CC BY
89
2. Будкевич Л.И., Воздвиженский С.И., Окатьев В.С., Степанович В.В. Летальность при термических поражениях у детей: состояние, причины и пути ее снижения. // Росс. вестн. перинатол. и педиатр. — 2004. — № 4. — С. 51—54.
3. Гординская Н.А, Пылаева С.И. Влияние полиок-сидония на течение генерализованной инфекции при ожогах.// Иммунология. — 1999. —№ 2. —С.60—61.
4. Жегалов В. А., Дмитриев Д.Г., Воробьев А.В.. Тактика оказания квалифицированной медицинской помощи тяжелообожженным. Предотвращение ошибок и осложнений // Вестн. травматол. и ортопед. —2003. — № 3. — С.91—97.
5. Жуковский, Ю.М., Шведов Л.М., Железный В.И. Изменения клеточного и гуморального иммунитета при глубоких и обширных ожогах // Клин. хир. —1987. — № 3. — С.36—38.
6. Карваял Х.Ф. Паркс. Д.Х. Ожоги у детей /Пер. с англ.—М.: Медицина. — 1990. — 512 с.
7. Трифонов С.В., Авхименко М.М., Трифонова С.С.
Термические поражения у взрослых и детей: основные лечебно-диагностические мероприятия // Мед. помощь. — 2006. — № 2. — С.35—41.
8. Fitzwater J. The risk factors and time course of sepsis and organ dysfunction after burn trauma // Trauma. — 2003. — Vol. 54. — № 5. — Р. 959—966.
Поступила 08.12.09
CORRECTION OF IMMUNOLOGICAL DISORDERS IN CHILDREN WITH SEVERE BURNS
S.P. Sakharov
Summary
Analyzed were the results of treatment of 14 children with severe thermal injuries, in which the complex therapy was supplemented with an immunomodulator derinat. It was found that the severity of endotoxemia and the frequency and severity of toxic and septic complications in patients decreased by 20%.
Key words: children, burn disease, immunity, derinat
УДК 575.162:[6I6.233—002—053.2+616.24-002—053.2] (470.41)
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА 1В И ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ а В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРОЙ ЛЕГОЧНОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ
Фарида Фаритовна Ризванова1, Рашид Тагирович Габбасов2, Евгения Васильевна Вавилова3, Ольга Ивановна Пикуза1, Альберт Анатольевич Ризванов1-2,
Ольга Александровна Кравцова3
1 Кафедра пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней
лечебного факультета (зав. — доц. Р.А. Файзуллина) Казанского государственного медицинского университета, 2кафедра генетики биолого-почвенного факультета (зав. — проф. Б.И. Барабанщиков),3 кафедра биохимии (зав. — проф. Ф.К. Алимова) Казанского государственного университета,
e-mail: farizvano@yahoo.com
Реферат
Исследована связь между полиморфизмом генов ПЛЬ (+3953С/Т) и ЮТа (-308А/О), которые анализировали по аллель-специфичной полимеразной цепной реакции и клиническому течению острой патологии легких у детей, родившихся в Республике Татарстан. Выявлена взаимосвязь полиморфизма гена ТОТа (-308А/О) для носителей генотипов АА и ОО с клиническим течением бронхита и пневмоний у детей.
Ключевые слова: полиморфизм, заболевания органов дыхания, цитокины.
В структуре острых неспецифических заболеваний ведущее место занимают болезни органов дыхания (БОД), удельный вес и частота которых на сегодня колеблется от 68 до 72% [1, 8]. Особого внимания заслуживают острый бронхит и вне-больничная пневмония, в основе которых лежит инфекционное процесс поражение дыхательных путей или же легочной па-594
ренхимы. БОД нередко связаны с наличием фоновых заболеваний и коморбид-ных состояний, особенно аллергической природы, распространенность которых, по данным отечественных и зарубежных авторов [7], варьирует от 20 до 40% общей популяции. Немаловажная роль отводится также недостатку в рационе питания витаминов и микроэлементов; негативный эффект оказывают пассивное курение и неблагоприятная экологическая среда [5].
Актуальной задачей современной педиатрии является изучение патогенеза воспалительного процесса, в том числе иммунологических нарушений. Особую роль в регуляции местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток играют цитокины [3].
