 7,8 — гибрид дикий кабан/ свинья дом. тип А; 7 — рестриктаза BstUI (147/183 п. н.); 8 — рестриктаза BspHI (90/139/229 п. н.); 9,10 — дикий кабан, 9 — рестриктаза BstUI (147/183 п. н.); 10 — рестриктаза BspHI (229 п. н.)
Таблица 2
Результаты исследования полиморфизма генов ЫСШ и NR6A1 в выборке дикого кабана
Генотипы Полиморфный сайт
Ген МС1Я Ген NR6A1
c.367G>A c.729G>A g.299084751C>T
Ген МС1К
вв 670 (93,2%) 719 (100%)
GA 49 (6,8%) -
АА - -
аллель
в 96,6% 100%
А 3,4% -
Таблица 3
Распределение гибридных особей с генотипом c.367_GA (MC1R) по областям республики
Продолжение табл. 2
Генотипы Полиморфный сайт
Ген MC1R Ген NR6A1
c.367G>A c.729G>A g.299084751C>T
Ген NR6A1
CC 708 (98,47%)
CT 7 (0,097%)
ТТ 4 (0,056%)
аллель
C 99,0%
Т 1,0%
Область Кол-во образцов, шт. Кол-во особей с генотипом c.367_GA, шт. Частота особей с генотипом c.367_GA, %
Минская 98 5 5,1
Витебская 133 8 6,0
Гродненская 132 8 6,1
Брестская 148 10 6,8
Могилевская 141 12 8,5
Гомельская 67 6 9,0
Всего 719 49 6,8
Для полиморфного сайта c.729G>A у дикого кабана показано наличие только одного генотипа — вО. Следует отметить, что в белорусской популяции кабанов также не выявлен полиморфизм в позиции c.727G>A данного гена, как это показано для диких кабанов севера Италии [14]. При наличии замены в позиции c.727G>A ПЦР-продукт генаМС1Я 330 п. н. не будет расщепляться эндонуклеазой BstUI (тетрануклео-тидный сайт узнавания Св|Св), как это бывает у свиньи домашней типа В. В результате исследования для всех животных из коллекции диких кабанов в сайте c.729G>A были установлены генотипы вв, типичные для дикой формы Кабана.
Распределение генотипов для полиморфных вариантов c.367G>A соответствовало равно-
весию Харди-Вайнберга (Hardy-Weinberg equilibrium) — уровень статистической значимости равен p = 0,34.
По полиморфному сайту g.299084751C>T гена NR6A1 в результате генотипирования 719 образцов дикого кабана для 11 особей был определен аллель «Т», характерный для свиней домашних. При этом аллель «С» распространен в данной выборке с частотой 99,0%, т. е. является мажорным.
Основные результаты исследований диких кабанов в Европе обобщены в табл. 4.
Наличие свободно живущих особей, гибридных по гену MC1R, показано для всех стран. По литературным данным, для таких стран, как Испания, Люксембург, Португалия, Румыния,
Таблица 4
Результаты исследования полиморфизма генов ЫСШ и NR6A1 в выборках диких кабанов в
странах Европы
Географическо е происхождение образцов Кол-во образцов Распределение генотипов Ссылка на исследование
МС1Я с.3670>А МС1Я с.7290>А Ж6Л1 g.299084751C>T
Беларусь 719 вв (670/719) Ав (49/719) вв (719/719) СС (708/719) СТ (7/719) ТТ (4/719) Собственные исследования
Болгария 291 вв (245/291) Ав (33/291) АА (13/291) вв (291/291) - [19]
Италия 62 вв(59/62) Ав (2/62) АА (1/62) вв (62/62) - [20]
Греция 119 вв (113/119) Ав (6/119) вв (113/113) - [12]
Польша 265 вв (200/265) Ав (59/265) АА (6/265) вв (265/265) - [2]
Италия 111 вв (97/111) Ав (14/111) вв (104/111) Ав (7/111) СС (107/111) СТ (4/111) [14]
Словения, запад. часть Балканского пол-ва 90 вв (67/90) Ав (22/90) АА (1/90) вв (90/90) СС (79/90) СТ (10/90) ТТ (1/90)
Италия 33 вв (33/33) вв (33/33) СС (29/33) СТ (4/33) [21]
Сардиния, Италия 21 вв (18/21) Ав (1/21) АА (2/21) вв (21/21) СС (21/21)
Франция, Хорватия и Швеция экспериментально наличие гибридных особей не подтверждено или выявлены единичные гибридные особи [16, 21], однако это скорее следствие незначительных объемов исследованных выборок (от 6 до 15 особей).
