CC BY
3УДК 636.52/.58:575.113/.118
Р.А. Кулибаба
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ-БЕТА В ЛИНИЯХ КУР УКРАИНСКОЙ СЕЛЕКЦИИ
Институт животноводства НААН Украины Украина, 62404, Харьковская обл., Харьковский р-н, пгт. Кулиничи, ул. 7-ой Гвардейской армии, 3
Введение
Семейство трансформирующих ростовых факторов-бета (TGF-в) относится к одной из наиболее важных групп генов, принимающих участие в регуляции основных физиологических функций организма [1]. Биологические функции кодируемых данными генами белков у птиц схожи с таковыми у млекопитающих [2]. Члены семейства TGF-в относятся к мультифункциональ-ным сигнальным протеинам, играющим важную роль в поддержании тканевого гомеостаза, роста и дифференцировки различных типов клеток, формировании межклеточного матрикса, являются индукторами апоптоза, участвуют в регуляции иммунной системы и т.д. Обладают как паракринной, так и аутокринной активностью. Несмотря на наличие различных типов трансформирующих факторов роста в (TGF-P1, TGF-P2 и TGF-в3), механизм их действия (сигнальный каскад) во многом совпадает [3].
Долгое время считалось, что в отличие от млекопитающих, у птиц имеется 4 изоформы трансформирующих ростовых факторов-бета -TGF-в1, TGF-в2, TGF-в3 и TGF-p4 [4, 5, 6]. Однако в работе На1рег J. с соавторами показано, что аминокислотные последовательности TGF-в4 птиц и TGF-в1 млекопитающих совпадают на 82 %. При этом TGF-в1 как таковой у птиц не идентифицирован. Более того, функциональная активность TGF-в4 у птиц подобна TGF-в1 у млекопитающих. Вследствие чего авторы делают вывод, что TGF-в4 птиц является ортологом человеческого TGF-в1. Таким образом, эволю-ционно существуют только три изоформы TGFв
как у млекопитающих, так и у птиц, TGF-в4 как таковой не существует и является ничем иным как TGF-P1 [7]. Однако, несмотря на это, до сих пор в некоторых публикациях указывают наличие четырех изоформ TGF-P у птиц [8].
Каждый из членов семейства TGF-в кодируется отдельным геном. Так ген TGF-в1 локализован в 13 хромосоме, содержит в своем составе 17 экзонов; TGF-P2 локализован в 3-й хромосоме, содержит 7 экзонов; TGF-в3 - в 5-й хромосоме и содержит 6 экзонов.
Показана связь различных аллельных вариантов генов семейства TGF-в с продуктивными признаками кур, что делает семейство TGF-в перспективным для проведения направленной селекции. Так, например, полиморфизм гена TGF-в3 ассоциирован с показателями живой массы, прироста и т.д. Показано, что генотип ВВ положительно коррелирует с повышенной массой тела на 6 и 8 неделе у мясных кур [9]. В свою очередь, аллельные варианты TGF-P1 коррелируют с массой селезенки, размером берцовой кости и т.д. [4].
Также показана связь аллельных вариантов TGF-P2 и TGF-в3 с устойчивостью кур к саль-монеллезу, что предположительно связано с участием TGF-в в регуляции функций иммунной системы [10].
Исходя из вышеизложенного, цель настоящей работы - изучение полиморфизма генов семейства трансформирующих ростовых факторов-бета в популяциях кур украинской селекции различных направлений продуктивности.
Материалы и методы
Исследования проводили в лаборатории профилактики заболеваний птицы и молекулярной диагностики отдела птицеводства Института животноводства Национальной академии аграрных наук Украины.
Для проведения исследований была использована птица отечественной селекции - куры мясо-яичные породы белый плимутрок линия Г-2 (п = 100), куры яичные породы борковская барвистая линия А (п = 100), куры яично-
мясные породы полтавская глинистая линия 14 (n = 99). От каждой особи был отобран биологический материал (кровь) на экспериментальной птицеферме «Сохранение государственного генофонда Института животноводства Национальной академии аграрных наук Украины».
