CC BY
1080
№ 4 (154) май, 2017
PfMfDUUM
привслжье
[ Консилиум ]
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Ф.Н. ГИЛЬМИЯРОВА, Н.А. КОЛОТЬЕВА, О.А ГУСЯКОВА, И.Ф. СИДОРОВА,
ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет»
Полимеразная цепная реакция. История открытия. Новый этап развития
В настоящее время одним из самых современных и динамично развивающихся методов молекулярной биологии является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР, Polymerase chain reaction, PCR). Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования.
инфекционных добавления в нее мертвых болезнет-
Jиагностика заболеваний, в том числе ^ у вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию, генотипирование микроорганизмов, оценка их вирулентности, определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, генодиагностика и генетическая дактилоскопия, пренатальная диагностика, биологический контроль препаратов крови - вот далеко не полный перечень направлений медицины, где с успехом применяется ПЦР.
ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ Открытию полимеразной цепной реакции предшествовало развитие молекулярно-биологических технологий. В 1869 году И. Мишером была открыта ДНК. Биологическая функция нового вещества была не ясна. В 1944 году ученые О. Эвери, К. Мак-Леода и М. Мак-Карти провели ряд экспериментов по трансформации бактерий, доказавшие, что за трансформацию (приобретение болезнетворных свойств безвредной культурой в результате
ворных бактерий) отвечают выделенные из пневмококков ДНК. Вплоть до 50-х годов XX века точное строение ДНК и способ передачи наследственной информации оставались неизвестными, хотя и было доказано, что ДНК состоит из нескольких цепочек, состоящих из нуклеотидов. Количественные соотношения между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК были сформулированы в 1949-1951 годах группой биохимика Э. Чаргаффа.
Правила Чаргаффа, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК и определении принципа комплементарности Дж. Уотсоном и Ф. Криком в 1953 году. Ученые пришли к выводу, что ДНК состоит из двух полимерных цепей, удерживаемых водородными связями между азотистыми основаниями и образующих двойную спираль. При этом азотистые основания формируют
С*
W I
Шг
доцент О.А. Гусякова парные (комплементарные) комплексы аденин - тимин и гуанин - цитозин при взаимодействии цепей нуклеиновых кислот. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи -матрицы.
А. Корнберг в 1955 году открыл фермент, который назвал ДНК-поли-меразой. Этот фермент способен удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к З'-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был связан с комплементарной цепью ДНК (матрицей).
П пшШиим
_привслжье
№ 4 (154) май, 2017
КОНСИЛИУМ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА!
Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозид-трифосфаты (дНТФ), используемые в качестве строительных блоков.
Клеппе и соавторы в 1971 году представили данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси, и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако возможность использования ПЦР в плане наработки большого количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Это было связано с техническими трудностями, обусловленными необходимостью трудоемкого синтеза праймеров, и нестабильностью фермента. В начале использования метода ПЦР после каждого цикла нагревания - охлаждения ДНК-полимеразу приходилось добавлять в реакционную смесь, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффектив-
ной, требовала много времени и фермента.
Т. Брок и Х.Фриз в 1975 году открыли Thermus aquaticus - грамотрицатель-ную палочковидную экстремально термофильную бактерию, а позднее из нее была впервые выделена Taq-полимераза. Taq-полимераза была охарактеризована советскими биохимиками А. Калединым, А. Слюсаренко и С. Городецким в 1980 году, а также за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году, американскими биохимиками Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela.
Преимуществом данного фермента была способность стабильно работать при повышенных температурах (оптимум 72-80°C). В 1983-1984 годах К. Мюллис (США) провел ряд экспериментов по разработке ПЦР и первым начал использовать Taq-полимеразу вместо неустойчивой к высоким температурам ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис вместе с Ф. Фалуном
разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. Таким образом, сформировался принцип использования ПЦР как метода амплификации in vitro заданных фрагментов ДНК с полностью или частично известной последовательностью.
Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 году Saiki с соавт. опубликовали статью, в которой была описана амплификация геномной последовательности р-глобина. С этого момента количество публикаций о применении ПЦР в своих работах стало увеличиваться в геометрической прогрессии. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Это, в свою очередь, способствовало значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов.
Скрининг иммунодефицитных состояний:
количественная ПЦР в режиме реального времени
Высокочувствительная объективная прямая методика, позволяющая в количественной форме оценивать содержание юных, вышедших на периферию и готовых к дальнейшей дифференцировке Т- и В-лимфоцитов, для клинико-диагностической лаборатории с использованием стандартного набора оборудования для ПЦР.