В работе Сапи А. [21] при исследовании 10 образцов из Беларуси установлены 2 особи гибридного происхождения (т. е. 20% от исследованных). Однако результаты наших исследований не подтверждают такой высокий уровень интрогрессии генов свиней домашних в генофонд диких кабанов в Беларуси. При среднем значении уровня интрогрессии по сайту c.367G/A гена ЫСШ, равном 6,8 ± 0,9%, наибольшее количество гибридов (вА)
отмечено в Гомельской области (9,0%), наименьшее — в Минской области (5,1%). Проведенным исследованием установлено, что популяция диких кабанов (п = 719) включает 49 гибридных особей, причем все гибридные особи (генотип GA) происходят от свиньи домашней типа А.
Результаты исследований полиморфизма гена ЫСШ в различных странах иллюстрирует рис. 3 (показаны результаты исследований, в которых п > 20).
Таким образом, уровень интрогрессии «домашнего» аллеля гена МСШ в генофонд дикого кабана, обитающего на территории Республики Беларусь, сопоставим с таковым для Греции [12] — менее 8%.
Словения, запад, часть Балканского пол-ва
Болгария
Сардиния, Италия
Италия
л
i-1
Польша ■ 1 ■
Греция ■ 1 ■
Беларусь 1 1
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Частота гибридных особен, % Рис. 3. Доля (в %) гибридных особей среди популяций дикого кабана по гену МС1Я; указан диапазон значения
95% доверительного интервала для расчетных значений
Уровень интрогрессии «домашних» аллелей в популяцию дикого кабана по гену NR6A1 на территории Республики Беларусь составляет 1,5 ± 0,5%. Наибольшее значение зафиксировано в Гродненской области (3,0%), а в Витебской и Гомельской областях для всех особей установлен только «дикий» генотип СС. Появление «домашнего» генотипа (ТТ) у 4 особей диких кабанов, скорее всего, является результатом скрещивания свободно живущих гибридных особей (Е Е и т. п.) и не связано с одичанием особей свиньи домашней.
Распределение частот генотипов по сайту g.299084751C>T гена ЫЯ6Л1 не соответствовало равновесию Харди-Вайнберга (HWe), однако установленные в выборке диких кабанов частоты аллелей — С (99%), Т (1,0%) — не позволяют с уверенностью отнести данный сайт к категории полиморфных.
Ввиду незначительного количества работ, посвященных оценке гибридизации по гену NR6A1, диапазоны интрогрессии в данном гене не поддаются критическому анализу. Только для двух стран — Словении (п = 90, включая западную часть Балканского полуострова) и Италии (п = 144) - показано, что уровни гибридизации находятся в диапазоне 12,2 ± 3,5% и 5,6 ± 1,9% соответственно [14, 21].
Соотношение уровней гибридизации по гену МС1Я и гену ЫЯ6Л1по результатам исследований диких кабанов в трех станах (регионах)
с относительно большими объемами анализируемых выборок приведены на рис. 4.
При исследовании полиморфизма генов MC1R и NR6A1y свиньи домашней получены следующие результаты (табл. 5).
Исходя из номенклатуры Fajardo V. и др. [16], для свиньи домашней типа А характерен генетический профиль — С.367АА / C.729GG; а для свиньи типа В — C.367GG / C.729AA.
Для пород белорусская мясная, ландрас и йоркшир показаны генотипы свиньи домашней типа А (сайты c.367G>A и c.729G>A гена MC1R). Для 49 из 50 животных породы белорусская крупная белая, т. е. в 98% случаев, также показан генетический профиль, характерный для свиньи домашней типа А. По гену NR6A1 генотипы свиньи домашней (TT) по сайту g.299084751C>T гена NR6A1 установлены для 5 пород (белорусская мясная, дюрок, белорусская черно-пестрая, ландрас, йоркшир); гибридная форма (CT) выявлена только у представителей породы белорусская крупная белая (6%, 3/50).
