CC BY
40
Медицинская иммунология Medical Immunology (Russia)/
2020, Т. 22, № 3 Оригинальные статьи Meditsinskaya Immunologiya
стр. 497-506 ^ , . . . . 2020, Vol. 22, No 3, pp. 497-506
© 2020, СПбРО РААКИ Original OVÍlCleS © 2020, SPb RAACI
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ
СОСУДОВ (VEGF) И МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ
_ _ ____ _ __
(ММР) ПРИ ПЕРВИЧНОМ ЛИМФЕДЕМЕ КОНЕЧНОСТЕЙ
Шевченко А.В., Прокофьев В.Ф., Коненков В.И., Хапаев Р.С., Нимаев В.В.
Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск, Россия
Резюме. Среди причин развития первичной лимфедемы (ПЛ) определенное значение играют генетические факторы, молекулярные продукты которых участвуют в процессах ремоделирования кровеносных и лимфатических сосудистых сетей. Сосудистые эндотелиальные факторы роста (VEGFs) — ключевые регуляторы эндотелиальной функции клеток, ответственных за лимфо-, васкуло- и ангиогенез. Кроме того, регуляторами и лимфангиогенеза, и ангиогенеза могут выступать матрикс-ные металлопротеиназы (ММР). Поскольку регуляторные регионы гена, кодирующего VEGF-A, как и регуляторные регионы генов ММР, полиморфны, возможно, что различный уровень их экспрессии, определяемый полиморфизмом этих регионов, может быть ассоциирован с развитием отеков, свойственных лимфедеме. Проанализирован полиморфизм двух регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A (ге 699947 и ге 3025039) и полиморфизм промоторных регионов генов матриксных металлопротеиназ ММР2 (ге 2438650), ММР3 (ге 3025058), ММР9 (ге 3918242) и их комбинаций у пациентов с первичной лимфедемой.
Выборка пациентов с первичной лимфедемой конечностей включала 72 человека (55 женщин и 17 мужчин) в возрасте от 18 до 81 года, в популяционную группу контроля включены 526 жителей г. Новосибирска (153 мужчины, 373 женщины) без хронических заболеваний, сопоставимые по возрасту с выборкой больных лимфедемой. Проведено типирование регуляторных регионов генов VEGF (rs 699947, ге 3025039), ММР2 (ге 2438650), ММР3 (ге 3025058), ММР9 (ге 3918242). Выявлено 15 комплексных генотипов, позитивно ассоциированных с заболеванием. Анализ топологии генной сети выделил главные межгенные взаимодействия при развитии первичной лимфедемы. ММР2 -1306 СС, ММР9 -1562 СС и VEGF +936 СС формируют основные узлы в генной сети (53% от всех взаимодействий). Выявлен ряд достоверно различающихся комплексных генотипов у пациентов с ПЛ с нормальным индексом массы тела (ИМТ) (менее 25) и ожирением (ИМТ более 30). Так, частота комплексного генотипа VEGF +936 СС:ММР3 -1171 5А6А:ММР9 -1562 СС у пациентов с ожирением повышена более чем в пять с половиной раз относительно пациентов с нормальным ИМТ.
Полученные данные могут свидетельствовать об определенном значении полиморфизма анализируемых генов на патогенез развития первичной лимфедемы конечностей. Топологический анализ
Адрес для переписки:
Шевченко Алла Владимировна
Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии 630060, Россия, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2. Тел.: 8 (952) 901-36-80. E-mail: [email protected]
Образец цитирования:
А.В. Шевченко, В.Ф. Прокофьев, В.И. Коненков, Р.С. Хапаев, В.В. Нимаев «Полиморфизм генов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и матриксных металлопротеиназ (ММР) при первичной лимфедеме конечностей» //Медицинская иммунология, 2020. Т. 22, № 3. С. 497-506. doi: 10.15789/1563-0625-POV-1913 © Шевченко А.В. и соавт., 2020
Address for correspondence:
Shevchenko Alla V.
Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology 630060, Russian Federation, Novosibirsk, Timakov str., 2. Phone: 7 (952) 901-36-80. E-mail: [email protected]
For citation:
A.V. Shevchenko, V.F. Prokofyev, V.I. Konenkov, R.S. Khapaev, V.V. Nimaev "Polymorphism of vascular endothelial growth factor gene (VEGF) and matrix metalloproteinase (MMP) genes in primary limb lymphedema", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2020, Vol. 22, no. 3, pp. 497-506. doi: 10.15789/1563-0625-POV-1913 DOI: 10.15789/1563-0625-POV-1913
генных сетей позволяет изучать структурно-функциональную организацию ген-генных взаимодействий для разработки подходов к персонифицированной профилактике и терапии заболевания.
Ключевые слова: первичная лимфедема, гены матриксных металлопротеиназ, ген фактора роста эндотелия сосудов, генные сети, математическое моделирование
POLYMORPHISM OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR GENE (VEGF) AND MATRIX METALLOPROTEINASE (ММР) GENES IN PRIMARY LIMB LYMPHEDEMA
Shevchenko A.V., Prokofyev V.F., Konenkov V.I., Khapaev R.S., Nimaev V.V.
Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
Abstract. Among the reasons of primary lymphedema development, a certain role belongs to genetic factors. The specific molecular products participate in remodeling of blood and lymphatic vascular networks. Vascular endothelial growth factors (VEGFs) are key regulators of endothelial functions of the cells, which are responsible for lympho- and vasculogenesis. Moreover, matrix metalloproteinases (ММР) may act as regulators of both lymphangiogenesis, and angiogenesis. Since the regulatory regions of VEGFA gene, as well as of ММР genes are polymorphic, one may suggest, that their different expression level, determined by these polymorphisms, could be associated with development of swellings typical for lymphedema.