Примеры использования количественной оценки ТСЕС и К11ЕС:
• Исследование и дифференциальная диагностика лимфопений, тяжёлой комбинированной иммунной недостаточности, общей вариабельной иммунной недостаточности, агаммаглобу-линемии и других НДС, например, синдрома ДиДжорджи, атаксии-телангиэктазии (синдром Луи-Бар), синдрома Оменна, синдрома Ви-скотта-Олдрича, синдрома Неймеген;
Скрининг новорожденных с использованием сухих пятен крови на иммунодефицитные состояния;
Изучение нормального развития Т- и В-лим-фоцитов;
Оценка восстановления иммунной системы после проведения процедуры трансплантации гемопоэтических стволовых клеток костного мозга;
Оценка реактивных состояний организма при угрозе жизни пациента (сепсис, менингит);
Изучение ответа на высокоактивную антире-тровирусную терапию при ВИЧ-инфекции; Оценка возрастных изменений организма и определение возраста (судебная медицина); Оценка активности аутоиммунного заболевания.
ВСМ
Б1 Ю-
ЗАО БиоХимМак / 119192, г. Москва, Ломоносовский проспект д. 29, к. 1 / телефон (495) 647-27-40, 663-94-69 / факс (495) 663-94-69 / e-mail: [email protected] /www.biochemmack.ru
КОНСИЛИУМ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА!
№ 4 (154) май, 2017
РШШШМ И
ПРИРСПЖЬС_
За разработку ПЦР-анализа К. Мюллис в 1993 году был удостоен Нобелевской премии в области химии.
ПРИНЦИП МЕТОДА ПЦР
Полимеразная цепная реакция - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. Метод основан на принципе комплементарности. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ.
Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа:
1. Пробоподготовка.
2. Амплификация специфических фрагментов ДНК.
3. Детекция продуктов амплификации.
Суть пробоподготовки заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации. В настоящее время существуют различные методы выделения нуклеиновых кислот: экспресс -метод, выделение НК при помощи осаждения на носителе, фенольно-хромофорный метод (метод Хом-чинского).
Амплификация - увеличение количества ампликонов в ходе многократно (обычно 30-50 раз) повторяющихся циклов (раундов) денатурации, гибридизации и удлинения цепей.
Этапы амплификации:
♦ денатурация ДНК (~95°С) - расхождение нитей ДНК;
♦ отжиг (гибридизация) праймеров на ДНК (~55°С) - присоединение прай-
меров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка;
♦ синтез фрагмента ДНК (элонгация) с помощью термостабильной ДНК-полимеразы (~72°С) - комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтри-фосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом Тад-полимеразой.
В случае выделения РНК (для РНК-содержащих вирусов, например, вирус гепатита С) используется дополнительный шаг - обратная транскрипция. С помощью ревертазы (обратной транс-криптазы), используя в качестве матрицы мРНК, проводят синтез одноцепо-чечной молекулы ДНК (кДНК), которая используется для последующей ПЦР.
Детекция - заключительный этап в постановке ПЦР. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы.
Метод электрофореза основан на разделении фрагментов ДНК (ампликонов) в агарозном геле в соответствии с их зарядом и линейными размерами с ультрафиолетовой детекцией при окрашивании бромистым эти-дием. Этот метод позволяет осуществлять только качественный анализ и имеет ряд ограничений и недостатков: большие затраты
времени на стадию детекции; невозможность автоматизации; сложность и субъективность трактовки результатов; высокий риск контаминации и большие затраты на ее устранение; повышенные требования к организации лаборатории; максимальное удаление зоны детекции от других зон проведения ПЦР; выделение отдельного сотрудника на стадию детекции; постоянный контроль смывов.
Метод ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR, RT-PCR) позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. Преимуществом данного подхода является возможность совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для этого используют флуоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК (интеркаляция возможна в случае, если краситель имеет
1200 отечественных лабораторий России уже используют вакуумные пробирки 1ЛМ1\/АС! Присоединяйтесь!
Отечественный производитель -> Отечественным лабораториям
В Широкая линейка наполнителей В Весь спектр исследований крови
В Доступные и стабильные цены В Долгосрочное планирование бюджета
В Полный цикл производства в Московской области
Ei Соответствие всем требованиям об импортозамещении
А/О Юнимед, 129301, г. Москва, ул. Касаткина, За тел.: 8 (495) 734-91-313, факс 8 (495) 229-91-31 e-mail: [email protected] www.unimadao.ru
Официальный дилер продукции Эйлитон на территории Нижегородской области: ООО ((Дженерал Медикал Системс», г. Н.Новгород, ул. Невзоровым д.89, офис 3, тел/факс: 8-831-428-99-
Н пшШиим
_привслжье
№ 4 (154) май, 2017
КОНСИЛИУМ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА!
