CC BY
25
УДК 575.12:633.854.78
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОМНОЙ ДНК МНОГОЛЕТНИХ ДИКОРАСТУЩИХ ВИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS L.)
© 2011 г. Н.В. Маркин1, М.А. Тихонова1, В.А. Гаврилова2, А.В. Усатов1
Научно-исследовательский институт биологии Южного федерального университета, пр. Стачки, 194/1, г. Ростов н/Д, 344090, [email protected]
2Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства, ул. Большая Морская, 42-44, г. Санкт-Петербург, 190000, [email protected]
Scientific Research Institute of Biology of Southern Federal University, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344090, [email protected]
2All-Russian Research Institute of Plant Industry, Bolshaya Morskaya St. 42-44, Saint-Petersburg, 190000, [email protected]
Проведен RAPD-анализ 30 образцов многолетних дикорастущих видов подсолнечника, включающих 24 вида и 6 образцов вида H. rigidus. Построена дендрограмма, отражающая взаимоотношения исследованных образцов подсолнечника. RAPD-маркеры наряду с морфологическими характеристиками удобно использовать для контроля поддержания генетической идентичности коллекционных образцов многолетних видов подсолнечника.
Ключевые слова: многолетние дикорастущие виды подсолнечника, генетический полиморфизм, RAPD-маркеры, UPGMA-дендрограмма.
Genotyping and study by RAPD analysis of polymorphism of 30 perennial wild sunflower samples, including 24 species and 6 samples ofH. rigidus species. It is constructed dendrogram, reflecting mutual relations of the investigated samples of sunflower. The results of RAPD marking in connection with the morphological characteristics are well to use for genetic integrity maintain of the perennial sunflower species collection samples.
Keywords: perennial wild sunflowers, genetic polymorphism, RAPD-markers, UPGMA-dendrogram.
В настоящее время видовую принадлежность образцов многолетнего дикорастущего подсолнечника из мировой коллекции Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВНИИР) определяют только на основе классификации Ч. Хейзера с помощью визуальной оценки их морфологических характеристик [1]. Однако морфологические признаки не всегда четко выражены на разных этапах онтогенеза растений и поэтому имеют ограниченные идентификационные возможности. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности изучения генетического разнообразия, определения родства на внутривидовом и родовом уровнях [2, 3]. Так, для изучения изменчивости генома подсолнечника широко применяется метод полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD-PCR), с помощью которого можно быстро обнаружить вариабельность большого числа локусов по всему геному [4 - 6]. ДНК-спектры фрагментов, полученные в результате их амплификации, могут быть использованы в качестве генетических маркеров для видовой идентификации образцов, а также для определения таксономических различий между ними.
Цель настоящей работы - исследование методом RAPD-PCR полиморфизма генома многолетнего дикорастущего подсолнечника из мировой коллекции ВНИИР и построение дендрограммы, отражающей взаимоотношения между видами.
Материалы и методы
Объектом исследования служили растения многолетних дикорастущих видов подсолнечника из миро-
вой коллекции ВНИИР, поддерживаемые в живом виде (табл. 1).
Выделение геномной ДНК и энзиматическую амплификацию проводили, как описано в [7]. Для RAPD-анализа использовали 7 произвольных прайме-ров (табл. 2).
Для количественной оценки полиморфизма по данным RAPD-анализа составлена матрица различий с использованием коэффициента Жаккарда и построена дендрограмма на основе метода невзвешен-ных парно-групповых средних (UPGMA).
Результаты и их обсуждение
В результате RAPD-анализа 30 образцов многолетних дикорастущих видов подсолнечника, включающих 24 вида и 6 образцов вида Н. rigidus, получены специфические и воспроизводимые наборы фрагментов ДНК (ампликонов). Количество электрофоретически подвижных полос (бэндов) (от 5 до 37) зависело от использованного праймера. Их размеры варьировали в пределах 200 - 1200 пар нуклеотидов (п.н.). Наряду с наличием общих ампликонов большую часть спектров составляли фрагменты, которые присутствуют в одних и отсутствуют в других геномах. Они учитывались в качестве полиморфных маркеров. Всего исследовано 142 RAPD-маркера. Уровень полиморфизма у многолетних видов подсолнечника зависел от используемого прай-мера (табл. 2). В среднем выявлено 94 % полиморфных маркера (межвидовой полиморфизм) и 70 - у 6 образцов H. rigidus разных лет интродукции (внутривидовой полиморфизм). Генетические различия между исследуемыми образцами варьировали от 0,06 до 0,23 внутри вида H. rigidus и от 0,16 до 0,39 между видами.