Однако для пород дюрок и белорусская черно-пестрая по гену MC1R выявлено более разнообразное сочетание генотипов. Так, для 9 особей (12,5%) породы дюрок был показан генетический профиль, характерный для свиньи домашней типа А, для 62 (86%) — характерный для свиньи домашней типа В, и для одного животного — характерный для дикого
'Н
ф
«о с и
о %
X
ю
н
и
п н о N и
32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10
6 4 2 0
I.
| МС1 к N116 А|
Беларусь
Италия Словения, запад, часть Балканского пол-ва
Рис. 4. Распространенность гибридных особей дикого кабана в зависимости от полиморфизма генов МС1К и
ЫК6Л1 (по данным [14, 21])
Таблица 5
Результаты исследования полиморфизма генов МСШ и NR6A1 в выборке домашних свиней
Порода домашней свиньи Ген МС1Я Ген Ж6Л1
Генотип/ аллель Сайт ^3670^ Сайт ^ 729в>Л Генотип/ аллель Сайт g.299084751C>T
Белорусская крупная белая, п = 50 вв - 49 (98,0%) СС -
GA - 1 (2,0%) СТ 3 (6,0%)
AA 50 (100%) - ТТ 47 (94,0%)
аллель в - 99,0% аллель С 3,0%
аллель A 100% 1,0% аллель Т 97,0%
Белорусская мясная, п = 53 вв - 53 (100%) СС -
GA - - СТ -
AA 53 (100%) - ТТ 53 (100%)
аллель в - 100% аллель С -
аллель A 100% - аллель Т 100%
Белорусская черно-пестрая, п = 20 вв 1 (5,0%) 18 (90,0%) СС -
GA 3 (15,0%) - СТ -
Продолжение табл. 5
Порода домашней свиньи Ген МС1Я Ген Ж6Л1
Генотип/ аллель Сайт с.367в>А Сайт с. 7290>А Генотип/ аллель Сайт g.299084751C>T
Белорусская черно-пестрая, п = 20 АА 16 (80,0%) 2 (10,0%) ТТ 20 (100%)
аллель в 12,5% 90,0% аллель С -
аллель А 87,5% 10,0% аллель Т 100%
Дюрок, п = 72 вв 63 (87,5%) 10 (13,9%) СС -
вА - - СТ -
АА 9 (12,5%) 62 (86,1%) ТТ 72 (100%)
аллель в 87,5% 13,9% аллель С -
аллель А 12,5% 86,1% аллель Т 100%
Ландрас, п = 54 вв - 54 (100%) СС -
вА - - СТ -
АА 54 (100%) - ТТ 54 (100%)
аллель в - 100% аллель С -
аллель А 100% - аллель Т 100%
Йоркшир, п = 55 вв - 55 (100%) СС -
вА - - СТ -
АА 55 (100%) - ТТ 55 (100%)
аллель в - 100% аллель С -
аллель А 100% - аллель Т 100%
кабана (с.367 вв, с.729 вв). Американская порода дюрок приобретена для селекционных целей и выявление в поголовье данной породы 9 особей с генотипом, характерным для свиньи домашней типа А, противоречит литературным данным [2, 14, 22]. Тот факт, что все особи с генотипами, нетрадиционными для породы дюрок, происходят из одного хозяйства, позволяет предположить, что нетипичные для породы дюрок генотипы являются следствием неконтролируемого скрещивания особей породы дюрок со свиньями типа А: дальнейшее скрещивание гибридных потомков Г2 и т. д.) привело к формированию спектра выявленных генотипов. Вероятность образования «дикого» генотипа с.367вв,
с.729вв у домашней свиньи также возможна при скрещивании особей домашних свиней типов А и В между собой. Однако не исключен и эффект основателя в случае, если в результате закупки изначально была поставлена партия свиней породы дюрок, включающая особей с нетипичными генотипами.