подходящие размеры и химическую природу и может поместиться между основаниями ДНК) или модифицированные дезоксинуклеотиды, которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Отличительными чертами ПЦР-РВ являются не только возможность количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, но и отсутствие стадии электрофореза, что позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число лож-ноположительных результатов. Также менее строгие требования предъявляются к организации ПЦР-лаборатории, становятся возможны автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ В настоящее время реакция ПЦР-амплификации - рутинный и ежедневный инструмент в каждой молекулярно-биологической лаборатории. Применяя специфические олигонуклеотидные
праймеры, варианты метода теперь используют не только в молекулярной биологии и биотехнологии, но и в медицине (например, для идентификации микроба или вируса по его ДНК, для контроля излечения пациента от инфекционного заболевания, идентификации типа мутации в геномной ДНК при анализе наследственных заболеваний). Находит применение эта реакция и в криминалистике для идентификации личности по ДНК-содержащим жидкостям и тканям (модификацию исходного метода криминалисты назвали в стиле своей профессии - «геномная дактилоскопия»). Используется она и для установления отцовства, степени родства, популяци-онных исследований - словом, везде, где нужно установить для той или иной цели уникальную последовательность ДНК, опираясь на минимальное количество исходного ДНК-содержащего материала: капельку крови, мочи, соскоб с ткани, отдельный волос.
В настоящее время ПЦР является одним из наиболее важных диагности-
ческих инструментов исследования нуклеиновых кислот с целью постановки диагноза социально значимых заболеваний, таких как: туберкулез (код по МКБ-10 А15 - А19); инфекции, передающиеся преимущественно половым путем (T. pallidum, N. gоnorrhoeae, C. trachomatis, M. genitallium, M. hominis, U. urealyticum, U. parvum, HSV2, HPV, T. vaginalis, Candida и т. д. (А50 - А64)); гепатит В (В16; В18.0; В18.1); гепатит С (В17.1; В18.2); болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) (В20 - В24).
Особо опасные инфекции - это инфекционные заболевания, которые вошли в перечень событий, что могут являть собой чрезвычайную ситуацию в системе охраны здоровья в международном масштабе. Первая группа -болезни, которые являются необычными и могут оказать серьезное влияние на здоровье населения: оспа, полиомиелит, вызванный диким полиовирусом, человеческий грипп, вызванный новым подтипом, тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) или (SARS).
АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИОФАГОВ
Бактериофаг Сз s & Ê - dB » X '5 X S л s _ Г 1 * nj S. I I с ç с с; Ii .с л X
Возбудитель -e 0 p 1 Л •а s s £ S О ~ s -с Ci X œ UC 2 s S = S S. Д о " 5 Ö -û С X s t £ Ш • s S 1 te c. с 5 S s Э e 11 11 I i 1 s n I о * £ ? 'S к I -G- ® M s S. с1" S i ш Ш £ s S S? s s £ f 1 i 1 £ g g f ■g S 'f я î 0 X 1 i X X я s I_n с S g g г S OJ " X t E fr, ■ 3 S i ë г 1 s s 'X n ■c О s г & s s g ^ = f| LÎÏ G 3 a _ ® ra jZ. e- g S f ci. £ Œ С S ® cc f i = зУ fï —' tî L. аз гв s E g. a s - S '5 ■Я J5 ш x х 1 £ к 1 1 F ™ = § i £ I I ? £ S Ж х. i£ g SX S е- a s CL CE Ш s г Б в ac Ci ш В n Lû
Staphylococcus • •
Streptococcus •
Enterococcus
Proteus vulgaris Ф #
Proteus mirabilis • •
Pseudomonas aeruginosa •
Энтеропатогенные Esherichia coli • •
Klebsiella pneumoniae m •
Klebsiella oxytoca
Klebsiella ozaenae m
Klebsiella rhinoscleromatis •
Shigella flexneri 1,2,3,4,6 сероваров. Shigella sonnei * •
Salmonella paratyphi A, B, typhimurium, choleraesuis, infantis, Oranienburg, enteritidis • •
ФГУП ..НПО «Микроген» Минздрава России 127473, г. Москва, 2-й Волконский пер., д. 10. Тел.: (495) 790-77-73 www.micragen.ru
Per. удостоверение Ii; ЛС-001361. Р ND025E0/01. nC-DOI2S7. P N001977/01. JlMlOt998. ЛС-000624. ЛС-002205, P N0D1973/01. nC-OOOÏOD. ЛС-001049. ЛС-002031. P N001971/01. ЛС-002033. ЛС-00199Э. P M001975J01. P N001976/01. Линеизия № 12226 ЛС-П от 19Ж 2013
[КОНСИЛИУМ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА]
№ 4 (154) май, 2017
PfMfDUUM
привслжье
Вторая группа - это болезни, любое событие с которыми всегда оценивается как опасное, поскольку эти инфекции обнаружили способность оказывать серьезное влияние на здоровье населения и быстро распространяться в международных масштабах: холера, легочная форма чумы, желтая лихорадка, геморрагические лихорадки лихорадка Западного Нила. Метод ПЦР был признан обязательным методом ускоренной диагностики для индикации и лабораторной диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды.