ские взаимоотношения. Из рисунка видно, что 2 образца № 1886, 2106 объединяются со значением бутстрепа 99 %, образцы № 545660, 545658 - 61, образец без номера интродукции и № 545646 группируются со значением
55 и 51 %. „ , .
Таблица 1
Виды многолетнего дикорастущего подсолнечника коллекции ВНИИР, их происхождение, год и номер интродукции
Результаты КАРБ-анализа геномной ДНК образцов Н. rigidus свидетельствуют о высокой (70 %) мо-лекулярно-генетической гетерогенности этого вида, а построенная дендрограмма демонстрирует генетиче-
Вид Число хромосом, 2n Номер интродукции Год интродукции Происхождение Серия Секция
Helianthus ciliaris DC. 68,102 Нет 1981 Сев. Америка Ciliares Ciliares
H. californicus DC. 102 530447 1980 Сев. Америка
H. decapetalus L. 34,68 440439 1976 Сев. Америка
H. divaricatus L. 34 2099 1976 Сев. Америка
H. eggertii Small 102 Нет 1998 Болгария
H. giganteus L. 34 489235 1980 Сев. Америка
H. grosseserratus M.Martens 34 545698 1990 Сев. Америка
H. hirsutus Raf. 68 560389 1980 Сев. Америка Corona -solis
H. maximiliani Schrad. 34 2099 1976 Сев. Америка
H. mollis Lam. 34 2102 1976 Сев. Америка
H. nuttallii Torr. & A.Gray 34 Нет 1998 Сев. Америка
H. resinosus Small 102 2107 1976 Сев. Америка
H. salicifolius A.Dietr. 34 Нет 1976 Сев. Америка
H. strumosus L. 68,102 440679 1976 Сев. Америка
H. tuberosus L. 102 2111 1976 Сев. Америка Divaricati
H. laevigatus Torr. & A.Gray 68 Нет 1998 Болгария
H. microcephalus Torr. & A.Gray 34 » 1998 Болгария Microcephali
H. smithii Heiser 68 » 1998 Болгария
H. occidentalis Riddel subsp. plan-tagineus (Torr. & A.Gray) Heiser 34 441062 1976 Сев. Америка
H. rigidus Desf. 102 1886 1976 Сев. Америка
H. rigidus Desf. 102 2106 1976 Сев. Америка Atrorubentes
H. rigidus Desf. 102 545658 1990 Сев. Америка
H. rigidus Desf. 102 Нет 1990 Сев. Америка
H. rigidus Desf. 102 545660 1990 Сев. Америка
H. rigidus Desf. 102 545646 1990 Сев. Америка
H. angustifolius L. 34 Нет 1976 Сев. Америка
H. floridanus A.Gray ex Chapm. 34 » 1981 Сев. Америка Angustifolii
H. simulans E.Watson 34 545659 1980 Сев. Америка
H. laetiflorus Heiser & D.M.Sm. Нет данных 1886 1976 Болгария Нет данных Нет данных
Helianthus x multiflorus (L.) Heiser & D.M.Sm. Нет данных Нет 1998 Болгария Нет данных Нет данных
Таблица 2
Праймеры, использованные для КАРБ-анализа многолетних дикорастущих видов подсолнечника
Название праймера Последовательность нуклеотидов 5 - 3 Полиморфные RAPD-маркеры, %
на уровне рода на уровне вида для H. rigidus
P36 CCGAATTCGC 90 63
P38 GATACGTTGTC 100 89
0PT-08 AACGGCGACA 96 88
0PW-04 CAGAAGCGGA 100 67
0PW-06 AGGCCCGATG 96 50
0PW-09 GTGACCGAGT 87 56
0PW-10 TCGCATCCCT 91 75
Среднее значение 94 70
Согласно классификации Ч. Хейзера, вид Н. rigidus подразделяется на два подвида: Н. rigidus rigidus и Н. rigidus subrhomboideus. По морфологическому описанию образцы № 1886, 2106 можно отнести к подвиду Н. rigidus rigidus, а образцы № 545660, 545658, 545646 и без номера интродукции - к подвиду Н. rigidus subrhomboideus. Следовательно, результаты RAPD-анализа геномной ДНК образцов Н. rigi-
dus подтверждают их систематизацию по морфологическим признакам и позволяют отнести образец без номера интродукции (делянка № 33) к подвиду H. ri-gidus ssp. subrhomboideus.
