CC BY
90
УДК 575.174.015.3:616.1
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ALA16VAL ГЕНА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ 2
V V V
(SOD2) С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА У МУЖЧИН В РОССИЙСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
Т.В. Жейкова1, М.В. Голубенко1- 4, С.В. Буйкин1, О.А. Макеева1- 4, А.А. Лежнев2, И.В. Цимбалюк3, В.М. Шипулин2, В.П. Пузырев1
1ФГБУ "НИИ медицинской генетики" СО РАМН, Томск 2ФГБУ "НИИ кардиологии" СО РАМН, Томск 3ГБОУ ВПО "Сибирский государственный медицинский университет" Минздрава России, Томск 4ФГБУ "НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" СО РАМН, Кемерово
E-mail: [email protected]
ASSOCIATION OF ALA16VAL POLYMORPHISM IN SUPEROXIDE DISMUTASE 2 GENE (SOD2) WITH CORONARY ARTHERY DISEASE IN THE MALE RUSSIAN POPULATION
T.V. Zheykova1, M.V. Golubenko1, 4, S.V. Buikin1, O.A. Makeeva1, 4, A.A. Lezhnev2, I.V. Tsimbaliuk3, V.M. Shipulin2, V.P. Puzyrev1
1Federal State Budgetary Institution "Research Institute for Medical Genetics" of Siberian Branch under the Russian Academy
of Medical Sciences, Tomsk
2Federal State Budgetary Institution "Research Institute for Cardiology" of Siberian Branch under the Russian Academy
of Medical Sciences, Tomsk 3Siberian State Medical University, Tomsk 4Federal State Budgetary Institution «Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases» under Siberian Branch
of the Russian Academy of Medical Sciences, Kemerovo
Проанализировано распределение генотипов и аллелей полиморфного варианта Ala16Val (rs 4880) гена SOD2 в выборке мужчин, больных ишемической болезнью сердца (n=155), и в популяционной выборке мужчин г. Томска (n=129). Для проведения генотипирования использовали рестрикционный анализ с определением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Выявлена статистически значимо более высокая частота аллеля Т в группе больных ишемической болезнью сердца (ИБС) мужчин - 54,84% по сравнению с мужчинами популяционной выборки - 44,14% (х2=5,998; p=0,014; OR=1,54). Частота генотипа ТТ у больных ИБС мужчин составила 27,10%, что также значимо выше, чем в контрольной группе - 17,97% (x2=7,265; p=0,026; 0R=1,70). Таким образом показано, что аллель Т и генотип ТТ ассоциирован с ИБС.
Ключевые слова: супероксиддисмутаза-2, окислительный стресс, ишемическая болезнь сердца.
In this study, we genotyped Ala16Val (rs4880) polymorphism in S0D2 gene in two groups of men: the first group included men with coronary artery disease (n=155); the second group (control group) consisted of a population sample of Tomsk men (n=129). Genotyping was performed using the analysis of restriction fragment length polymorphism of amplification products. We found significantly higher allele T frequency in men with coronary artery disease (54.84%) compared with control group (44.14% %) (x2=5.998; p=0.014; 0R=1.54). The frequency of genotype TT in men with coronary artery disease was 27.10% and in men from control group - 17.97% (x2=7.265; p=0.026; Or=1.70). Therefore, the allele T and genotype TT are associated with coronary artery disease in men from Russian population.
Key words: superoxide dismutase-2, oxidative stress, coronary artery disease.
Введение
ИБС - распространенное мультифакторное заболевание, которое является одной из ведущих причин смертности в различных странах [11]. Наиболее частой причиной иБс служит атеросклероз коронарных сосудов. Одним из механизмов, лежащих в основе развития атеросклероза, является окислительный стресс, представляющий собой повышение уровня активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, перекиси водорода, гидроксильного радикала) вследствие нарушения в
организме баланса между прооксидантной и антиокси-дантной системами [1]. Активные формы кислорода участвуют в окислении липопротеинов низкой плотности [3], нарушение которого рассматривается как фундаментальный шаг в инициации и прогрессировании коронарного атеросклероза [12].
Одним из важнейших ферментов антиоксидантной системы является супероксиддисмутаза-2, осуществляющая превращение супероксид-аниона в кислород (О2) и перекись водорода (Н2О2). Последняя, в свою очередь,
детоксицируется глутатионпероксидазой и каталазой до воды [15].