Кровь отбирали из гребня с помощью скарификатора на стерильную фильтровальную бумагу. Каждый образец подсушивали, маркировали и индивидуально упаковывали для предотвращения контаминации. Выделение ДНК из опытных образцов проводили с помощью коммерческого набора реагентов «ДНК-сорб-В» (АмплиСенс, Россия). Эффективность выделения ДНК определяли с помощью электрофореза в 0,7%-ном агарозном геле при 200 В в течение 5 мин.
Для проведения амплификации использовали следующие праймеры:
TGF-ß1 - F:5'-GGGGTCTTCAAGCTGAGC GT-3' и R:5'-TTGGCAATGCTCTGCATGTC-3';
TGF-ß2 - F:5'-GCCATAGGTTCAGTGCA AG-3' и R:5'-TGACAGAAGCTCTCAAGCC-3';
TGF-ß3 - F:5'-TCAGGGCAGGTAGAGGGT GT-3' и R:5'-GCCACTGGCAGGATTCTCAC-3' [4].
Амплификацию проводили с использованием реагентов DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific) с использованием программируемого термоциклера «Терцик» (ДНК-технология, Россия) по соответствующим программам: 1 цикл - денатурация 94 °C 3 мин; 35 циклов - денатурация 94 °C 1 мин, отжиг 1 мин (65 °C для TGF-ß1; 52 °C для TGF-ß2; 64 °C для TGF-ß3), элонгация 72 °C 1 мин; 1 цикл -финальная элонгация 72 °C 10 мин. Объем конечной смеси составил 20 мкл, концентрация праймеров - 0,2 мкмоль в каждом случае.
Обработку амплифицированных фрагментов проводили эндонуклеазами рестрикции MboII, RsaI и BslI согласно стандартным методикам производителя (Thermo Scientific). Продукты рестрикции разделяли в 1,5%-ном агарозном геле при напряжении 150 В в течение 40 мин и в 6%-ном полиакриламидном геле при на-
пряжении 250 В в течение 180 мин. Визуализацию проводили с использованием бромистого этидия в ультрафиолетовом спектре. При использовании полиакриламидного геля проводили окрашивание серебром. Размер рестрикционных фрагментов определяли с использованием маркера молекулярных масс М-50 (Изоген, Россия).
Генотипирование по каждому из локусов проводили посредством анализа полученных электрофореграмм.
Ген TGF-fil (трансверсия C/A в положении 632 - миссенс-мутация, приводящая к замене Glu/Asp в кодируемом белке) - размер амплифицированного фрагмента 240 п.н. Генотип B/B представлен на электрофореграм-ме в виде фрагментов ДНК размером 173 и 67 п.н.; F/F - 240 п.н.; B/F - 240, 173 и 67 п.н. соответственно.
Ген TGF-^2 (транзиция T/C в положе-нии -640) - размер амплифицированного фрагмента 284 п.н. Аллель B в гомозиготном состоянии представлен на электрофореграмме в виде фрагментов ДНК размером 100 и 184 п.н.; аллель L в гомозиготном состоянии - 284 п.н.; гетерозиготы B/L - 100, 184 и 284 п.н.
Ген TGF-fî3 (трансверсия С/А в положении 2833, четвертый интрон) - размер амплифицированного фрагмента 294 п.н. Генотип B/B представлен на электрофореграмме в виде фрагментов ДНК размером 125, 75, 74 и 20 п.н.; L/L - 145, 75 и 74 п.н.; B/L - 145, 125, 75, 74 и 20 п.н. соответственно [4].
Частоту аллелей полиморфных локусов определяли по формулам максимального правдоподобия [11]. На основе полученных данных рассчитывали фактическое и теоретическое распределение генотипов, соответствие генетическому равновесию популяции по Харди-Вайнбергу методом х2, фактическую (Ho) и ожидаемую (He) гетерозиготность, коэффициент гомозиготности (Са), эффективное число аллелей (n), индекс фиксации Райта (F/s) - по общепринятым методикам с использованием компьютерной программы Popgen32.
Результаты и обсуждение
Использование рестрикционного анализа по- кур. Аллельные варианты гена TGF-в1, воз-зволило выявить вариабельность каждого из ге- никающие в результате МЬо11-полиморфизма нов, составляющих семейство TGF-в (TGF-в1, экзонного участка, представлены на электро-TGF-P2 и TGF-в3) в изученных популяциях фореграмме продуктов рестрикции (рис. 1).