We have analyzed gene polymorphisms in two regulatory regions of vascular endothelial growth factor-A VEGF-A (rs 699947 and rs 3025039), and matrix metalloproteinase genes MMP2 (rs 2438650), MMP3 (rs 3025058), MMP9 (rs 3918242), and their combinations in the patients with primary lymphedema.
A group of patients with primary lymphedema included 72 subjects (55 women and 17 men) at the age of 18 to 81 years. Control group included 526 inhabitants of Novosibirsk (153 men, 373 women) without chronic diseases, comparable for age with lymphedema patients. We have performed typing of regulatory regions in VEGF (rs 699947, rs 3025039), ММР2 (rs 2438650), ММР3 (rs 3025058), ММР9 genes (rs 3918242). Fifteen complex genotypes have been revealed that were positively associated with disease. Analysis of the gene network topology has outlined the main intergenic interactions upon primary lymphedema development. MMP2 -1306 CC, MMP9 -1562CCand VEGF +936CCarrange the basic knots in the gene network (53% of total interactions). A number of significantly different complex genotypes was revealed at patients with primary lymphedema with normal body mass index (BMI < 25) and obesity (BMI < 30). Hence, frequency of complex genotype VEGF +936CC: MMP3 -11715А6А:MMP9 -1562 CC in the patients with obesity is increased more 5.5-fold compared to the patients with normal BMI.
The data obtained may presume a certain value of the analyzed gene polymorphisms in pathogenesis of primary lymphedema. Topological analysis of gene networks allows to study the structural and functional organization of gene-gene interactions for development of approaches to individyal preventive maintenance and therapy of the disease.
Keywords: primary lymphedema, matrix metalloproteinases genes, vascular endothelial growth factor gene, gene networks, mathematical modelling
Введение
Лимфатическая капиллярная и сосудистая сеть — важная часть общей сосудистой системы организма, осуществляющая циркуляцию тканевой жидкости, миграцию иммунокомпетентных клеток, абсорбцию холестеринов и других ли-пидов. Любой приобретенный или врожденный дефект в архитектуре или функции лимфатической системы может способствовать лимфатиче-
ской дисфункции и развитию лимфедемы, проявляющейся обширным некурабельным отеком одной или нескольких конечностей [3, 5]. Если причиной вторичной лимфедемы является паразитарная инфекция филяриоз или оперативное удаление молочной железы, то причины возникновения первичной лимфедемы (ПЛ) до сих пор не известны, хотя общепризнано, что определенное значение в ее развитии играют генетические факторы [1]. Особое внимание привлекают
гены, молекулярные продукты которых участвуют в процессах ремоделирования кровеносных и лимфатических сосудистых сетей.
Сосудистые эндотелиальные факторы роста (VEGFs) — ключевые регуляторы эндотелиаль-ной функции клеток, ответственных за лимфо-, васкуло- и ангиогенез [9]. Как известно, процесс ангиогенеза начинается с активации эндо-телиальных клеток. Ключевую роль в этом процессе играет фактор роста эндотелия сосудов). Семейство VEGF включает пептиды VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E, плацентарные факторы роста PlGF-1 и PlGF-2, рецепторы VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3. Каждая из этих молекул исполняет свою «партию» в общем «оркестре» ангиогенеза. VEGF-A влияет на развитие новых и выживание незрелых кровеносных сосудов, связываясь с мембранными рецепторами VEGFR-1 и VEGFR-2. Факторы VEGF-С и VEGF-D, действующие через VEGFR-3 и VEGFR-2, регулируют главным образом лимфангиогенез. При этом VEGF-A — главный регулятор сосудистой проходимости и ангиогенеза, участвующий в экстравазии плазменных белков. Однако VEGF-A является не только главным стимулятором ангиогенеза, но и значимым лимфангиогенным фактором [9, 18]. Показано, что у пациентов с лимфатическим фи-ляриозом повышены уровни не только VEGF-C и VEGF-D, но и VEGF-A [5]. Действие VEGF-A на лимфатические эндотелиальные клетки может быть как прямым, так и опосредованным, например, при участии макрофагов, продуцирующих лимфангиогенные факторы, либо путем повышения экспрессии VEGF-C — непосредственного регулятора лимфангиогенеза [22].
Помимо этой регуляторной сети, регуляторами и лимфангиогенеза, и ангиогенеза могут выступать матриксные металлопротеиназы (ММР) [15]. Матриксные металлопротеиназы известны не только как ферменты системы про-теолиза, но и как ангиогенные факторы, которые, имея определенные особенности доменных структур, действуют на коллаген и протеоглика-новый матрикс, регулируя ремоделирование ткани сосудов [4, 10]. Вклад ММР в лимфангиогенез показан [6, 11], однако слабо исследован. Среди всех MMP именно MMP-2 и MMP-9 экспресси-руются лимфатическими эндотелиальными клетками (LECs) и деградируют коллаген IV типа, выстилающий стенки лимфатических сосудов [11]. Полиморфизм генов MMP ассоциирован с целым рядом заболеваний, таких как опухолевые образования, метастазирование, аневризмы сосудов, тромбообразование и др. [7, 10]. Поскольку ре-гуляторные регионы гена, кодирующего VEGF-A, как и регуляторные регионы генов ММР, полиморфны, возможно, что различный уровень их
экспрессии, определяемый полиморфизмом этих регионов, может быть ассоциирован с развитием отеков, свойственных лимфедеме.
Исходя из этого, мы проанализировали полиморфизм двух регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A и полиморфизм промоторных регионов генов матрикс-ных металлопротеиназ MMP2, MMP3, MMP9 и их комбинаций у пациентов с первичной лимфе-демой.