Известно, что провоспалительные ци-
токины стимулируют на поверхности эндотелиальных клеток и нейтрофилов экспрессию адгезивных молекул, необходимых для целенаправленной трансэн-дотелиальной миграции лейкоцитов при их мобилизации в очаг воспаления [6]. В очаге воспаления интерлейкин 1(IL-1b) и фактор некроза опухоли a (TNFa) активируют нейтрофилы, что сопровождается развитием «респираторного взрыва», их дегрануляцией, выделением свободных радикалов и протеаз. В свою очередь, активные формы кислорода могут повреждать ткани легкого. Имеются данные о прямой зависимости между тяжестью воспаления при бронхите и пневмонии и ростом уровнем интерлейкинов 1 и 8, а также TNFa [2].
Фактор некроза опухоли a (TNFa) занимает центральное место в "воспалительном каскаде", стимулируя синтез других провоспалительных веществ. Данный цитокин, с одной стороны, регулирует дифференцировку, рост и метаболизм различных клеток, а с другой — выступает в роли медиатора иммунопатологических процессов [12]. IL-1b — цитокин с широким диапазоном биологических и физиологических эффектов, включая стимуляцию лихорадки, синтеза проста-гландинов, активацию T-лимфоцитов и продукцию IL-2 [10].
Ген, кодирующий TNFa расположен на коротком плече хромосомы 6p21.3 [13]. Промоторная зона гена TNFa включает 8 полиморфных участков с единичными нуклеотидными заменами, однако наиболее значимыми для человека считаются 2 из них: это замены гуанидина на аденин (G/A) в положении -308G/A и -238G/A, которые отражаются на продукции TNFa. Показано, что носительство аллеля А может сопровождаться более высоким уровнем экспрессии гена TNFa [12].
Согласно данным последних лет, полиморфизм генов про- и противовоспалительных цитокинов оказывает существенное влияние на предрасположенность к ряду заболеваний и способы лечения, в частности на цитокиновую и антицито-киновую терапию [11]. В настоящее время ведутся активные исследования по выявлению ассоциации полиморфных локусов генов-кандидатов с риском развития заболеваний легких у населения Российской
Федерации. В Республике Татарстан (РТ) подобные исследования ранее не проводились, поэтому актуален поиск связи между полиморфизмом генов провоспалительных интерлейкинов и предрасположенностью к бронхиту и пневмонии.
Цель работы: оценка влияния полиморфизма генов П-1Ь (+3953С/Т) и Т№а (-308А^) на клиническое течение бронхита и пневмонии у детей.
Получение информированного согласия, сбор анамнеза, предварительное обследование и взятие биологического материала проводили в соответствии с разрешением Республиканского комитета по этическим вопросам МЗ РТ.
Под наблюдением находились 110 больных острым бронхитом (ОБ), среди которых были 56,36% мальчиков и 43,63% девочек (средний возраст — 9,8±1,2 года) и 69 больных внебольничной пневмонией (ВП) — 54,98% мальчиков и 44,97% девочек (средний возраст — 10,1±0,98). В контрольную группу вошли 67 относительно здоровых детей (43,28% мальчиков и 56,71% девочек), не являвшихся родственниками, не состовших на учете по хроническим заболеваниям легких и соответствующих выборке больных по возрасту и полу.
Состояние детей при поступлении соответствовало среднетяжелому за счет умеренно выраженной интоксикации, катарального и респираторного синдромов, наличия сухого или влажного кашля, физикальных изменений в легких в виде жесткого дыхания, влажных и сухих хрипов. Интоксикация была более выражена у больных ВП и проявлялась вялостью, слабостью, бледностью кожных покровов, сниженным аппетитом, лихорадкой и респираторным синдромом. Признаков синдрома бронхиальной обструкции зарегистрировано не было, значительные патологические сдвиги в гемограмме отсутствовали. Рентгенологическая картина легких была типична для бронхита и характеризовалась расширением корней легких, усилением бронхососудистого рисунка при отсутствии инфильтративных изменений в паренхиме легкого, тогда как при ВП во всех случаях отмечались очаговые или очагово-сливные инфильтраты легочной паренхимы.
Молекулярно-генетический анализ включал исследование полиморфизма
Таблица 1
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса +3953 С/Т гена в
группах больных ОБ и ВП и контроля
Аллели Генотипы Контроль (n= 67) Больные ОБ (n= 39) р Больные ВП (n=17) р
C 47,78 58,89 0,361 28,62 0,568
T 52,22 41,01 71,41
CC 23,9 30,79 0,372 14,31 0,645
CT 49,3 53,81 42,9
TT 26,89 15,41 42,9
+3953С/Т гена IL1b и -308A/G гена TNFa. Для генотипирования использовали образцы тотальной ДНК, выделенной с помощью набора «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», г. Москва). Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ПЦР-термо-циклере MJ Mini (BioRad, США) в 20 мкл реакционной смеси, включавшей 15—20 нг препарата ДНК, 0,5 мкМ прай-меров, 0,2 мМ дНТФ и 1 единицу термостабильной Taq-полимеразы в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl (pH 8,8), 50 мМ КС1, 0,01% Твин-20, 2 мМ MgCl2 производства НПБО «Ё» (г. Пущино). Разделение продуктов амплификации производили в нативном 8% полиакриламид-ном геле с использованием камеры для вертикального электрофореза («Хеликон», г. Москва) при напряженности электрического поля 8-10 В/см. В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК фага X, гидролизованную рестрик-тазой BsuRI и ДНК pUC19, гидролизованную рестриктазой MspI и Kzo9I (ООО «СибЭнзим», г. Новосибирск).