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов рестрикции экзонного участка гена TGF-fi1 Дорожки 1, 3, 4 - генотип B/F; 2, 5, 7, 8, 9, 11 - генотип F/F; 10 - генотип B/B; 6 - маркер молекулярных масс М-50.
Как следует из результатов исследований, ген TGF-ß1 является полиморфным во всех изученных линиях кур. В каждой иссле -дованной популяции присутствуют особи всех возможных генотипов (B/B, B/F, F/F)
(рис. 1).
Генетическая структура популяций кур мясо-яичного, яичного и яично-мясного направлений продуктивности по локусу TGF-в1 представлена в табл. 1.
Таблица 1
Генетическая структура популяций кур разного направления продуктивности
по локусу TGF-P1 (экзон, МЬоТГ)
Генотипы Белый плимутрок Борковская барвистая Полтавская глинистая
О Е X2 О Е X2 О Е X2
B/B 6 4,41 0,91 28 29,16 0,22 10 9,51 0,028
B/F 30 33,18 52 49,68 42 42,35
F/F 64 62,41 20 21,16 47 47,14
Аллели Частоты аллелей
B 0,21 0,54 0,31
F 0,79 0,46 0,69
Примечание: О - фактически выявленное количество особей данного генотипа; Е - теоретически ожидаемое количество особей данного генотипа.
Если рассматривать соотношение частот аллелей TGF-fi1, то популяции кур мясо-яичного и яично-мясного направлений продуктивности достоверно различаются между собой (p < 0,05) и при этом значительно отличаются от яичных кур (p < 0,001).
Популяции кур породы белый плимутрок и полтавская глинистая характеризуются преобладанием количества особей с генотипом F/F, в то время как в популяции кур породы борковская барвистая данной закономерности не наблюдает-
ся (табл. 1). Все изученные линии кур находятся в состоянии генетического равновесия.
На рис. 2 представлена электрофореграмма продуктов рестрикции (RsaI) промоторного участка гена TGF-ß2.
Ген TGF-ß2 также является полиморфным. Во всех изученных линиях кур разного направления продуктивности присутствуют все три возможных генотипа (B/B, B/L и L/L). Генетическая структура изученных популяций кур представлена в табл. 2.
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов рестрикции промоторного участка гена TGF-ß2 Дорожки 1, 2, 3, 5, 11, 12 - генотип L/L; 4 - генотип B/B; 6, 8, 9, 10 - генотип B/L; 7 - маркер молекулярных масс М-50.
Таблица 2
Генетическая структура линий кур разного направления продуктивности по локусу TGF-в2 (промоторный участок, RsaI)
Генотипы Белый плимутрок Борковская барвистая Полтавская глинистая
О Е X2 О Е X2 О Е X2
B/B 24 21,16 1,31 45 42,9 0,86 64 61,79 2,37
B/L 44 49,68 41 45,2 28 32,84
L/L 32 29,16 14 11,9 7 4,37
Аллели Частоты аллелей
B 0,46 0,65 0,79
L 0,54 0,35 0,21
Наибольшее количество гомозиготных по аллелю В особей наблюдается в линиях кур яично-мясного и яичного направлений продуктивности, наименьшее - в популяции мясо-яичных кур. Все три популяции находятся в состоянии генетического равновесия.
По соотношению частот аллелей изученные популяции кур существенно различаются (р < 0,001). Так для линии кур породы полтавская глинистая характерна высокая частота аллеля В (относительно частоты аллеля L), в тоже время как в линии кур породы белый плимутрок частоты аллелей В и L различаются не столь выражено (0,46 vs. 0,54). Популяция кур породы борковская барвистая занимает своего рода промежуточное положение.
На рис. 3 представлена электрофореграмма продуктов рестрикции 4 интрона гена TGF-в3.
В изученных популяциях кур ген TGF-P3 также является полиморфным. В наличии особи
всех трех возможных генотипов (B/B, B/L и L/L).