Материалы и методы
Пациенты
Выборка пациентов с первичной лимфедемой конечностей включала 72 человека (55 женщин и 17 мужчин) в возрасте от 18 до 81 года (45 (3061)). Диагноз «лимфедема конечностей» установлен на основании данных анамнеза, клинического осмотра после исключения всех причин, способствующих развитию вторичной формы заболевания. У 7 пациентов диагноз подтвержден с помощью лимфосцинтиграфии нижних конечностей, по данным которой выявлены нарушения лимфодренажной функции нижних конечностей, у одного пациента — данными контрастной лимфографии в анамнезе. У большинства пациентов наблюдалось поражение одной конечности (52 пациента), тогда как двустороннее поражение отмечено у 30 пациентов. У 3 пациентов (4,2%) лимфедема зарегистрирована при рождении, у 17 (23,6%) пациентов в детском и подростковом возрасте (6 месяцев — 16 лет). У 45 (62,5%) пациентов заболевание характеризовалось как lymphedema tarda, у остальных 6 пациентов (8,3%) отмечено позднее начало заболевания (48-62 года). Наследственный характер заболевания наблюдался у 6 пациентов (5 с двусторонней формой поражения). Мультисегментое поражение (лицо, верхние и нижние конечности) наблюдалось у 2 пациентов. Сочетание с ассоциированными синдромами у 3 пациентов (капиллярная геманги-ома, хилорея, дистихаз). У 29 пациентов индекс массы тела соответствовал ожирению первой степени (3), второй степени (11) и третьей степени (15 пациентов). Именно у этих пациентов (17/29) наблюдались сопутствующие заболевания, связанные с метаболическим синдромом (гипертоническая болезнь, ИБС, сахарный диабет 2 типа, гонартроз). У пациентов с нормальным индексом массы тела или с избыточной массой тела частота этих заболеваний была достоверно ниже (2/43), но у них отмечались заболевания ЖКТ, железо-дефицитная анемия, гипотиреоз, дисплазия соединительной ткани и пр. В качестве наиболее частого триггерного фактора, способствующего появлению первых клинических признаков за-
болевания, выступала травма (12), затем рожистое воспаление (8) и беременность (3). Считается, что перечисленные состояния способствуют возникновению лимфедемы вследствие недостаточности функционального резерва лимфатического региона вследствие неполноценного развития лимфатического русла (лимфатических капилляров, лимфатических сосудов, их клапанов, лимфатических узлов). У 28 пациентов про-грессирование заболевания было связано с рецидивирующим характером течения рожистого воспаления — состояния, способствующего про-грессированию лимфатического отека. Нужно отметить появление клинической картины лим-федемы после однократного рожистого воспаления, возникает из-за недостаточности функционального резерва и расценивается как первичная форма заболевания, тогда как развитие заболевания вследствие нескольких рецидивов рожистого воспаления относится к вторичной лимфедеме.
Контрольная группа
В популяционную группу контроля включены 526 жителей г. Новосибирска (153 мужчины, 373 женщины) без хронических заболеваний, сопоставимые по возрасту с выборкой больных лим-федемой (р = 0,711 по критерию Манна—Уитни). Медиана по возрасту 48 лет (40-54).
Исследование проведено в рамках протокола клинического исследования «Персонифицированное лечение лимфедемы конечностей на основе оценки дренажной функции и состояния интерстиция», одобренного локальным этическим комитетом НИИКЭЛ — филила ИЦиГ СО РАН.
Генотипирование
Генотипирование полиморфизмов промотор-ного региона генов VEGF-2578 (rs 699947), ММР3 -1171 (rs 3025058), ММР9 -1562 (rs 3918242) осуществляли методом рестриктазного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ), с использованием специфичных праймеров [19, 20] и эндонуклеаз рестрикции Bgl II, TthI, SphI соответственно (СибЭнзим, г. Новосибирск). Электрофорез проводили в 2,5% агарозном геле.
SNP полиморфизм регуляторных регионов генов VEGF +936 (rs 3025039) и ММР2 -1306 (rs 2438650) анализировали с помощью Real-Time ПЦР с использованием коммерческих тест-систем методом TaqMan зондов (Синтол, Россия) на амплификаторе «ДТ-96» (ДНК-Технология) согласно инструкции фирмы-производителя.
Статистическая обработка
При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели, как частота встречаемости генотипов, отношение шансов (OR) с расчетом 95% доверительно-
го интервала (OR 95%CI). Расчет величины OR проводили по методу Вульфа—Холдейна. Частоту встречаемости отдельных генотипов определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип, к общему числу обследованных в группе по формуле: f = n/N, где n — количество раз встречаемости генотипа, N — численность обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди—Вайнберга. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц.
