CC BY
88
полиморфизм генов антиоксидантной системы
у больных рожей и их роль в развитии заболевания
Ч.П. Емене 1, И.Э. Кравченко 2, Г.И. Айбатова 3, А.А. Ризванов 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
3 Республиканская клиническая инфекционная больница им. А.Ф. Агафонова, Казань, Россия
Polymorphism of genes of the antioxidant system in patients with erysipelas and their role in development of the disease
Ch.R. Emene 1, I.E. Kravchenko 2, G.I. Aibatova 3, AA. Rizvanov1
1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
3 A.F. Agafonov Republican Clinical Infectious Diseases Hospital, Kazan, Russia
В исследовании представлен сравнительный анализ распределения полиморфизмов генов ферментов антиок-сидантной системы в группе больных рожей и группе условно здоровых лиц, проживающих в Республике Татарстан . Результаты исследования показали, что полиморфизмы гена ферментов супероксиддисмутазы 1 (SOD1 g7958a), супероксиддисмутазы 2 (T5482C - SOD2 (Ala16Val)) и каталазы (CAT C262T) влияют на предрасположенность к развитию рожи и особенности клинического течения заболевания
Ключевые слова: рожа, антиоксиданты, полиморфизм генов, каталаза (CAT), супероксиддисмутаза (SOD) .
In this research we analyzed the genotype distribution of polymorphisms of genes involved in antioxidant system of erysipelas patients and healthy population in Republic of Tatarstan, Russia . On comparing genotype distribution with healthy controls, we identified that SNPs of superoxide dismutase 1 — SOD1g7958a, superoxide dismutase 2 — SOD2 T5482C (Ala16Val) and catalase - CAT C262T affected the predisposition to erysipelas infection and clinical features
Keywords: Erysipelas, antioxidants, gene polymorphism, catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) .
Введение
Рожа является одним из клинических вариантов стрептококковой инфекции, вызываемой ß-гемолитическим стрептококком группы А, и характеризуется серозно-геморрагическим воспалением кожи и склонностью к рецидивирующему течению . По распространенности заболевание занимает четвертое место в спектре инфекционной патологии и наносит большой социально-экономический ущерб [1]. Заболеваемость рожей в России составляет 15-20 человек на 10 тыс . населения [2], в странах Европы — 4,3 на 10 тыс . [3], в Республике Татарстан — 10—12 на 10 тыс . населения . Несмотря на несомненные успехи, достигнутые в изучении рожи, механизмы развития рожи и причины рецидивирующего течения заболевания до конца не ясны
Ранее проведенными исследованиями установлено, что неотъемлемым и обязательным звеном патогенеза рожи является дисбаланс в оксидантно-антиоксидантной системе . В острый период заболевания наблюдается активация процессов свободно-радикального окисления с увеличением продуктов перекисного окисления липидов на фоне снижения активности антиоксидантной системы крови [4—6].