Для породы белорусская черно-пестрая распределение животных по типам А и В имело следующий вид: 16 особей (80%) — тип А, 1 (5%) — тип В, 3 (15%) — тип А/В. В отличие от промышленных пород домашних свиней, порода белорусская черно-пестрая выведена путем спонтанного скрещивания местных пород с зарубежными, поэтому частично представляет народную селекцию свиньи до-
машней. Сложная композиция генотипов, выявленных у данной породы, может представлять след обратной интрогрессии генов — от дикого кабана к свиньям домашним. Возможность такого варианта гибридизации подтверждает выявление в группе особей промышленной породы белорусская крупная белая трех особей с «гибридным» генотипом CT в сайте g.299084751C>T (ген NR6A1), поскольку аллель «C» имеется только у дикого кабана.
Действительно, основной моделью интрогрессии «домашних» генов в генофонд дикого кабана считается гибридизация при полусвободном содержании домашних свиней, обеспечивающая возможность прямого контакта между дикими и домашними формами [2, 3, 8]. Адекватность такой модели подтверждают более высокие уровни интрогрессии в странах с мягким климатом. Например, для региона юго-восточной Европы (Словения и Западные Балканы), итальянской Сардинии и др. [14, 21]. Даже среди белорусских популяций дикого кабана выявляется тенденция к увеличению количества гибридов с севера на юг.
В последнее время показано, что значительный поток «домашних» генов в генофонд дикого кабана, хотя и локального характера, обеспечивает другая тенденция. В ряде работ отмечены факты преднамеренной гибридизации дикого кабана со свиньями при загонном содержании диких кабанов как объекта охоты или источника деликатесной продукции. Как правило, преднамеренное скрещивание проводится с целью получения «улучшенного» дикого кабана, с увеличенными плодовитостью и скоростью роста, что в ряде стран запрещено законодательно [2, 9, 11, 12]. Экспериментально показано, что уровень «домашних» генов у диких кабанов с загонным содержанием в ряде случаев значительно выше, чем в соседних популяциях свободно живущих диких животных.
Дополнительно нами было проведено исследование полиморфизма микросателлит-ных локусов всех 304 домашних свиней и 719 образцов дикого кабана (16 STR-локусов) и определены частоты аллелей в трех группах: у свиней домашних, у свободно живущих гибридных особей (n = 49) и у кабанов, несущих дикий тип гена MC1R [23]. Установлено, что распределение частот аллелей микросателлит-ных локусов у домашних свиней и диких ка-
банов достоверно различается, в то время как в гибридной и негибридной группах свободно живущих кабанов никаких различий не наблюдается. При оценке межгрупповой дифференциации (AMOVA) никаких следов дифференциации между дикими кабанами, несущими дикий тип гена, и кабанами с аллелями свиней домашних в гене MC1R не выявлено. Таким образом, в настоящее время естественная гибридизация между дикой и домашней формами кабана на территории Беларуси, скорее всего, не происходит, что подтверждается отсутствием статистических различий в аллельном спектре 16 микросателлитных локусов у гибридных и «чисто диких» групп животных.
Заключение
Показано, что популяции диких кабанов, обитающих на территории Беларуси, несут гены свиней домашних. Уровень интрогрес-сии «домашних» генов в генофонд диких кабанов составляет 6,8 ± 0,9% для гена MCR1 и 1,5 ± 0,5% для гена NR6A1, что значительно меньше, чем в популяциях диких кабанов из Центральной и Южной Европы или соседней Польши. Таким образом, дикие кабаны в Беларуси на пике численности в 2010-2011 годах в большей степени сохранили первоначальный «дикий» генофонд.