Применительно к диагностике гемо-трансмиссивных инфекций, метод ПЦР приобрел свою значимость в первую очередь в службах крови. На данный момент метод ПЦР решает следующие задачи службы крови: обеспечение инфекционной безопасности в период «серонегативного окна»; обеспечение информацией об отсутствии инфекционных агентов в крови или ее компонентах при неопределенных результатах обычных иммунофер-ментных анализов; обеспечение выявления истинных вирусоносителей среди серопозитивных лиц; генотипи-рование - определение на уровне генома антигенов лейкоцитов и тромбоцитов (HLA, HPA).
Оппортунистические инфекции -заболевания, вызываемые патогенами, которые обычно не приводят к болезни у здоровых людей (с нормальной иммунной системой). Наиболее распространенными возбудителями являются: вирусы (ЦМВ, вирус Эпштейна-Барр), бактерии (S. aureus, S. pyogenes, P. aeruginosa, A. baumanni, C. difficile), грибы (C. albicans, Aspergillus sp., Pneumocystis jirovecii, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum), простейшие (T. gondii, Cryptosporidium). Для выбора тактики ведения пациента принципиально важными являются: ранняя диагностика процесса; определение наличия микстинфекции; смены возбудителя в процессе течения заболевания; выделение ведущего этиоло-
гического фактора в формировании патологии на конкретном этапе; назначение адекватной терапии и оценка ее эффективности. На данный момент метод ПЦР позволяет решить поставленные задачи.
ПЦР широко применяется в неона-тологии. Целый ряд микроорганизмов способны поражать плод во время беременности. Это так называемые TORCH-инфекции: токсоплазмоз (Toxoplasmosis); другие инфекции, из которых считаются абсолютно доказанными: хламидиоз, сифилис, гепатиты А и В, гонококковая инфекция, листериоз (Others); краснуха (Rubella); цитомегаловирусная инфекция (Citomegalia); простой герпес (Herpes Symplex). Использование серологических тестов для определения этих инфекций у новорожденных неэффективно, поскольку формирование иммунной системы у ребенка происходит в течение нескольких месяцев, и наличие инфекционного агента может не сопровождаться выработкой специфических антител. С другой стороны, в крови новорожденного длительное время могут присутствовать материнские антитела класса IgG, способные проникать через плацентарный барьер. Таким образом, наличие специфических IgG у ребенка в первые месяцы жизни не свидетельствует о присутствии возбудителя. Применение ПЦР-анализа значительно увеличивает возможности диагностики неонатальных инфекций, в том числе и на внутриутробном этапе. Материалом в этом случае может служить амниотическая жидкость или ворсинки хориона.
Определение резус-фактора во время пренатального исследования играет важную роль для своевременной и обоснованной профилактики резус-
конфликта. Преимуществом ПЦР-исследования является его неинвазив-ность при определении резус-фактора плода по крови беременной с 10 недели беременности. В 50% случаев у резус-отрицательных беременных женщин возможно развитие резус-конфликта, в 92% случаев - это причина гемолитической болезни плода и новорожденного.
Одним из наиболее перспективных направлений ПЦР-диагностики являются генетические исследования, а именно: мутации, обусловливающие наследственные заболевания; полиморфизмы, ассоциированные с предрасположенностью к мультифактор-ным заболеваниям; онкогенетика; фармакогенетика; НЬА-типирование; иммуногенетика; нарушения метаболизма и т. д.
С момента возникновения идеи многократного увеличения числа копий искомой молекулы ДНК прошло сравнительно немного времени, тем не менее, технология ПЦР совершила гигантский рывок и стала неотъемлемой частью рутинной лабораторной практики, продолжая при этом совершенствоваться и развиваться. На сегодняшний день метод ПЦР имеет огромное прикладное и научное значение, с его помощью были реализованы крупные исследования в области медицины и биологии. Был совершен прорыв в диагностике широкого спектра инфекционных и генетических заболеваний, онкопатологий. Накопленная за этот период времени информация позволила сформировать новый персонифицированный подход к комплексному обследованию пациентов и определить альтернативные варианты терапии с учетом особенностей их генотипа и популяционной принадлежности.
Уважаемые читатели!
Рецензируемый медицинский научно-практический журнал «Медицинский альманах» № 2 (47) май 2017 содержит актуальные клинические и обзорные материалы по направлению «Лабораторная диагностика». С полнотекстовой версией статей вы можете ознакомиться на сайте издания www.medalmanac.ru и в Научной электронной библиотеке http://elibrary.ru/contents.asp? ШШ=27495 /система РИНЦ/.