Значимость супероксиддисмутазы-2 в обменных процессах подтверждена в экспериментальных исследованиях на мышах, которых нокаутировали по гену 80Б2 (80Б2-/-). В результате эти животные умирали в течение первых 10 дней жизни с явлениями дилатационной кардиомиопатии, массивным накоплением жира в печени и скелетной мускулатуре и метаболическим ацидозом [8]. У таких мышей выявлено нарушение работы дыхательной цепи митохондрий, резкое снижение активности сук-цинатдегидрогеназы и аконитазы в сердце [8] и развитие острой сердечной недостаточности [6]. У мышей с гетерозиготной делецией (80Б2+/-) активность супероксид-дисмутазы снижалась во всех тканях на 50%. При этом наблюдался повышенный уровень окислительных повреждений ядерной ДНК и чаще встречались онкологические заболевания. Однако продолжительность жизни мышей не сокращалась, и развивались они нормально. Таким образом, уменьшение активности 80Б2 приводило к повышенному уровню окислительных повреждений ядерной ДНК и увеличению риска развития рака, но не влияло на продолжительность жизни [14].
В клетке супероксиддисмутаза-2 локализована в митохондриальном матриксе. Ген 80Б2, кодирующий данный фермент, расположен на хромосоме 6д25.3 и состоит из 5 экзонов [7]. Установлено, что на работу суперок-сиддисмутазы-2 оказывает влияние полиморфизм А1а1бУа1 (С/Т), к4880 гена 80Б2. В ряде работ сообщается о влиянии последнего на развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Так, у больных диабетом I типа генотипы ТТ и СТ рассматриваются как предикторы повышенного риска сердечно-сосудистых заболеваний независимо от пола, возраста, курения, артериального давления, уровня холестерина [9].
Цель работы: анализ ассоциаций полиморфизма А1а1бУа1 гена 80Б2 с ИБС у мужчин.
Материал и методы
Для проведения исследования были сформированы две группы мужчин: основная - больные ИБС и контрольная. В исследуемые группы включались лица, нерод-
ственные между собой.
Основную группу составили 155 человек, средний возраст - 55±8 лет. Критерием включения служило наличие у пациента такой формы ИБС как перенесенный инфаркт миокарда в анамнезе.
В качестве контрольной группы выступали представители случайной поквартирной выборки мужчин Ленинского района г. Томска. Выборка формировалась на основе списка квартир жилищно-эксплуатационных управлений района с использованием таблицы случайных чисел. Всего было обследовано 630 мужчин в возрасте 20-59 лет, отклик на исследование составил 71%. В контрольную группу были включены 129 представителей популяционной выборки аналогичного возраста с мужчинами основной группы. Средний возраст представителей контрольной группы составил 54±8 лет. Из контрольной группы лица с ИБС специально не исключались.
Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов венозной крови методом фе-нол-хлороформной экстракции. Полиморфизм Ala16Val изучали с помощью рестрикционного анализа. Праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) подбирали с использованием программы Primer3. (F 5'-CCAGCAGGCAGCTGGCACCG -3' и R 5'-CAACGCCTCCTGGTACTTCT-3'). Параметры температурных циклов ПЦР были следующие: начальная денатурация - при 95 °С, 4 мин, 30 циклов амплификации по схеме: денатурация - при 95 °С, 30 с, отжиг праймеров -при 64 °С, 30 с, элонгация - при 72 °С, 30 с, после чего пробы инкубировали 5 мин при 72 °С. Смесь для ПЦР содержала по 5 пМоль прямого и обратного праймеров, буфер для Taq-полимеразы производства “СибЭнзим”, Новосибирск (1,5 мМ MgCl2 в реакционной смеси), 1 единицу активности Taq-полимеразы производства “Биосан”, Новосибирск, по 2 нмоль каждого из четырех дезокси-нуклеозидтрифосфатов, около 100 нг геномной ДНК. Для рестрикции использовали фермент BshTI (1 е.а.) производства “Fermentas”, Латвия. Продукты рестрикции фракционировали 30 мин в 3%-м агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием и регистрировали результаты с помощью гель-документирующей системы.