Результаты
Исследовали особенности однонуклеотидно-го полиморфизма регуляторных регионов генов VEGF +936 C^T, VEGF -2578 С^Л, ММР2 -1306 С^ Т, ММР3 -11715А^6А, ММР9 -1562С^ Ту пациентов с первичной лимфедемой (ПЛ) относительно группы здоровых лиц. Частоты генотипов анализируемых генов в группах соответствовали равновесию Харди—Вайнберга. Частоты VEGF -2578 и VEGF +936, ММР3 -1171, ММР9 -1562 генотипов значимо не отличались между группами, при этом частота ММР2 -1306 СС генотипа у пациентов с первичной лимфедемой конечностей была значимо выше, чем в группе сравнения (табл. 1). Учитывая возможное синергетическое влияние нескольких полиморфных сайтов одного гена на изменение уровня его активности и то, что матриксные металлопротеиназы могут непосредственно участвовать в регуляции активности фактора роста эндотелия сосудов, образуя определенную регуляторную сеть, мы проанализировали частоту встречаемости комплекса полиморфных вариантов исследуемых генов, выявляемых в геноме каждого обследованного пациента (табл. 2). Из значительного количества возможных вариантов комбинаций анализируемых полиморфных позиций выявлено 15 комплексных генотипов, позитивно ассоциированных с заболеванием. Один из них — VEGF -2578 СА/+936 СС — объединяет две позиции регуля-торных локусов, одна из которых расположена в промоторном регионе, а другая в 3' фланкирующем регионе гена. Еще восемь комплексных генотипов включают комбинацию двух полиморфных сайтов гена VEGF, причем VEGF -2578 везде представлена только в гетерозиготном варианте, а VEGF +936 как СС, так и ТТ гомозиготой, в зависимости от включенного в комплекс генотипа матриксной металлопротеиназы. В четырех комплексных генотипах VEGF представлен исключительно полиморфной позицией фланкирующего региона гена, два генотипа представлены ком-
ТАБЛИЦА 1. ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЧАСТОТ ГЕНОТИПОВ ГЕНОВ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ И ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ У ПАЦИЕНТОВ С ПЕРВИЧНОЙ ЛИМФЕДЕМОЙ
TABLE 1. FEATURES OF DISTRIBUTION OF GENOTYPES FREQUENCIES OF MATRIX METALLOPROTEINASES AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR GENES AT PATIENTS WITH PRIMARY LYMPHEDEMA
Полиморфная позиция Polymorphic position Генотип Genotype Пациенты с первичной лимфедемой Patients with primary lymphedema Здоровые Healthy OR OR_CI95 P_tmF2
VEGF -2578 n = 72 n1 = 397 CC 18 (25,00) 106 (26,70) 0,92 0,51-1,63 0,8846
CA 41 (56,94) 210 (52,90) 1,18 0,71-1,95 0,6078
AA 13 (18,06) 81 (20,40) 0,86 0,45-1,64 0,7498
VEGF +936 n = 72 n1 = 352 CC 57 (79,17) 259 (73,58) 1,36 0,74-2,53 0,3745
CT 11 (15,28) 82 (23,30) 0,59 0,30-1,18 0,1600
TT 4 (5,56) 11 (3,13) 1,82 0,56-5,90 0,2979
MMP2 -1306 n = 72 n1 = 319 TT 3 (4,17) 25 (7,84) 0,51 0,15-1,74 0,4458
TC 18 (25,00) 112 (35,11) 0,62 0,34-1,10 0,1272
CC 51 (70,83) 182 (57,05) 1,83 1,05-3,18 0,0338
MMP3 -1171 n = 72 n1 = 88 55 20 (27,78) 18 (20,45) 1,50 0,72-3,11 0,3509
56 26 (36,11) 41 (46,59) 0,65 0,34-1,23 0,2003
66 26 (36,11) 29 (32,95) 1,15 0,60-2,21 0,7389
MMP9 -1562 n = 72 n1 = 388 CC 50 (69,44) 271 (69,85) 0,98 0,57-1,69 1,0000
CT 19 (26,39) 97 (25,00) 1,08 0,61-1,91 0,7700
TT 3 (4,17) 20 (5,15) 0,80 0,23-2,77 1,0000
Примечание. n - количество обследованных пациентов с лимфедемой, n1 - количество обследованных в группе сравнения, OR - отношение шансов, OR_CI 95 - 95%-й доверительный интервал для OR, P_tmF2 - значимость различий по 2-стороннему варианту точного метода Фишера.
Note. n, quantity of the patients with lymphedema; n1, quantity surveyed in group of comparison; OR, Odds ratio; OR_CI95, 95% confidence interval; P_tmF2, bilateral Fisher's exact test.
плексом генов матриксных металлопротеиназ. В шести комплексах представлен гомозиготный генотип MMP2-1306 СС, частота которого повышена у пациентов с ПЛ. При этом максимальные значения отношения шансов развития патологии у носителей комплексов VEGF -2578 CA/VEGF +936 TT/MMP9-1562CT(OR = 14,37, P = 0,0303) и VEGF-2578 CA/VEGF +936 TT/MMP2 -1306 CC/ MMP9-1562 CT (OR = 12,21, P = 0,0396).
Для графической визуализации выявленных нами генных композиций, представленных в таблице 2, и выделения среди них главных генов и межгенных взаимодействий мы провели с помощью биоинформационной платформы Cytoscape компьютерное моделирование сетевых взаимодействий различных генотипов MMP и VEGF, вовлеченных в регуляцию процессов деструкции и ангиогенеза при формировании предрасполдоженности к первичной лимфедеме (рис. 1).