Другую статистическую надежность демонстрируют кластеры межвидовых взаимоотношений многолетнего дикорастущего подсолнечника. На дендро-грамме исследуемые виды объединяются с низкими значениями (менее 50 %) бутстрепа, исключением являются H. tuberosus и H. resinosus (52). Низкая статистическая надежность выделяемых кластеров, возможно, является следствием анализа высокополиморфных RAPD-спектров (от 87 % до 100), представленных фрагментами амплификации ДНК подсолнечника, содержащими высокоповторяющиеся последовательности. Полученная топология дендрограммы отличается от данных таксономии подсолнечника, предложенной E. Шиллингом и Ч. Хейзером [8], которая построена по результатам анализа морфологических признаков. Неконгруэнтность дерева, полученного по результатам RAPD-анализа и «классических» представлений о систематике многолетних видов подсолнечника, можно объяснить сетчатым характером эволюции рода Helianthus [9].
Серия
Секция
Ciliares
76
52
51
99
61
55
Corona-solis
H. ciliaris H. californicus H. maximiliani H. nuttallii Corona-solis
H. laevigatus Microcephali H. microcephalus
H. salicifolius Corona-solis
Ciliares
H. tuberosus H. resinosus H. smithii H. multiflorus
Corona-solis
Microcephali
H. grosseserratus H. mollis Corona-solis H. giganteus Corona-solis H. decapetalus Corona-solis H. floridanus
H. angustifolius Angustifolii H. simulans
H. strumosus H. laetiflorus H. divaricatus H. eggertii H. hirsutus
Corona-solis ?
Corona-solis
Corona-solis
H. occidentalis ssp. plantageneus H. rigidus (1886) H. rigidus (2106) H. rigidus (545658) H. rigidus (545660) H. rigidus (-) H. rigidus (545646)
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
Дендрограмма межвидовых и внутривидовых взаимоотношений многолетних дикорастущих видов подсолнечника, построенная методом ЦРОМА на основании анализа генетических различий. В скобках указан номер интродукции исследованного образца Н. Цифрами указаны значения бутстрепа (отмечены только значения больше 50 %)
Таким образом, в результате КАРБ-анализа геномной ДНК 30 образцов многолетних дикорастущих видов подсолнечника получены индивидуальные электрофоретические спектры амплифициро-ванных фрагментов. Показано, что в среднем 94 % маркеров полиморфны внутри рода, 70 характеризуются внутривидовым полиморфизмом. ЯАРБ-мар-керы, наряду с классическим описанием растений, удобно использовать для контроля поддержания
генетической целостности коллекционных образцов подсолнечника.
Литература
1. The North American sunflowers (Helianthus) / C.B. Heiser [et al.] // Memoirs of the Torrey Botanical Club. 1969. Vol. 22, № 3. Р. 1-218.
2. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Коновалов Ф.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров // Генетика. 2005. Т. 41, № 4. С. 480 - 492.
3. Knapp S.J., Berry S.T., RiesebergL.H. Genetic mapping in sunflowers // DNA-based markers in Plants / eds. by Phillips R.L. and Vasil I.K. Netherlands, 2001. P. 379 - 403.
4. Evidence for several genomes in Helianthus / K. Sossey-Alaoui [et al.] // Theor. Appl. Genet. 1998. Vol. 97. P. 422-430.
5. Sivolap Yu.M., Solodenko A.E. Inter- and intraspecies differentiation in the genus helianthus by RAPD analysis // Helia. 1998. Vol. 21, № 29. P. 9 - 18.
6. Molecular relationships of Helianthus based on RAPD markers / K. Sossey-Alaoui [et al.] // Helia. 1999. Vol. 22, № 30. P. 1-18.
Поступила в редакцию
7. Маркин Н.В., Усатов А.В., Федоренко М. RAPD-анализ генотипов солеустойчивых форм горчицы (Brassica juncea L.) // Экологический вестн. науч. центров Черноморского экономического сотрудничества. 2006. № 2. С. 78 - 81.
8. Schilling E.E., Heiser C.B. Infrageneric classification of Helianthus (Compositae) // Taxon. 1981. № 30. P. 393 - 403.
9. Timme R.E., Simpson B.B., Linder C.R. High-resolution phylogeny for Helianthus (Asteraceae) using the 18S-26S ribo-somal DNA external transcribed specer // American J. of Botany. 2007. Vol. 94, № 11. P. 1837 - 1852.
30 июля 2010 г.