Следует отметить, что в данном случае для электрофоретического разделения рестрикци-онных фрагментов использовали 8%-ный по-лиакриламидный гель с последующей окраской серебром. Высокая разрешающая способность данного геля, в отличие от агарозного, позволила разделить фрагменты размером 75 и 74 п.н. При этом следует отметить, что в работах других авторов представлены данные о размерах промежуточных фрагментов, равных по молекулярной массе друг другу (75 п.н.) [9]. По всей видимости, это связано с использованием в цитируемой работе агарозного геля, разрешающей способности которого недостаточно для разделения близких по размерам фрагментов (на электрофореграмме фрагменты, разница в длине которых колеблется в пределах до 15 п.н. будут представлены в виде одной полоски). Данный факт указывает на необходимость использова-
ния полиакриламидных гелей для разделения Генетическая структура популяций кур изу-близких по молекулярным массам фрагментов. ченных пород представлена в табл. 3.
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 П 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов рестрикции фрагмента четвертого интрона гена TGF-ß3 Дорожки 1, 22 - исходный амплифицированный фрагмент; 2, 7, 10, 15, 16, 18, 19 - генотип B/L; 3, 13, 21 - генотип L/L; 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 17, 20 - генотип B/B; 6 - маркер молекулярных масс М-50.
Таблица 3
Генетическая структура линий кур разного направления продуктивности по локусу TGF-P3 (четвертый интрон, BslГ)
Генотипы Белый плимутрок Борковская барвистая Полтавская глинистая
О Е X2 О Е X2 О Е X2
B/B 8 5,76 8 5,29 34 26,77
B/L 32 36,48 1,73 30 35,42 2,32 35 49,42 8,41
L/L 60 57,76 62 59,29 30 22,81
Аллели Частоты аллелей
B 0,24 0,23 0,52
L 0,76 0,77 0,48
Стоит отметить, что популяции кур мясо-яичного и яичного направлений продуктивности по соотношению частот генотипов TGF-ß3 практически идентичны. В то же время для популяции кур яично-мясного направления продуктивности характерна вдвое меньшая частота генотипа L/L и вчетверо большая частота встречаемости особей генотипа B/B (табл. 3). При этом в популяции кур породы полтавская глинистая отмечено нарушение генетического равновесия, что предположительно может быть связано с давлением отбора.
По соотношению частот аллелей популя-
ции кур мясо-яичного и яичного направлений продуктивности практически одинаковы (достоверных отличий не обнаружено) и характеризуются значительным превалированием частоты аллеля L. В свою очередь, популяция кур породы полтавская глинистая достоверно отличается от других изученных линий (р < 0,001), при этом частоты аллелей В и L практически совпадают (0,52 vs. 0,48).
В табл. 4 представлены данные о генетической изменчивости популяций кур изученных пород по генам семейства TGF-в.
Таблица 4
Генетическая изменчивость популяций по генам семейства TGF-ß
Порода Локус n Ca n e Ho He Fis
Белый плимутрок TGF-ß1 100 0,668 1,5 0,3 0,332 0,096
TGF-ß2 0,503 1,99 0,44 0,497 0,115
TGF-ß3 0,635 1,57 0,32 0,365 0,123
Борковская барвистая TGF-ß1 100 0,503 1,98 0,52 0,497 -0,046
TGF-ß2 0,545 1,83 0,41 0,455 0,099
TGF-ß3 0,646 1,55 0,3 0,354 0,153
Полтавская глинистая TGF-ß1 99 0,572 1,75 0,424 0,428 0,01
TGF-ß2 0,668 1,5 0,283 0,332 0,148
TGF-ß3 0,501 1,99 0,353 0,499 0,293
Значения фактической гетерозиготности по разным генам семейства TGF-в в популяциях кур различных пород находились в пределах от 0,283 до 0,52; в то время как значения ожидаемой гетерозиготности составили от 0,332 до 0,499.
По локусу TGF-в3 в популяции кур породы полтавская глинистая показано снижение фактической гетерозиготности (0,353) относительно ожидаемой (0,499), что привело к отклонению от состояния генетического равновесия по Харди-Вайнбергу (х2 = 8,41; табл. 3).
Уровень средней фактической гетерозиготности по всем изученным генам в популяциях кур пород белый плимутрок и полтавская глинистая практически совпадает и равен 0,35; уровень средней ожидаемой гетерозиготно-сти - 0,39 и 0,42. Тот же показатель в популяции кур породы борковская барвистая соста-
вил 0,41 и 0,43 соответственно.