Антиоксидантная система человека (АОС) — это система, блокирующая образование высокоактивных свободных радикалов и удерживающая про- и антиоксидантное равновесии в пределах нормальной реакции . Главным компонентом АОС является сеть ферментов, активность которых эволюционно и генетически запрограммирована Среди ферментов в первую очередь следует выделить супероксид-дисмутазу (SOD) — антиоксидант, представляющий первое звено защиты, и каталазу (CAT), являющуюся одним из основных ферментов разрушения активных форм кислорода (АФК) . Роль SOD заключается
e-mail: emene . charles@gmail . com
в ускорении реакции превращения токсичного для организма кислородного радикала — супероксида (O2- . ) в перекись водорода (H2O2) и молекулярный кислород . Известно 2 основных изоформы SOD: ци-тозольная (Cu/Zn SOD — SOD1) и митохондриальная (Mn-SOD, SOD2). Изоформа SOD1 содержит медь (Cu) и цинк (Zn) в активном участке и встречается преимущественно в цитозоле, ядре и митохондриях Ген SOD1 локализован на 21 хромосоме (21q22 . 11) [7]. Изоформа SOD2 встречается в межмембранном пространстве митохондрий (MnSOD) и содержит марганец или железо в активном сайте [8]. Ее ген локализован на 6-й хромосоме (6q25 3) каталаза (CAT) — снижает окислительный стресс путем катализированного превращения Н2О2 в воду и кислород во всех аэробных клетках Ген каталазы расположен на хромосоме 11(11р13) и состоит из 13 экзонов . Описано значительное количество однонуклеатид-ных мутаций генов данных ферментов . Известно, что полиморфные варианты генов ферментов, обуславливая функциональную активность белковых продуктов, могут влиять на широкий спектр биохимических реакций и детерминировать риск развития широкого спектра патологических состояний
На сегодняшний день остается не изученной роль генов, кодирующих активность ферментов антиоксидантной системы (АОС), в патогенезе рожи . В связи с этим целью данной работы явилось изучение вклада полиморфных вариантов генов АОС в формирование предрасположенности к заболеванию рожей и выявление взаимосвязи с клиническим течением заболевания
Материал и методы
Под наблюдением находилось 74 больных рожей, госпитализированных в ГАУЗ «Республиканская
клиническая инфекционная больница им . проф . А . Ф . Агафонова» МЗ РТ (68,9% женщин и 31,1% мужчин) в возрасте от 40 до 88 лет (63,89±10,33). Пациенты распределялись по кратности заболевания: первичная форма — 39 чел . (52,7%) и рецидивирующая — 35 чел . (47,3%) . Эритематозная форма рожи диагностирована у 34 (46%) больных, эрите-матозно-буллезная форма — у 40 (54%) больных . Заболевание протекало в среднетяжелой форме у 65 (87,8%) пациентов, в тяжелой — у 9 (12,2%).
Контрольную группу составили 55 относительно здоровых лиц в возрасте от 35 до 79 лет (58,34±6,93), из них: женщин — 59%, мужчин — 41% . У всех пациентов было получено информированное согласие на проведение данного исследования как больные, так и лица группы контроля представляли собой смешанную популяцию Республики Татарстан
Выделение геномной ДНК осуществляли из 5 мл замороженной венозной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [9]. В извлеченной ДНК определяли 4 однонуклеотид-ных полиморфизма (ОНП) 2 генов ферментов АОС — супероксиддисмутазы и каталазы: SOD1 G7958A, SOD2 Ala16Val (T5482C), SOD2 C60T и CAT C-262T . В работе использованы диагностические комплекты ОНП (Литех, Россия) . Процедура ПЦР была выполнена согласно инструкциям производителя [10]. Генотипирование повторно проводили на 10% случайных проб и результаты были идентичны с первичными данными
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью программы IBM SPSS 22 [11] и онлайн-ресурса SNPstat [12]. Значимость
различий между группами по частотам встречаемости аллелей и генотипов исследованных полиморфизмов оценивали по критерию х2 при уровне значимости р = 0,05 . Для оценки вклада полиморфных локусов в развитие рожи рассчитывали отношение шансов (ОШ), проводили дисперсионный анализ и логическую регрессию (для оценки демографических и клинических различий между группами на категорических переменных) и 95% доверительный интервал для ОШ (ДИОШ) с программой IBM SPSS 22 Соответствие аллелей и частоты генотипа в основной и контрольной группах с уравнением Харди-Вайнберга, и влияние полиморфизмов на течение болезни было вычислено при помощи SNPstat .