В генофонде пород белорусская крупная белая и белорусская черно-пестрая выявляется примесь аллелей дикого типа, что может служить указанием на существование обратного потока генов от диких кабанов к свиньям домашним. Исследованием полиморфизма 16 микросателлитных локусов показано отсутствие дифференциации между гибридными и негибридными свободно живущими особями дикого кабана, что указывает на отсутствие естественной гибридизации диких и домашних животных в ближайшем временном интервале. Развитие промышленного свиноводства с параллельной депопуляцией сельского населения минимизировали возможность контактов диких и домашних свиней, а массовый отстрел диких кабанов на фоне вспышки африканской чумы свиней в 2012-2013 годы резко снизил численность дикого кабана. В настоящее время для Беларуси более вероятным представляется миграционная модель поступления «домашних» генов [2], поскольку неоднократно
отмечена миграция стад диких кабанов с территории сопредельных государств, и при этом показано, что уровень интрогрессии «домашних» генов в генофонд диких кабанов в странах Европы существенно выше, чем в Беларуси.
Список использованных источников
1. Massei, G. Wild boar populations up, numbers of hunters down? A review of trends and implications for Europe: wild boar and hunter trends in Europe / G. Massei [et al.] // Pest Manag. Sci. — 2015. — Vol. 71, № 4 — P. 492-500.
2. Dzialuk, A. High domestic pig contribution to the local gene pool of free-living European wild boar: a case study in Poland / A. Dzialuk [et al.] // Mammal Res. — 2018. — Vol. 63, № 1 — P. 65-71.
3. Geisser, H. Efficacy of hunting, feeding, and fencing to reduce crop damage by wild boars / H. Geisser, H.-U. Reyer // J. Wildl. Manag. — 2004. — Vol. 68, № 4 — P. 939-946.
4. Massei, G. Too many hogs? A review of methods used to mitigate impact by wild boar and feral hogs. / G. Massei, S. Roy, R. Bunting // Human-wildlife Interact. — 2011. — № 5 — P. 79-99.
5. Larson, G. Ancient DNA, pig domestication, and the spread of the Neolithic into Europe / G. Larson // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2007. — Vol.104. — P.15276-15281.
6. Luetkemeier, ES. Multiple Asian pig origins revealed through genomic analyses / ES. Lu-etkemeier // Molecular Phylogenetics and Evolution. — 2010. — Vol.54. — P.680-686.
7. Ramirez, O. Integrating Y-Chromosome, Mitochondrial, and Autosomal Data to Analyze the Origin of Pig Breeds / O. Ramirez [et al.] // Mol. Biol. Evol. — 2009. — Vol. 26, № 9 — P. 2061-2072.
8. Scandura, M. Ancient vs. recent processes as factors shaping the genetic variation of the European wild boar: are the effects of the last glaciation still detectable? / M. Scandura [et al.] // Mol. Ecol. — 2008. — Vol. 17, № 7 — P. 1745-1762.
9. Frantz, A.C. Genetic evidence for introgres-sion between domestic pigs and wild boars (Sus scrofa) in Belgium and Luxembourg: a comparative approach with multiple marker systems: In-trogression Between Pigs and Boars / A.C. Frantz
[et al.] // Biol. J. Linn. Soc. — 2013. — Vol. 110, № 1 — P. 104-115.
10. Goedbloed, D.J. Genome-wide single nucleotide polymorphism analysis reveals recent genetic introgression from domestic pigs into Northwest European wild boar popula-tions: Introgression in wild boar / D.J. Goedbloed [et al.] // Mol. Ecol. — 2013. — Vol. 22, № 3 — P. 856-866.
11. Goedbloed, D.J. Reintroductions and genetic introgression from domestic pigs have shaped the genetic population structure of Northwest European wild boar / D.J. Goedbloed [et al.] // BMC Genet. — 2013. — Vol. 14, № 1 — P. 43.
12. Koutsogiannouli, E.A. Detection of hybrids between wild boars (Sus scrofa scrofa) and domestic pigs (Sus scrofa f. domestica) in Greece, using the PCR-RFLP method on melanocortin-1 receptor (MC1R) mutations / E.A. Koutsogiannouli [et al.] // Mamm. Biol. — Z. Für Säuget-ierkd. — 2010. — Vol. 75, № 1 — P. 69-73.
13. Scandura, M. Effects of human perturbation on the genetic make-up of an island population: the case of the Sardinian wild boar / M. Scandura [et al.] // Heredity. — 2011. — Vol. 106, № 6 — P. 1012-1020.