Амплифицировали фрагменты генов IL-1b в районе локуса +3953 Т/С и -308A/G гена TNFa. В качестве внутреннего контроля в реакции ПЦР использовали прай-меры, специфичные к гену drb1 человека. Полиморфизм гена IL-1b определяли по наличию продукта ПЦР-амплификации в реакции, специфично амплифицирующей полиморфные варианты гена IL-1b +3953Т или IL-1b +3953С, а также гена TNFa -308A/G (Рис. 1).
Статистическую обработку данных исследованных полиморфных маркеров оценивали с помощью 95% доверительного интервала (ДИ). Во всех процедурах статистического анализа достоверными 596
считали различия при р<0,05.
Как показали полученные результаты (табл. 1), по распределению частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу +3953Т/С гена П1 статистически достоверных различий между анализируемыми выборками больных с ОБ, ВП и группой контроля не выявлено (р>0,05). Во всех исследованных группах, как у больных ОБ и ВП, так и в группе контроля, преобладал гетерозиготный генотип С/Т (рис. 1). Доля гетерозиготного С/Т варианта достигала почти 55% у больных ОБ, 45% у больных ВП и почти 50% в группе контроля. Таким образом, данный вариант гена интерлейкина 1 не оказывает влияния на предрасположенность к острой патологии легких и бронхов у детей РТ. Наблюдаемое распределение частот встречаемости аллелей и генотипов по полиморфизму гена Т№а -308А^ в
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов SSP-PCR амплификации полиморфизма +3953 Т/С гена illb (rs1143634). М - ДНК маркер GeneRuler™ 1kb DNA Ladder (Фер-ментас). Стрелками обозначены продукты амплификации гена drbl (796 п.н.) и продукт амплификации гена illb (336 п.н.).
Таблица 2
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов (%) полиморфного локуса TNFa -308A/G
в группах больных ОБ и ВП и контроля
Аллели, Генотипы Контроль (n= 67) Больные ОБ (n= 41) р Больные ОП (n=8 ) р
A 73,13 58,53 0,173 62,5 0,829
G 26,86 41,46 37,5
AA 50,74 26,82 0,043 37,5 0,051
AG 44,78 63,42 62,5
GG 4,48 9,76 0
GG АА AG АА М
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов SSP-PCR амплификации полиморфизма -308A/G гена tnfa (rs2243250). М - ДНК маркер GeneRuler™ 1kb DNA Ladder (Фермен-тас). Стрелками обозначены продукты амплификации гена drbl (796 п.н.) — А и гена tnfa (447 п.н.) —Б.
0.9 0.8
№ ,1.
С G СС CG GG
I девочки Н мальчики
Рис. 3. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма +3953C/T гена illb у пациентов с острым бронхитом по половой принадлежности. Планки погрешностей отражают 95% доверительный интервал.
1
0.9 0.8
il'l1 III1 II
AG АА AG GG
I 6-11 лет И 12-15 лет
Рис. 4. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма -308A/G гена tnfa у пациентов с острым бронхитом в различных возрастных группах. Планки погрешностей отражают 95% доверительный интервал.
группах больных и в контроле выявило статистически достоверные различия (табл. 2): для ОБ - р=0,043, для ВП -р=0,051 (рис. 2). Данный полиморфизм указывает на повышенный риск развития острой патологии для носителей аллеля G (ОШ=2,68, 95% ДИ 1,13-6,32).
В связи с тем, что риск развития осложнений после перенесенной острой патологии в виде фарингита, острого отита, хронизации воспалительного процесса, по данным литературы, повышен у девочек, нами был проведен сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов изученных полиморфизмов в группах больных ОБ, ВП и контроля, подразделенных по половой принадлежности. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов -308А^ гена Т№а и +3953 Т/С гена И-1Ь в зависимости от пола в группах с острым бронхитом, пневмонией и контролем показал отсутствие статистически значимых отличий. Однако следует отметить более низкую частоту встречаемости генотипа GG полиморфизма -308А^ гена Т№а в группе с ОБ среди девочек по сравнению с мальчиками (рис. 3).