Результаты и обсуждение
Для выявления связей генетического полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с развитием рожи и особенностями клинического течения заболевания проведен сравнительный анализ распределения изучаемых генотипов SOD1, SOD2 и CAT в группе больных рожей и контрольной группе здоровых лиц (табл . 1). В связи с тем, что ассоциации генов при развитии заболевания могут характеризоваться половым деморфизмом исследована связь полиморфных вариантов генов с предрасположенностью к развитию рожи раздельно у мужчин и женщин
Результаты анализа частот аллелей генов ферментов АОС группы здоровых лиц и группы больных рожей позволили установить ассоциации отдельных вариантов с предрасположенностью к развитию рожи (табл 1)
Кол-во чел.(n) ОНП генов ферментов АОС
Критерии распределения SOD1 G7958A (%) MnSOD C60T (%) SOD2 Ala16Val (%) CAT C262T (%)
Группа больных 74 GG = 63,5 СС = 77,0 Ala/Ala = 27,0 CC = 54,1
GA = 25,7 CT = 13,5 Ala/Val = 60,8 CT = 40,5
AA = 5,4 TT = 4,1 Val/Val = 8,1 TT = 1,4
G = 81 C = 89 Ala = 60 C = 77
A = 19 T = 11 Val = 40 T = 23
Контрольная группа 55 GG = 14,6 CC = 67,3 Ala/Ala = 14,5 CC = 33,3
GA = 85,4 CT = 29,1 Ala/Val = 49,1 CT = 61,1
AA = 0,0 TT = 3,6 Val/Val = 36,4 TT = 5,6
G = 57 C = 82 Ala = 39 C = 64
A = 41 T = 18 Val = 61 T = 36
р по генотипу между группами <0,001 0,129 <0,001 0,026
р по генотипу при сравнение муж 0,003 0,162 0,190 0,149
между полами жен <0,001 0,344 0,002 0,183
ОШ (95% С1); р G = 3,51 (1,61-5,06) A = 1; p < 0,001 C = 2,14 (0,85-3,51) T = 1; p = 0.134 Ala = 2,92 (1,40-3,86) Val = 1; p = 0.001 C = 2,44 (1,11-3,39) T = 1; p = 0.019
Таблица 1. Сравнительная характеристика частот аллелей и генотипов по исследованным локусам в группах рожей и условно здоровых лиц
Установлено значительное отличие в распределении полиморфизма SOD1 G7958A между группами больных рожей и условно здоровых лиц (р<0,001): генотип GG фермента определен у 63,5% больных и только у 14,6% здоровых . Склонность к развитию заболевания при наличии аллели G (81%) была выше, чем при наличии аллели А (19%) . По данным ОШ риск развития рожи при наличии аллели G был выше . Данная достоверная ассоциативная связь с развитием рожи была установлена как в группе мужчин (р<0,003), так и в группе женщин (р<0,001) .
Распределение ОНП по генотипу SOD2 С60Т показало отсутствие достоверных отличий между группами больных рожей и здоровых лиц
Выявлены достоверные отличия по генотипу SOD2 Ala16Val в основной и контрольной группах
(p<0,001) . Относительный риск развития рожи при наличии аллели C, участвующией в кодировании аланина (Ala), был выше, чем при наличии аллели Т, участвующей в кодировании валина (Val) . Достоверная связь с развитием рожи по генотипу SOD2 Ala16Val была выявлена только у лиц женского пола (р = 0,002) и отсутствовала у лиц мужского пола (р = 0,190) .
По генотипу CAT С262Т установлены достоверные отличия между группой больных рожей и группой здоровых лиц (р = 0,026), но отсутствовали гендерные отличия . ОШ развития рожи для аллели С было выше, чем для аллели Т .