14. Fontanesi, L. Differentiation of meat from European wild boars and domestic pigs using polymorphisms in the MC1R and NR6A1 genes / L. Fontanesi [et al.] // Meat Sci. — 2014. — Vol. 98, № 4 — P. 781-784.
15. Fang, M. Contrasting Mode of Evolution at a Coat Color Locus in Wild and Do-mestic Pigs / M. Fang [et al.] // PLoS Genet. — 2009. — Vol. 5, № 1 — P. e1000341.
16. Fajardo, V. Differentiation of European wild boar (Sus scrofa scrofa) and domes-tic swine (Sus scrofa domestica) meats by PCR analysis targeting the mitochondrial D-loop and the nuclear melanocortin receptor 1 (MC1R) genes / V. Fajardo [et al.] // Meat Sci. — 2008. — Vol. 78, № 3 — P. 314-322.
17. Li, J. Artificial selection of the melanocor-tin receptor 1 gene in Chinese domestic pigs during domestication / J. Li [et al.] // Heredity. — 2010. — Vol. 105, № 3 — P. 274-281.
18. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 1990. — Vol. 28, № 3 — P. 495-503.
19. Nikolov, I.S. Population genetic structure of wild boar Sus scrofa in Bulgaria as revealed
by microsatellite analysis / I.S. Nikolov [et al.] // Acta Theriol. (Warsz.). — 2009. — Vol. 54, № 3 — P. 193-205.
20. Fulgione, D. Unexpected but welcome. Artificially selected traits may increase fitness in wild boar / D. Fulgione [et al.] // Evol. Appl. — 2016. — Vol. 9, № 6 — P. 769-776.
21. Canu, A. Lack of polymorphism at the MC1R wild-type allele and evidence of domestic allele introgression across European wild boar populations / A. Canu [et al.] // Mamm. Biol. -
Z. Für Säugetierkd. — 2016. — Vol. 81, № 5 — P. 477-479.
22. Dun, G. Variations of Melanocortin Receptor 1 (MC1R) Gene in Three Pig Breeds / G. Dun [et al.] // J. Genet. Genomics. — 2007. — Vol. 34, № 9 — P. 777-782.
23. Rebala, K. STR Profiling for Discrimination between Wild and Domestic Swine Specimens and between Main Breeds of Domestic Pigs Reared in Belarus / K. Rebala [et al.] // PLOS ONE. — 2016. — Vol. 11, № 11 — P. e0166563.
V.N. Kipen1, A.O. Rabcava1, S.A. Kotava1, N.V. Zhurina2, A.I. Handza2, I.S. Tsybovsky1
POLYMORPHISM ANALYSIS OF MC1R AND NR6A1 GENES TO EVALUATE THE LEVEL OF INTROGRESSION OF DOMESTIC SWINE (SUS SCROFA DOMESTICUS) GENES IN WILD BOAR (SUS SCROFA SCROFA) POPULATION
1 Scientific and Practical Centre of the State Forensic Examination Committee of the Republic of Belarus
Minsk, 220114, the Republic of Belarus 2Scientific and Practical Centre for Animal Breeding, NAS of Belarus Zhodino, 222160, the Republic of Belarus
MC1R and NR6A1 genes' polymorphism was studied in wild boar (n = 719) and domestic swine (n = 304, 6 breeds) using the PCR-RFLP method. The introgression level of "domestic" alleles in wild boar samples in the c.367G/A site of the MC1R gene was 6.8±0.9%; no polymorphism was identified in the c.729G>A site. The hybridization level was 1.5±0.5% by the NR6A1 gene. Belarusian Meat, Landrace, Yorkshire and Belarusian Large White breeds belong to the domestic swine of type A according to their genotype (MC1R gene). For 12.5% of Duroc breed individuals, type A not typical for the breed was established. 80% of the Belarusian Black Pied breed is represented by type A, 5% by type B and 15% by type A/B. Wild type alleles were detected in Belarusian Large White and Belarus Black Pied breeds suggesting the reverse allelic introgression of genes from wild boar to domestic swine.
Key words: MC1R gene, NR6A1 gene, polymorphism, introgression, wild boar, domestic pig, hybridization.
Дата поступления статьи: 30 ноября 2018 г.