Обработку полученных данных осуществляли с помощью программы “MS Excel”, статистического пакета
Таблица 1
Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфизму Ala16Val гена SOD2
SOD2(Ala16Val) Относительные частоты генотипов, % Относительные частоты аллелей, %
CC CT TT C T
Контроль мужчины (n=129) 29,69 52,34 17,97 55,86 44,14
Больные ИБС мужчины (n=155) 17,42 55,48 27,10 45,16 54,84
Таблица 2
Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма Ala16Val гена SOD2
Сравниваемые выборки Генотипы Аллели
Контроль мужчины (n=129) Х2=7,265 Х2=5,998
Больные ИБС мужчины (n=155) p=0,026 p=0,014
OR=1,70 OR=1,54
Примечание: х2 - значение критерия, р - уровень значимости, OR - отношение шансов.
З5
STATISTICA 6.0. Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Хар-ди-Вайнберга использовали критерий х2 Пирсона. Для попарного сравнения частот генотипов и аллелей между анализируемыми группами использовали критерий х2 Пирсона с поправкой Йейтса. Отношение шансов для отдельных генотипов и аллелей и доверительный интервал рассчитывали согласно J.M. Bland and D.G. Altman [2]. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
В ходе исследования проанализировано распределение генотипов и аллелей полиморфного варианта Ala16Val гена SOD2 в исследуемых выборках (табл. 1).
Данные сравнительного анализа частот генотипов и аллелей полиморфизма Ala16Val гена SOD2 представлены в таблице 2.
В результате исследования выявлены статистически значимые различия в распределении частот генотипов и аллелей исследованных выборок. Частота аллеля Т у мужчин контрольной группы составила 44,14%, а у больных ИБС мужчин 54,84% (х2=5,998; p=0,014; OR=1,54). Частота генотипа ТТ в группе больных ИБС мужчин составила - 27,10% что также статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой - 17,97 (х2=7,265; p=0,026; 0R=1,70). Таким образом, выявленные статистически значимые различия по частотам аллелей и генотипов между контрольной выборкой и выборкой больных ИБС за счет преобладания аллеля Т и генотипа ТТ в группе больных ИБС говорят о том, что аллель Т и генотип ТТ ассоциирован с ИБС у мужчин .
Известно, что активность фермента, содержащего валин (аллель Т) на 23% ниже, чем содержащего Ala (аллель C), а следовательно, у носителей генотипов СС и СТ супе-роксиддисмутаза-2 обладает большей активностью, чем у носителей генотипа ТТ. Полиморфизм Ala16Val, приводящий к замене аланина на валин, локализован в участке, отвечающем за связывание с митохондрией для транспортировки фермента в митохондриальный матрикс. В митохондриальном матриксе этот участок расщепляется, и фермент переходит в активную форму [10]. Отмечено, что фермент, содержащий в этой позиции валин Val(r), транспортируется в митохондриальный матрикс медленнее, чем белок с Ala(C) [13]. Соответственно, у них меньше накапливается супероксид в матриксе, что приводит к меньшей степени супероксид-индуцированных повреждений [13]. В клинических исследованиях установлено, что у женщин с диабетом генотип ТТ ассоциирован с ИБС, а у мужчин такой ассоциации не наблюдается. Возможно, эффект генотипа ТТ у мужчин не выявлен из-за того, что традиционные факторы риска у мужчин играют более важную роль, чем у женщин [5]. Также показано, что аллель Т rs4880 ассоциирован с атеросклерозом и гипертензией [4].
Заключение
Таким образом, в настоящем исследовании показано, что аллель Т, соответствующий аминокислоте валину полиморфизма Ala16Val гена S0D2, и генотип ТТ ассоции-
рованы с повышенным риском развития ИБС у мужчин в российской популяции. Полученные данные могут быть использованы при разработке диагностических панелей генетических маркеров предрасположенности к ИБС.
Исследование выполнено при поддержке Федеральной целевой программы “Научные и научно-педагогические кадры для инновационной России” ГК № П722 от 12.08.2009, П977 от 20.08.2009.
Литература
1. Воробьева Е.Н., Воробьев Р.И. Роль свободнорадикального окисления в патогенезе болезней системы кровообращения // Бюл. СО РАМН. - 2005. - Т. 118, № 4. - С. 24-30.
2. Bland J.M., Altman D.G. Statistics notes. The odds ratio // British Medical J. - 2000. - Vol. 320 (7247). - P. 1468.
3. Diaz M.N., Frei B., Vita J.A. et al. Antioxidants and atherosclerotic heart disease // N. Engl. J. Med. - 1997. - Vol. 337 (6). - P. 408416.
4. Hsueh Y.M., Lin P., Chen H.W. et al. Genetic polymorphisms of oxidative and antioxidant enzymes and arsenic-related hypertension // J. Toxicol. Environ. Health A. - 2005. - Vol. 68 (17). - P. 1471-1484.