Изучены особенности взаимодействия ОНП генов ферментов SOD и CAT при различных клинических вариантах течения рожи (табл 2)
Таблица 2. Сравнительная характеристика частот аллелей и генотипов по исследованным локусам в зависимости от клинического течения рожи
Критерии распределения Кол-во чел. (n) SOD1 G7958A (%) MnSOD C60T (%) SOD2 Ala16Val (%) CATC262T (%)
По кратности
Первичная рожа 39 GG = 63 СС = 82 Ala/Ala = 32 СС = 58
GA = 34 CT = 13 Ala/Val = 61 CT = 39
AA = 3 TT = 5 Val/Val = 8 TT = 3
G = 80 С = 88 Ala = 62 С = 78
A = 20 T = 12 Val = 38 T = 22
Рецидивирующая рожа 35 GG = 72 СС = 82 Ala/Ala = 22 СС = 55
GA = 19 CT = 15 Ala/Val = 69 CT = 45
AA = 9 TT = 3 Val/Val = 9 TT = 0,0
G = 81 С = 89 Ala = 56 С = 77
A = 19 T = 11 Val = 44 T = 23
p (перв/рец) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
По местному процессу
Эритематозная 34 GG = 79 СС = 82 Ala/Ala = 12 СС = 56
GA = 21 CT = 15 Ala/Val = 76 CT = 44
AA = 0 TT = 3 Val/Val = 12 TT = 0
G = 90 С = 90 Ala = 50 C = 78
A = 10 T = 10 Val = 50 T = 22
Эритематозно- 40 GG = 56 СС = 81 Ala/Ala = 42 СС = 57
буллезная- GA = 33 CT = 14 Ala/Val = 53 CT = 41
AA = 11 TT = 5 Val/Val = 6 TT = 3
G = 72 С = 88 Ala = 68 C = 77
A = 28 T = 12 Val = 32 T = 23
p (эрит/эрит-буллез) <0,05 >0,05 <0,05 >0,05
ОШ (p) G = 3,35 (0,011) Ala = 0,50 (0,049)
По тяжести
Среднетяжелое 65 GG = 67 СС = 84 Ala/Ala = 25 СС = 56
течение GA = 26 CT = 11 Ala/Val = 66 CT = 42
AA = 7 TT = 5 Val/Val = 10 TT = 2
G = 80 C = 90 Ala = 58 C = 77
A = 20 T = 10 Val = 42 T = 23
Тяжелое течение 9 GG = 67 СС = 67 Ala/Ala = 66 СС = 56
GA = 33 CT = 33 Ala/Val = 34 CT = 44
AA = 0 TT = 0 Val/Val = 0 TT = 0
G = 83 C = 83 Ala = 83 C = 78
A = 17 T = 17 Val = 17 T = 22
p (сртяж/тяж) >0,05 >0,05 <0,05 >0,05
ОШ (p) Ala = 0,28 (0,034)
Мы не нашли существенной разницы в распределении генотипов по исследуемым полиморфизмам при первичной и рецидивирующей формах рожи (р > 0,05). Выявлены достоверные отличия по генотипу SOD1 G7958A и SOD2 Ala16Val и характеру местного процесса (p < 0,05). По значению ОШ следует, что аллель G для SOD1 G7958A увеличивает шанс развития эритематозной формы, тогда как аллель Ala из SOD2 Ala16Val уменьшает шанс развития эритематозной формы . Установлена взаимосвязь между тяжестью заболевания и генотипом SOD2 Ala16Val (p<0,05): преобладание аллели Ala повышает риск развития тяжелого течения рожи Из литературных данных известно более 150 мутаций SOD1 и установлена ассоциация полиморфизма SOD1 с риском возникновения бокового амиотрофического склероза, рака груди, простаты, желудка [13, 14]. Проведенные исследования позволили установить, что предрасположенность к заболеванию рожей увеличивается в значительной мере при наличии аллели G при ОНП SOD1 G7958A у обоих полов, а при развитии заболевания аллель A увеличивает риск развития эритематозно-буллез-ной формы . Генотип G также связан с пониженной экспрессией мРНК SOD1 [15] и, как следствие, с увеличением количества свободных радикалов в клетке На сегодняшний день мало известно о функциональном значении полиморфизма SOD1 G7958A, но установлено, что мутантная аллель (А) в SOD1 связана с повышенной экспрессией мРНк SOD1 в клеточных линиях