Рисунок 1. Графическая визуализация MMP-VEGF генной сети, позитивно ассоциированной с развитием первичной лимфедемы
Figure 1. Graphic visualization of MMP-VEGF genic network which positively associated with development of primary lymphedema
ТАБЛИЦА 2. КОМПЛЕКСНЫЕ ГЕНОТИПЫ ГЕНОВ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ И ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ, ПОЗИТИВНО АССОЦИИРОВАННЫЕ С РАЗВИТИЕМ ПЕРВИЧНОЙ ЛИМФЕДЕМЫ
TABLE 2. COMPLEX GENOTYPES OF MATRIX METALLOPROTEINASES AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR GENES WHICH POSITIVELY ASSOCIATED WITH PRIMARY LYMPHEDEMA
Полиморфные позиции Polymorphic position Генотип Genotype Пациенты с первичной лимфедемой Patients with primary lymphedema Здоровые Healthy OR OR_CI95 P_tmF2
VEGF -2578:VEGF +936 CA-CC 35 (48,61) 123 (35,76) 1,70 1,02-2,84 0,0457
VEGF +936:MMP2 -1306 CC-CC 41 (56,94) 120 (40,40) 1,95 1,16-3,28 0,0121
VEGF +936:MMP9 -1562 TT-CT 3 (4,17) 2 (0,58) 7,48 1,23-45,60 0,0379
MMP2 -1306:MMP9 -1562 CC-CC 37 (51,39) 117 (37,62) 1,75 1,05-2,94 0,0338
MMP3 -1171:MMP9 -1562 55-CC 16 (22,22) 9 (10,23) 2,51 1,03-6,08 0,0488
VEGF- 2578:VEGF +936: MMP2 -1306 CA-CC-CC 27 (37,50) 60 (20,62) 2,31 1,33-4,02 0,0051
VEGF -2578:VEGF +936: MMP9 -1562 CA-CC-CC 27 (37,50) 84 (24,78) 1,82 1,06-3,12 0,0399
VEGF -2578:VEGF +936: MMP9 -1562 CA-TT-CT 2 (2,78) 0 (0,00) 14,37 1,47-140,12 0,0303
VEGF -2578:MMP2 -1306: MMP9 -1562 CA-CC-CC 24 (33,33) 66 (21,64) 1,81 1,03-3,17 0,0453
VEGF +936:MMP2 -1306: MMP9 -1562 CC-CC-CC 31 (43,06) 75 (25,51) 2,21 1,29-3,77 0,0055
VEGF +936:MMP3 -1171: MMP9 -1562 CC-55-CC 15 (20,83) 6 (6,82) 3,60 1,32-9,83 0,0104
VEGF -2578:VEGF +936: MMP2 -1306:MMP3 -1171 CA-CC-CC-66 10 (13,89) 29 (2,35) 6,69 1,42-31,65 0,0127
VEGF -2578:VEGF +936: MMP2 -1306:MMP9 -1562 CA-CC-CC-CC 22 (30,56) 39 (13,54) 2,81 1,53-5,14 0,0013
VEGF -2578:VEGF +936: MMP2 -1306:MMP9 -1562 CA-TT-CC-CT 2 (2,78) 0 (0,00) 12,21 1,25-119,15 0,0396
VEGF -2578:VEGF +936: MMP2 -1306:MMP3 -1171: MMP9 -1562 CA-CC-CC-66-CC 8 (11,11) 2 (2,35) 5,19 1,06-25,27 0,0445
Примечание. См. примечание к таблице 1.
Note. As for Table 1.
Анализ топологии генной сети, представленной на данном рисунке, позволил нам выделить главные гены и главные межгенные взаимодействия, которые вносят наибольший вклад в развитие первичной лимфедемы. На наш взгляд, в качестве главных маркеров могут выступать три полиморфизма: MMP2 -1306 CC, MMP9 -1562 CC
и VEGF +936 СС. Эти гены формируют основные узлы в генной сети, поскольку имеют наибольшее количество взаимодействий с другими генами. Именно они формируют главные межгенные взаимодействия: [VEGF +936 СС:ММР2 -1306 СС] (20%), [VEGF-2578CA:VEGF+936СС] (20%), [ММР2 -1306 СС:ММР9 -1562 СС] (13%), на долю
ТАБЛИЦА 3. ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЧАСТОТ ГЕНОТИПОВ ГЕНОВ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ И ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ У ПАЦИЕНТОВ С ПЕРВИЧНОЙ ЛИМФЕДЕМОЙ С ОЖИРЕНИЕМ И НОРМАЛЬНЫМ ИНДЕКСОМ МАССЫ ТЕЛА
TABLE 3. FEATURES OF DISTRIBUTION OF GENOTYPES FREQUENCIES OF MATRIX METALLOPROTEINASES AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR GENES AT PATIENTS WITH PRIMARY LYMPHEDEMA WITH ADIPOSITY AND NORMAL BODY MASS INDEX
Полиморфная позиция Polymorphic position Генотип Genotype Пациенты с первичной лимфедемой и ИМТ > 30 Patients with primary lymphedema and BMI > 30 n = 29 Пациенты с первичной лимфедемой и ИМТ < 25 Patients with primary lymphedema and BMI < 25 n = 24 OR OR_CI95 P_tmF2
VEGF -2578 CC 7 (24,14) 6 (25,00) 0,95 0,27-3,35 1,0000
VEGF -2578 CA 14 (48,28) 16 (66,67) 0,47 0,15-1,43 0,2660
VEGF -2578 AA 8 (27,59) 2 (8,33) 4,19 0,80-22,06 0,0915
VEGF +936 CC 24 (82,76) 19 (79,17) 1,26 0,32-5,01 1,0000
VEGF +936 CT 4 (13,79) 2 (8,33) 1,76 0,29-10,56 0,6779
VEGF +936 TT 1 (3,45) 3 (12,50) 0,25 0,02-2,58 0,3178
MMP2 -1306 TT 1 (3,45) 1 (4,17) 0,82 0,05-13,87 1,0000
MMP2 -1306 TC 7 (24,14) 8 (33,33) 0,64 0,19-2,12 0,5467
MMP2 -1306 CC 21 (72,41) 15 (62,50) 1,58 0,49-5,03 0,5575
MMP3 -1171 5А5А 9 (31,03) 4 (16,67) 2,25 0,59-8,52 0,3381
MMP3 -1171 5А6А 13 (44,83) 8 (33,33) 1,63 0,53-4,98 0,4160
MMP3 -1171 6А6А 7 (24,14) 12 (50,00) 0,32 0,10-1,02 0,0836
MMP9 -1562 CC 21 (72,41) 14 (58,33) 1,88 0,59-5,92 0,3841
MMP9 -1562 CT 7 (24,14) 8 (33,33) 0,64 0,19-2,12 0,5467
MMP9 -1562 TT 1 (3,45) 2 (8,33) 0,39 0,03-4,62 0,5841
VEGF +936:MMP3 -1171 CC-6A6A 4 (13,79) 10 (41,67) 0,22 0,06-0,85 0,0303
VEGF +936:MMP3 -1171: MMP9 -1562 CC-5A6A-CC 10 (34,48) 2 (8,33) 5,79 1,13-29,77 0,0452
VEGF +936:MMP3 -1171: MMP9 -1562 CC-6A6A-CC 2 (6,90) 8 (33,33) 0,15 0,03-0,79 0,0307
Примечание. См. примечание к таблице 1.