5. Jones D.A., Prior S.L., Tang T.S. et al. Association between the rs4880 superoxide dismutase 2 (C>T) gene variant and coronary heart disease in diabetes mellitus // Diabetes Res. Clin. Pract. -2010. - Vol. 90 (2). - P. 196-201.
6. Kim A., Chen C.H., Ursell P. et al. Genetic modifier of mitochondrial superoxide dismutase-deficient mice delays heart failure and prolongs survival // Mamm. Genome. - 2010. -Vol. 21 (11). - P. 534-542.
7. Landis G.N., Tower J. Superoxide dismutase evolution and life span regulation // Mech. Ageing Dev. - 2005. - Vol. 126 (3). -P. 365-379.
8. Li Y., Huang T.T., Carlson E.J. et al. Dilated cardiomyopathy and neonatal lethality in mutant mice lacking manganese superoxide dismutase // Nat. Genet. - 1995. - Vol. 11 (4). - P. 376-381.
9. Mollsten A., Jorsal A., Lajer M. et al. The V16A polymorphism in S0D2 is associated with increased risk of diabetic nephropathy and cardiovascular disease in type 1 diabetes // Diabetologia. -2009. - Vol. 52 (12). - P. 2590-2593.
10. Rosenblum J.S., Gilula N.B., Lerner R.A. On signal sequence polymorphisms and diseases of distribution // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1996. - Vol. 93 (9). - P. 4471-4473.
11. Samani N.J., Erdmann J., Hall A.S. et al. Genomewide association analysis of coronary artery disease // N. Engl. J. Med. - 2007. -Vol. 357 (5). - P. 443-453.
12. Steinberg D. Low-density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272 (34). - P. 20963-20966.
13. Sutton A., Imbert A., Igoudjil A. et al. The manganese superoxide dismutase Ala16Val dimorphism modulates both mitochondrial import and mRNA stability // Pharmacogenet. Genomics. -2005. - Vol. 15 (5). - P. 311-319.
14. Van Remmen H., Ikeno Y., Hamilton M. et al. Life-long reduction in MnSOD activity results in increased DNA damage and higher incidence of cancer but does not accelerate aging // Physiol. Genomics. - 2003. - Vol. 16 (1). - P. 29-37.
15. Zelko I.N., Mariani T.J., Folz R.J. Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression // Free Radic. Biol. Med. - 2002. - Vol. 33 (3). -P. 337-349.
Поступила 13.03.2012
Сведения об авторах
Жейкова Татьяна Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории популяционной генетики ФГБУ “НИИ медицинской генетики” СО РАМН.
Адрес: 6340З0, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, 10. E-mail: [email protected].
Голубенко Мария Владимировна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории популяционной генетики ФГБУ “НИИ медицинской генетики” СО РАМН. Ведущий научный сотрудник лаборатории геномной медицины ФГБУ “НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний” СО РАМН, Кемерово
Адрес: 6340З0, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, 10.
Буйкин Степан Вячеславович, канд. мед. наук, научный сотрудник лаборатории популяционной генетики ФГБУ “НИИ медицинской генетики” СО РАМН. Адрес: 6340З0, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, 10.
Макеева Оксана Алексеевна, канд. мед. наук, руководитель группы организации научных исследований ФГБУ “НИИ медицинской генетики” СО РАМН. заведующий лабораторией геномной медицины ФГБУ
“НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний” СО РАМН, Кемерово Адрес: 6340З0, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, 10. E-mail: [email protected] Лежнев Александр Александрович, канд. мед. наук, врач-хирург отделения сердечно-сосудистой хирургии ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а. Цимбалюк Игорь Владимирович, канд. мед. наук, ассистент кафедры факультетской терапии ГБОУ ВПО “СибГМУ” Минздрава России Адрес: 6340З0, г. Томск, Московский тр., 2.
Шипулин Владимир Митрофанович, докт. мед. наук, проф., научный руководитель отделения сердечно-сосудистой хирургии ФГБУ “НИИ кардиологии” СО РАМН.
Адрес: 634012, г. Томск, ул. Киевская, 111а.
Пузырев Валерий Павлович, академик РАМН, директор, ФГБУ “НИИ медицинской генетики” СО РАМН, заведующий лабораторией популяционной генетики. Адрес: 6340З0, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, 10.