Сравнение распределения ОНП SOD2 Ala16Val между контрольной и основной группами показало связь с предрасположенностью к заболеванию рожей, которая более выражена у женщин при наличии аминокислоты аланина (кодирующиейся аллелью C) . (см табл 1) Похожее гендерно-специфическое действие SOD2 было продемонстрировано при других заболеваниях человека [16]. Широко изучен одно-нуклеатидный полиморфизм (ОНП) Ala16Val, где имеется замена аланина на валин в 16 положении пептида. Данный ОНП приводит к дестабилизации a-спирального участка, что обуславливает снижение переноса фермента из цитоплазмы в митохондрии [4]. Установлено повышение встречаемости Ala16Val гена SOD2 у больных с онкопатологией, хроническим вирусным гепатитом С, ишемической болезнью сердца [13]. Вероятно, что антиоксидантная защита SOD2 Ala16Val в митохондриях влияет на тяжесть течения рожи, так как генотип Val связан с большим количеством антиоксиданта SOD2 в митохондриях, что способствует купированию окислительных процессов . Ранее было показано, что аллель Т, кодирующая синтез валина в SOD2 (Ala16Val), в 33% случаев приводит к увеличению количества белка SOD2 [17]. Избыточная экспрессия SOD2 имеет противовоспалительное действие при различных заболеваниях [18]. В нашем эксперименте мы установили, что при наличии аллели С повышается риск развития рожи, а так же увеличивается предрасположенность к тяжёлым формам заболевания . Наличие мутантной аллели Т (Val) снижает риск развития эритематозно-буллезной формы
В 2003 г . D . Hernandez и др . [19] показали, что замещение C на Т в SOD2 С60Т изменяет взаимо-
действия субъединицы белка SOD2, и фермент становится термически неустойчивыми и уязвимыми, и легко инактивируется при действии смешанных сульфидов и S-тиолированной реакции на них . Это приводит к снижению активности SOD2 и последующему повышению окислительного стресса В нашем эксперименте мы не выявили связи этого ОНП с заболеванием рожей
Аллель дикого типа САТ (C) CATc262t ОНП, которая находится в промоторе, контролирующем активность гена каталазы, инициирует транскрипцию белка каталазы в 1,9 раза меньше, чем аллель Т . Ранее было показано, что дикий тип САТ (генотип CC) имеет сниженный эффект защиты лимфоцитов от однонитевых разрывов ДНК, чем при генотипах СТ и ТТ [20]. В нашем исследовании мы так же установили повышение шансов развития рожи при наличии у пациента аллели С .
Выводы
1. Аллели и генотипы полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы ассоциированы с предрасположенностью к развитию рожи . В наибольший степени на риск возникновения рожи оказывали влияние полиморфизмы SOD1g7958a, SOD2 Т5482C(Ala16Val) и CA^c262t .
2 Отдельные генотипы оказывали влияние на клиническое течение заболевания: аллель А^ SOD2 Ala16Val ассоциировалась с повышенным риском тяжелого течения рожи, аллель A SOD1 G7958A и аллель Ala SOD2 Ala16Val — с развитием эритема-тозно-буллезной формы
3 Установлены гендерные различия в ассоциациях генов ферментов АОС с риском развития рожи: у женщин в предрасположенности к роже важную роль играли полиморфизмы генов SOD2 Ala16Val .
4 Генетическую основу предрасположенности к роже составляют сложные взаимодействия между генами ферментов АОС, которые на фенотипиче-ском уровне могут объяснять имеющийся дисбаланс в оксидантно-антиоксидантной системе и усиление проявлений окислительного стресса, являющихся ведущими патогенетическими механизмами развития рожи
5 Полиморфизмы генов ферментов АОС взаимосвязаны с клиническими проявлениями рожи и в сочетании с другими факторами риска могут являться значимыми прогностическими факторами вероятности возникновения рожи
Благодарности
Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Миноб-рнауки России (ID RFMEFI59414X0003) и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Брико Н . И . Энтеровирусные неполиомиелитные инфекции . Медсестра 2006; (7): 2-4 .