Note. As for Table 1.
которых приходится 53% от всех взаимодействий в генной сети.
Поскольку лимфедема, независимо от причины, часто осложняется рожистым воспалением, которое вызывает облитерацию оставшихся лимфатических сосудов, результатом чего является прогрессирование, мы провели анализ полиморфизма генов VEGF и ММР у пациентов с ПЛ в зависимости от наличия или отсутствия рожистого
воспаления. Однако нами не выявлено каких-либо различий в распределении частот между этими группами по исследуемым генам. Комплексный анализ также не выявил различий между данными группами. Напротив, выявлен ряд достоверно различающихся комплексных генотипов у пациентов с ПЛ с нормальным ИМТ (менее 25) и ожирением (ИМТ более 30) (табл. 3). Так, частота комплексного генотипа VEGF+936CC:MMP3
-1171 5А6А:ММР9 -1562 СС у пациентов с ожирением повышена более чем в пять с половиной раз относительно пациентов с нормальным ИМТ.
Обсуждение
Несмотря на то, что выявлены некоторые ключевые детерминанты лимфангиогенеза, такие как факторы роста эндотелия сосудов VEGF-C/D, VEGFR 3 рецептор, транскрипционный фактор Ршх1, мембранный гликопротеин подопланин (PDPN), эндотелиальный рецептор-1 гиалуро-нана лимфатических сосудов ^УУЕ-1) и др. [21], генетическая составляющая патологии, связанной с лимфатической системой, на сегодняшний день остается недостаточно ясной. Мы проанализировали пять однонуклеотидных полиморфизмов в регуляторных областях трех генов, продукты которых могут быть ассоциированы с нарушениями лимфотока.
Достоверные различия между группами выявлены в нашем исследовании только в распределении частот ММР2 генотипов, причем у пациентов с ПЛ повышена частота ММР2 -1306 СС генотипа. Полиморфизм гена ММР2 С (-1306) Т, как известно, нарушает промоторный сайт Sp1-типа (бокс ССАСС), что приводит к снижению активности промотора, связанной с аллелем Т [16]. Показано, что уровень ММР-2 mRNA выше у пациентов с нарушениями лимфотока конечностей относительно пациентов без таковых нарушений, а блокировка или экспериментальное снижение активности гена приводят к снижению лимфан-гиогенеза [8, 11]. Повышение частот генотипов, ассоциированных с более высоким уровнем продукции гена ММР2 в других полиморфных сайтах, было выявлено при обследовании пациентов с развитием лимфедемы. Авторы предполагают, что увеличенное количество ММР-2 может изменять и реконструировать экстрацеллюлярную матрицу вокруг сосудов и тем самым способствовать развитию патологии. Ими же выдвигается другая гипотеза, что ММР-2 способствует нарушению плотности сосудов и транссудации жидкости из сосудов в ткани, стимулируя тем самым образование отеков [10, 17, 24]. Данные эффекты могут быть реализованы через макрофаги, количество которых в лимфедематозных тканях существенно увеличивается, при этом они влияют на экспрессию фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) [23, 25]. Также макрофаги стимулируют фиброз, продуцируя профиброти-ческие цитокины, такие как трансформирующий фактор роста, активируя фибробласты, стимулируя миграцию миофибробластов, увеличивая синтез коллагена, и содействуют расщеплению продуктов внеклеточного матрикса путем увеличения продукции матричных металлопротеиназ
и снижения экспрессии профибротических ци-токинов [12]. Кроме того, показано, что MMP-2 in vivo может проявлять себя как коллагеназа, а не как классическая желатиназа, что также способствует патологическому лимфангиогенезу [11].
Несмотря на то, что анализ других проанализированных нами полиморфных генов не показал различий между группами, анализ комплексных генотипов выявил ряд комплексов, позитивно ассоциированных с развитием ПЛ, причем отношения шансов развития болезни у носителей данных сложных генотипов достаточно высоки. Выявлены позитивно ассоциированные с ПЛ комплексы как с наличием MMP2-1306 СС генотипа, так и без него, что указывает на сложные генетические сетевые взаимодействия, реализуемые в предрасположенности к болезни, даже при отсутствии однонуклеотидных ассоциаций. Подобные закономерности были показаны нами и при анализе ряда других патологий [2]. Поскольку гены, включенные в комплексный анализ, отражают сетевые взаимодействия их продуктов, подобный подход может являться важным звеном раннего прогноза развития нарушений лимфото-ка конечностей. Выявленные нами сетевые взаимодействия, визуализированные на рисунке 1, подтверждаются и современными методами математического моделирования. Сложные сетевые взаимодействия генов при развитии лимфедемы были показаны ранее методом математического моделирования с использованием пакета программ MetaCore. Показано, что высокая экспрессия VEGF-A увеличивает уровни MMP-2. Одновременно MMP2 регулирует MMP9 и ряд других генов [13]. Аналогичные сетевые взаимодействия выявлены и для ряда других заболеваний [14], что указывает на важность учета синергетических эффектов при анализе ассоциаций определенных генов с заболеванием.
Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать об определенном значении полиморфизма матриксных металлопротеиназ, в частности ММР2, на патогенез развития первичной лимфедемы конечностей. Изменения структуры внеклеточного матрикса, происходящие вследствие нарушений лимфатического оттока, могут быть обусловлены нарушениями процессов его ремоделирования, развития фиброза и хронического воспаления, регулируемыми в том числе матриксной металлопротеиназой ММР2. Построение генных сетей транскрипционной регуляции и их топологический анализ позволяет строить и изучать структурно-функциональную организацию ген-генных взаимодействий применительно к исследованию патогенеза первичной лимфедемы для разработки в последующем подходов к персонифицированной профилактике и терапии.
Список литературы / References
1. Повещенко А.Ф., Нимаев В.В., Любарский М.С., Коненков В.И. Медицинские и генетические аспекты лимфедемы // Медицинская генетика, 2010. № 9. С. 3-9. [Poveshchenko A.F., Nimaev V.V., Lubarsky M.S., Konenkov V.I. Medical and genetical aspects of lymphedema. Meditsinskaya genetika = Medical Genetics, 2010, no. 9, pp. 3-9. (In Russ.)]
2. Шевченко А.В., Прокофьев В.Ф., Королев М.А., Омельченко В.О., Коненков В.И. Полиморфизм генов эндотелиальной дисфункции, коактиваторов митохондриального биогенеза и плазминоген-плазмино-вой системы в развитии кардиоваскулярных осложнений при ревматоидном артрите // Научно-практическая ревматология, 2018. Т. 56, № 1. С. 55-59. [Shevchenko A.V., Prokofyev V.F., Korolev M.A., Omelchenko V.O., Konenkov V.I. Gene polymorphisms of endothelial dysfunction, coactivators of mitochondrial biogenesis and plasminogen/plasmin system in the development of cardiovascular events in rheumatoid arthritis. Nauchno-prakticheskaya revmatologiya = Rheumatology Science and Practice, 2018, Vol. 56, no. 1, pp. 55-59. (In Russ.)]
3. Aspelund A., Robciuc M.R., Karaman S., Makinen T., Alitalo K. Lymphatic system in cardiovascular medicine. Circ. Res., 2016, Vol. 118, pp. 515-530.
4. Bennuru S., Nutman T.B. Lymphangiogenesis and lymphatic remodeling induced by filarial parasites: implications for pathogenesis. PLoS Pathog., 2009, Vol. 5, no. 12, e1000688. doi: 10.1371/journal.ppat.1000688.
5. Bennuru S., Maldarelli G., Kumaraswami V., Klion A.D., Nutman T.B. Elevated levels of plasma angiogenic factors are associated with human lymphatic filarial infections. Am. J. Trop. Med. Hyg., 2010, Vol. 83, no. 4, pp. 884-890.
6. Bruyere F., Melen-Lamalle L., Blacher S., Roland G., Thiry M., Moons L., Frankenne F.., Carmeliet P., Alitalo K., Libert C., Sleeman J.P., Foidart J.M., Noël A. Modeling lymphangiogenesis in a three-dimensional culture system. Nat. Methods., 2008, Vol. 5, no. 5, pp. 431-437.
7. Chou Y.-E., Chen W.-H., Luo C.-B., Yang S.-F. Polymorphism in dural arteriovenous fistula: matrix metalloproteinase-2-1306 C/T as a potential risk factor for sinus thrombosis. J. Throm. Haemost., 2018, Vol. 16, no. 4, pp. 802-808.
8. Couto R.A., Kulungowski A.M., Chawla A.S., Fishman S.J., Greene A.K. Expression of angiogenic and vasculogenic factors in human lymphedematous tissue. Lymphat. Res. Biol., 2011, Vol. 9, no. 3, pp. 143-149.
9. Debrah A.Y., Mand S., Toliat M.R., Marfo-Debrekyei Y., Batsa L., Nürnberg P., Lawson B., Adjei O., Hoerauf A., Pfarr K. Plasma vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) and VEGF-A gene polymorphism are associated with hydrocele development in lymphatic filariasis. Am. J. Trop. Med. Hyg., 2007, Vol. 77, no. 4, pp. 601-608.
10. Debrah L.B., Albers A., Debrah A.Y., Brockschmidt F.F., Becker T., Herold C., Hofmann A., Osei-Mensah J., Mubarik Y., Fröhlich H., Hoerauf A., Pfarr K. Single nucleotide polymorphisms in the angiogenic and lymphangiogenic pathways are associated with lymphedema caused by Wuchereria bancrofti. Hum. Genomics, 2017, Vol. 11, no. 1, 26. doi: 10.1186/s40246-017-0121-7.
11. Detry B., Erpicum C., Paupert J., Blacher S., Maillard C., Bruyere F., Pendeville H., Remacle T., Lambert V., Balsat C., Ormenese S., Lamaye F., Janssens E., Moons L., Cataldo D., Kridelka F., Carmeliet P., Thiry M., Foidart J-M., Struman I., Noe A. Matrix metalloproteinase-2 governs lymphatic vessel formation as an interstitial collagenase. Blood, 2012, Vol. 119, no. 21, pp. 5048-5056.
12. Duffield J.S., Forbes S.J., Constandinou C.M., Clay S., Partolina M., Vuthoori S., Wu S., Lang R., Iredale J.P. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest., 2005, Vol. 115, no. 1, pp. 56-65.
13. Froehlich H., Fellmann M., Sueltmann H., Poustka A., Beissbarth T. Large scale statistical inference of signaling pathways from RNAI and microarray data. BMC Bioinformatics., 2007, Vol. 8, no. 1, 386. doi:10.1186/1471-2105-8-386.