Во всех изученных популяциях кур наименьшее значение индекса фиксации Райта (F/s), как показателя инбридинга особи относительно популяции, составило -0,046 по TGF-fî1 у кур породы борковская барвистая, наибольшее -0,293 по TGF-fî3 у кур породы полтавская глинистая. Расчет индекса фиксации показал, что в целом во всех изученных популяциях по ло-кусам TGF-^2 и TGF-fî3 имеется дефицит гетерозиготных генотипов, наиболее выраженный в популяции кур породы полтавская глинистая.
Значение эффективного числа аллелей колебалось в пределах от 1,5 до 1,99 (табл. 4). Наибольшее генетическое разнообразие по генам семейства TGF-fî характерно для популяции кур породы борковская барвистая, наименьшее - белый плимутрок.
Заключение
Таким образом, впервые изучена генетическая структура популяций кур украинских пород мясо-яичного, яичного и яично-мясного направлений продуктивности по генам семейства трансформирующих ростовых факторов-бета. Все изученные популяции демонстрируют изменчивость по каждому из составляющих генного семейства TGF-в. В линии кур породы полтавская глинистая по локусу TGF-в3 наблюдается смещение генетического равновесия, что может
быть связано с давлением отбора. По остальным генам семейства TGF-в во всех изученных линиях кур нарушения генетического равновесия не наблюдается. Наличие в каждой популяции особей всех возможных генотипов (по каждому из локусов) дает возможность проведения в дальнейшей работе серии направленных скрещиваний с целью изучения связи аллельных вариантов соответствующих генов с продуктивными признаками кур украинской селекции.
Список использованных источников
1. Kim, I. Transforming growth factor-P: bi- 2. Transforming growth factor-P: its role ology and clinical relevance / I. Kim, M. Kim, in ovarian follicle development / D. Rosairo S. Kim // Journal of biochemistry and molecular [et al.] // Reproduction. - 2008. - Vol. 136. -biology. - 2005. - Vol. 38 (1). - P. 1-8. P. 799-809.
3. Massague, J. TGF-^ signal transduction / J. Massague // Annu. Rev. Biochem. - 1998. -Vol. 67. - P. 753 - 791.
4. Chicken quantitative trait loci for growth and body composition associated with transforming growth factor-P genes / H. Li [et al.] // Poultry science. - 2003. - Vol. 82. - P. 347-356.
5. Genetics of TGF-P3 gene polymorphism in inbred synthetic white leghorn breed of poultry / A. Ghosh [et al.] // Journal of evolutionary biology research. - 2011. - Vol. 3 (2). - P. 19-21.
6. Jakowlew, S.Transforminggrowth factor-P isoforms in the developing chicken intestine and spleen: increase in transforming growth factor-P4 with coccidian infection / S. Jakowlew, A. Mathias, H.S. Lillehoj // Vet Immunol Immu-nopathol. - 1997. - Vol. 55 (4). - P. 321-339.
7. Halper, J. On reassessment of the chicken TGFp4 gene as TGFpl / J. Halper, D. Burt, M. Romanov // Growth factors. - 2004. -Vol. 22. - P. 121-122.
8. Mohammad, C. Novel single nucleotide polymorphism in intron 4 of TGF-ß3 gene and its association with production trait in Isfahan native fowl / C. Mohammad, F. Mostafa // Annals of biological research. - 2013. - Vol. 4 (2). -P. 64-68.
9. Enayati, B. Genomic growth hormone, growth hormone receptor and transforming growth factor ß-3 gene polymorphism in breeder hens of Mazandaran native fowls / B. Enayati, G. Rahimi-Mianji // African Journal of biotechnology. - 2009. - Vol. 8 (14). -P. 3154-3159.
10. Malek, M. Association of INOS, TRAIL, TGF-ß2, TGF-ß3, and Igl genes with response to Salmonella enteritidis in poultry / M. Malek, S.J. Lamont // Genet. Sel. Evol. - 2003. -Vol. 35. - P. 99-111.
11. Меркурьева, Е.К. Генетические основы селекции в скотоводстве / Е.К. Меркурьева. -М.: Колос, 1977. - 240 с.
Дата поступления статьи 22 октября 2013 г.