2 . Ратникова Л . И . Современные клинико-лабораторные и тендерные особенности рожи . Эпидемиология и инфекционные болезни 2013; 3(3): 19-21.
3 . Celestin R ., Brown J ., Kihiczak G ., Schwartz R .A . Erysipelas: A common potentially dangerous infection . Acta Dermatovenerologica Alpina, Pannonica Adriat . 2007; 16(3): 123-7 .
4 . Загидуллина А . И . Влияния системной озонотерапии на локальный отек при роже нижних конечностей . Медицина и здравоохранение 2006; 4: 37-40 .
5 . Павелкина В . Ф ., Чирясова М . Г . Влияние эмоксипина на эндогенную интоксикацию и антиоксидантную защиту при гриппе . Успехи современного естествознания 2006; 11: 97 .
6 . Кравченко И . Э . Патогенетическое обоснование и терапевтическая коррекция нестабильности клеточного генома при ангине как стрептококковой инфекции (клинико-экспериментальное исследование) [диссертация] . Казань, 2011.
7 . Liu Y., Zha L ., Li B . et al . Correlation between superoxide dismutase 1 and 2 polymorphisms and susceptibility to oral squamous cell carcinoma . Exp . Ther . Med . 2014; 7(1): 171-8 .
8 . Okado-Matsumoto A., Fridovich I . Subcellular distribution of superoxide dismutases (SOD) in rat liver. Cu,Zn-SOD in mitochondria . J . Biol . Chem . 2001; 276(42): 38388-93 .
9 . Sambrook J ., Fritsch E . F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 2nd Ed . , New York: Cold Spring Harbor laboratory press; 1989: 931-57 .
10 . Руководство «SNP-ЭКСПРЕСС» с электрофоретической детекцией, http://www . lytech . ru/articles_114 . htm .
11. Field A . Discovering Statistics Using SPSS . 3rd ed . Sage publications Ltd; 2005 .
12 . Solé X ., Guinó E ., Valls J . et al . SNPStats: a web tool for the analysis of association studies . Bioinformatics 2006; 22(15): 1928-9 .
13 . Колесникова Л ., Баирова Т ., Первушина О . Гены ферментов антиоксидантной системы . Вестик РАМН 2013; 12: 83-8 .
14 . Kase B ., Northrup H ., Morrison A. et al . Association of copper-zinc superoxide dismutase (SOD1) and manganese superoxide dismutase (SOD2) genes with nonsyndromic myelomeningocele . Birth Defects Res . Part A . Clin . Mol . Тeratol . 2012; 94(10): 762-9 .
15 . Yi J ., Li Y ., Liu Т . et al . Mn-SOD and ^Zn-SOD polymorphisms and interactions with risk factors in gastric cancer . World J . Gastroenterol . 2010; 16(37): 4738-46 .
16 . Ober С ., Loisel D . , Gilad Y . Sex-specific genetic architecture of human disease . Nat . Rev . Genet . 2008; 9(12): 911-22 .
17 . Bastaki M . , Huen K . , Manzanillo P . et al . Genotype-activity relationship for Mn-superoxide dismutase, glutathione peroxidase 1 and catalase in humans . Pharmacogenet Genomics 2006; 16(4): 279-86
18 . Li С ., Zhou H . ТЬш Role of Manganese Superoxide Dismutase in Inflammation Defense . Enzyme Research 2011; 2011: 1-6 .
19 . Hernandez-Saavedra D ., McCord J . Paradoxical effects of thiol reagents on Jurkat cells and a new thiol-sensitive mutant form of human mitochondrial superoxide dismutase . Cancer Res . 2003; 63(1): 159-63 .
20 . Forsberg L ., Lyrenas L ., de Faire U ., Morgenstern R . A common functional C-Т substitution polymorphism in the promoter region of the human catalase gene influences transcription factor binding, reporter gene transcription and is correlated to blood catalase levels . Free Radic . Biol . Med . 2001; 30(5): 500-5 .
Поступила: 12.11.2015