Представляло интерес определение полиморфизма генов исследуемых ин-терлейкинов в зависимости не только от нозологической формы, но и с учетом возраста пациента. Известно, что у детей от 10 до 17 лет наблюдается нестабильность иммунной системы, так называемый пятый критический период. В этом возрасте заболевания респираторного тракта протекают тяжело, нередко с осложнениями [12]. Оценка распределения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных локусов генов И-1Ь и Т№а (рис. 4) в различных возрастных группах (до 6 лет,
от 7 до 12 лет и старше 12 лет) не выявила различий по возрасту (p>0,05).
Таким образом, анализ показал, что вариант гена TNFa -308A/G, а именно аллель G, ассоциирован с риском развития острой патологии легких, в частности ОБ и ВП у детей вне зависимости от пола и возраста. Полученные данные можно использовать в качестве индивидуальных прогностических критериев и при разработке новых лечебных подходов в терапии заболеваний легких.
Работа частично финансировалась грантами Российского фонда фундаментальных исследований
и госконтрактом ФЦП Федерального Агентства по науке и инновациям 02.552.11.7088.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов А. А, Альбицкий В. Ю. Социальные и организационные проблемы педиатрии: избр. Очерки. — М.: Изд. дом «Династия», 2003. — 511с.
2. Вахитов Х.М. Метаболические нарушения при необструктивных бронхитах и внебольничных пневмониях у детей и возможности их коррекции: Дисс. ... докт. мед. наук. — К., 2010. — С. 46—50.
3. Ковальчук Л.В. Ганковская Л.В., Борисова A.M. Действие цитокинов на генерацию активных форм кислорода фагоцитами легких и периферической крови // Сибирский онкол. журн. — 2004. — № 4. — С. 440—443.
4. Коган Е.А. Молекулярная патология предрака и рака легкого // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.— 2003. — № 1. — С. 13—22.
5. Костина В. В. Хронический бронхит: этиология, патогенез, особенности клиники и лечения // Нижегородский мед. ж. — 2002. — № 1. — С. 129—134.
6. Максимов В.Н. Связь наследственной отягощен-ности и полиморфизма некоторых генов-кандидатов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и их факторами риска в городской популяции Западной Сибири: Авто-
реф. дисс. ... канд. мед. наук. — Новосибирск, 2007. — С. 45
7. Намазова Л.С. и др. Иммунотерапия пациентов с респираторной аллергией//Со^Шит Medicum.—2002. — Т.4, № 9. — С. 474—475.
8. Гаращенко Т.И., Ильенко Л.И., Гаращенко М.В. Профилактическое применение иммудона у часто и длительно болеющих школьников // Вопр. совр. педиатр. — 2002.— Т.1, №5. — С. 27—30.
9. Таточенко В. К Антибактериальное лечение острых респираторных заболеваний у детей //Фарматека. —
2002. — № 11. — С. 3—9.
10. Dinarello C.A. Interleukin-1 // Cytokin and Growth Factor Reviews.—1997.—Vol.8. (4). — P.252
11. Lau YL, Peiris J.S. Pathogenesis of severe acute respiratory syndrome. // Curr Opin Immunol. — 2005. — Vol.17. — P.404—410.
12. Mullighan, C.G.,MarshallS.E., BunceM. Variation in immunoregulatory genes determines the clinical phenotype of common variable immunodeficiency // Genes Immun. — 1999. — Vol. 1, № 2. — P. 137—148.
13. Peiris J.S.,LaiS.T.,PoonL.L. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome// Lancet. —
2003. — Vol.361. — P. 1319—1325.
POLYMORPHISM OF INTERLEUKIN 1B AND TUMOR NECKOSIS FACTOR ALPHA GENES IN THE PATHOGENESIS OF ACUTE LUNG PATHOLOGY IN CHILDREN
F.F. Rizvanova, R.T. Gabbasov, E.V. Vavilova, O.I. Pikuza, A.A. Rizvanov, O.A. Kravtsova
Summary
Studied was the relationship between IL1b (+3953 C / T) and TNFa (-308A / G) gene polymorphism, which were analyzed by allele-specific polymerase chain reaction, and the clinical course of acute lung pathology in children born in the Republic of Tatarstan. Revealed was a correlation between TNFa (-308A / G) gene polymorphism for carriers of genotypes AA and GG with the clinical course of bronchitis and pneumonia in children.
Key words: gene polymorphism, respiratory diseases, cytokines