14. Gong J., Zhu S., Zhang Y., Wang J. Interplay of VEGF a and MMP2 regulates invasion of glioblastoma. Tumour Biol., 2014, Vol. 35, no. 12, pp. 11879-11885.
15. Heckman C.A., Holopainen T., Wirzenius M., Keskitalo S., Jeltsch M., Ylä-Herttuala S., Wedge S.R., Jürgensmeier J.M., Alitalo K. The tyrosine kinase inhibitor cediranib blocks ligand-induced vascular endothelial growth factor receptor-3 activity and lymphangiogenesis. Cancer Res., 2008, Vol. 68, no. 12, pp. 4754-4762.
16. Jacob-Ferreira A.L.B., Lacchini R., Gerlach R., Passos C.J., Barbosa F.Jr, Tanus-Santos J. A common matrix metalloproteinase (MMP)-2 polymorphism affects plasma MMP-2 levels in subject environmentally exposed to mercury. Sci. Total Environ., 2011, Vol. 409, no. 20, pp. 4242-4246.
17. Kelly M.A., Shuaib A., Todd K.G. Matrix metalloproteinase activation and blood-brain barrier breakdown following thrombolysis. Exp. Neurol., 2006, Vol. 200, no. 1, pp. 38-49.
18. Mac Gabhann F., Qutub A.A., Annex B.H., Popel A.S. Systems biology of pro-angiogenic therapies targeting the VEGF system. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med., 2010, Vol. 2, no. 6, pp. 694-707.
19. Nagy J.A., Vasile E., Feng D., Sundberg C., Brown L.F., Detmar M.J., Lawitts J.A., Benjamin L., Tan X., Manseau E.J., Dvorak A.M., Dvorak H.F. Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor induces lymphangiogenesis as well as angiogenesis. J. Exp. Med., 2002, Vol. 196, no. 11, pp. 1497-1506.
20. Okamoto K., Mimura K., Murawak Y., Yuasa I. Association of functional gene polymorphisms of matrix metalloproteinase MMP-1, MMP-3 and MMP-9 with the progression of chronic liver disease. J. Gastr. Hepatol., 2005, Vol. 20, no. 7, pp. 1102-1108.
21. Renner W., Kotschan S., Hoffmann C., Obermayer-Pietsch B., Pilger E. A common 936 C/T mutation in the gene for vascular endothelial growth factor is associated with vascular endothelial growth factor plasma levels. J. Vasc. Res, 2000, Vol. 37, pp. 443-448.
22. Rigo J.Jr. Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in severe preeclampsia. Mol. Hum. Reprod., 2006, Vol. 12, pp. 233-236.
23. Tammela T., Alitalo K. Lymphangiogenesis: Molecular mechanisms and future promise. Cell, 2010, Vol. 140, no. 4, pp. 460-476.
24. Whitehurst B., Flister M.J., Bagaitkar J., Volk L., Bivens C.M., Pickett B., Castro-Rivera E., Brekken R.A., Gerard R.D., Ran S. AntiVEGF-A therapy reduces lymphatic vessel density and expression of VEGFR-3 in an orthotopic breast tumor model. Int. J. Cancer, 2007, Vol. 121, no. 10, pp. 2181-2191.
25. Wieczor R., Wieczor A.M., Gadomska G., Stankowska K., Fabisiak J, Suppan K., Pulkowski G., Budzynski J, Rose D. Overweight and obesity versus concentrations of VEGF-A, sVEGFR-1, and sVEGFR-2 in plasma of patients with lower limb chronic ischemia. J. Zhejiang Univ. Sci. B, 2016, Vol. 17, no. 11, pp. 842-849.
26. Wynn T.A., Barron L. Macrophages: master regulators of inflammation and fibrosis. Semin. Liver Dis., 2010, Vol. 30. no. 3, pp. 245-257.
27. Yang Y., Estrada E.Y., Thompson J.F., Liu W., Rosenberg G.A. Matrix metalloproteinase-mediated disruption of tight junction proteins in cerebral vessels is reversed by synthetic matrix metalloproteinase inhibitor in focal ischemia in rat. J. Cereb. Blood Flow Metab., 2007, Vol. 27, no. 4, pp. 697-709.
28. Zampell J.C., Yan A., Elhadad S., Avraham T., Weitman E., Mehrara B.J. CD4+ cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PloS ONE, 2012, Vol. 7, no. 11, e49940. doi: 10.1371/journal. pone.0049940.
Авторы:
Шевченко А.В. — д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммуногенетики, Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск, Россия Прокофьев В.Ф. — к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммуногенетики, Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск, Россия
Коненков В.И. — д.м.н., профессор, академик РАН, руководитель лаборатории клинической иммуногенетики, Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск, Россия
Хапаев Р.С. — к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории оперативной лимфологии и лимфодектоксикации, Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск, Россия Нимаев В.В. — д.м.н., заведующий лабораторией оперативной лимфологии и лимфодектоксикации, Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск, Россия
Поступила 13.12.2019 Отправлена на доработку 29.01.2020 Принята к печати 08.03.2020
Authors:
Shevchenko A.V., PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Clinical Immunogenetics, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
Prokofyev V.F., PhD (Medicine), Leading Research Associate, Laboratory of Clinical Immunogenetics, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
Konenkov V.I., PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Clinical Immunogenetics, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
Khapaev R.S., PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Surgical Lymphology and Lymphodetoxication, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
Nimaev V.V., PhD, MD (Medicine), Head, Laboratory of Surgical Lymphology and Lymphodetoxication, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
Received 13.12.2019 Revision received 29.01.2020 Accepted 08.03.2020
