CC BY
59
ИСТОРИЯ БИОМЕДИЦИНЫ
К 20-летию разработки полимеразной цепной реакции
В 2003 г. исполняется 20 лет с того времени, когда американский биохимик Кэри Мюллис описал принцип и успешно воспроизвел in vitro феномен амплифицированного ферментативного синтеза на матрице одной из нитей ДНК ее второй полинуклеотидной цепи de novo, который вошел в науку под названием "polymerаse chain reaction" (PCR) - "полимеразной цепной реакции" (ПЦР).
Спустя 10 лет, когда стало очевидным, что ПЦР представляет собой чрезвыйчайно перспективный молекулярно-биологический метод, пригодный для решения целого ряда принципиально новых диагностических и, главное, аналитических задач в очень многих областях не только биологии, но и теоретической и клинической медицины, ее создатель был удостоен Нобелевской премии.
Создание этого метода стало закономерным итогом интенсивных научных изысканий, которые, после "расшифровки" в 1953 г. структуры ДНК, вели сотни ученых во многих странах мира. За 30 лет, которые разделяли это эпохальное открытие и появление идеологии амплифи-цированного синтеза нуклеиновых кислот, наука сделала поистине гигантские шаги. За эти годы была детально изучена биохимия нуклеиновых кислот, "прочитан" генетический код, открыт целый ряд ферментов, участвующих в процессе реализации генетической информации, раскрыты основные механизмы биосинтеза белков и его регуляции, идентифицированы ферменты рестрикции ДНК, позволяющие "нарезать" ее молекулу в строго определенных местах, и заложены основы генной инженерии, методы которой позволяли манипулировать отдельными молекулами ДНК и РНК in vitro и получать различные рекомбинантные молекулы.
Развитие получили и аналитические методы молекулярной биологии и, в первую очередь, так называемые гибридизационные технологии, интенсивное развитие которых, в конечном итоге, и привело к появлению идеи ПЦР, а в дальнейшем и целого семейства амплификационных методов анализа. Появлению гибридизационной технологии предшествовали три наблюдения.
В 1958 г. П.Доти установил, что при нагревании происходит денатурация ДНК, в основе ко-
торой лежит разрыв водородных связей между двумя полинуклеотидными цепями в ее молекуле и их отделение друг от друга. Этот процесс сопровождался изменением ряда свойств ее раствора (вязкости, оптической плотности и др.) и был назван "плавлением" ДНК.
В 1960 г. Дж.Мэрмар обнаружил, что тепловая денатурация ДНК обратима: при медленном охлаждении раствора денатурированной ДНК водородные связи между взаимокомплементарными цепями ДНК восстанавливаются и ее разделенные цепи вновь объединяются в исходную молекулу, т.е. происходит ренатурация ДНК.
В том же году Дж.Мэрмар и К.Шильдкраут продемонстрировали, что если смешать растворы двух различных денатурированных ДНК (например, полученных от различных бактерий одного вида), то цепи этих ДНК способны присоединяться друг к другу за счет возникновения водородных связей между отдельными, комплементарными друг другу, участками разных цепей. В образовавшихся "гибридных" двухцепочечных молекулах полинуклеотидные цепи связываются между собой не на всем их протяжении, а лишь между взаимокомплементарными участками. Этот феномен получил название "гетерогенной реконструкции ДНК", а позднее - "гибридизации ДНК".
Его дальнейшее изучение показало, что чем ближе друг к другу биологические виды, у которых берется ДНК для гибридизации, тем сильнее связываются между собой их одиночные цепи, а значит, тем большее количество водородных связей возникает между ними и тем протяженнее имеющиеся у них взаимокомплементарные (т.е. гомологичные друг другу) участки полинуклеотидных цепей.
Стало очевидным, что это свойство ДНК может быть использовано в аналитических целях: определив "степень гибридизируемости" двух гетерогенных одиночных полинуклеотидных цепей ДНК и прочность их связывания между собой, можно косвенно оценить и "долю" взаимокомплементарных участков в этих двух гетерогенных молекулах, называемую степенью их гомологии. Если степень гомологии между двумя гетерогенными одиночными цепями достаточно высока, то можно полагать, что организмы, из которых полу-
чены исходные ДНК, таксономически близки друг другу. Если же этот показатель приближается к 100%, то можно утверждать, что гибриди-зируемые молекулы принадлежат одному биологическому виду.
Именно эта посылка и послужила теоретической основой для создания на основе феномена молекулярной гибридизациии ДНК аналитического метода, позволяющего с помощью известной ДНК ("ДНК-зонда") идентифицировать наличие в тестируемых пробах полностью или частично гомологичной ей макромолекулы и названного методом "молекулярной гибридизации" или "молекулярного зондирования".
Впервые метод гибридизации ДНК был успешно использован в 1961 г. Джоржем Уэстфа-лем и Ренато Дульбекко, которые с его помощью обнаружили геном онкогенного обезьяньего вируса SV-40 в геноме инфицированной им клетки.
Уже год спустя Сол Спигельман показал возможность гибридизации одиночной полинуклео-тидной цепи ДНК с молекулой РНК, что существенно расширило круг аналитических задач, поддающихся решению с помощью этого метода.
В 1963 г. Э.Болтон и Б.МакКарти разработали простой радиоизотопный метод определения процента гомологичных последовательностей в гибридизируемых молекулах, основанный, во-первых, на введении радиоактивной "метки" в известную молекулу ДНК и, во-вторых, на фиксации разделившихся цепей тестируемой ДНК в застывающем агаре. При этом гибридизация происходила в полужидком агаре, а несвязавшаяся "меченная" цепь ДНК-зонда удалялась из агара промыванием. Измерив радиоактивность агара, можно было оценить какая часть ДНК-зонда связалась с фиксированной в нем цепью тестируемой ДНК. Предложенная в 1965 г. С.Спигельма-ном и Д.Джилспи иммобилизация ДНК-зонда на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах еще больше упростила методику гибридизации. И, наконец, была разработана методика введения в состав ДНК-зонда с помощью реакции "ник-трансляции" (nicking-closing reaction), катализируемой эндонуклеазной рестриктазой реакции разрыва и последующей репарации, нуклеоти-дов, "меченных" радионуклидом фосфора, а чуть позднее и субстанциями, позволяющими регистрировать результат теста колориметрически.
Благодаря этим совершенствованиям, методика гибридизации значительно упростилась и нашла применение не только при решении научных вопросов, связанных с уточнением таксономии вирусов и бактерий, но и в диагностических целях и, в частности, для детекции сравнительно небольших по размеру вирусных нуклеиновых кислот. Например, уже в конце 70-х гг. она
стала использоваться при анализе структуры генома некоторых вирусов и даже в диагностике некоторых вирусных инфекций (гепатит В и др.).
После описания в 1974 г. Эдвардом Сау-зерном метода переноса хроматографически разделенных в геле олигонуклеотидов на тонкие мембраны (Southern's blot annalylis) была разработана высокоточная методика, получившая название - spot-гибридизации. Основанная на "обработке" ДНК-зондами полученных хрома-тограмм (в виде пятен) фрагментов ДНК, она позволяла оценивать число вирусспецифических участков в исследуемой ДНК.
Кроме того, для выявления ДНК вирусов была разработана методически менее трудоемкая и нашедшая широкое применение в диагностических исследованиях "точечная" или "dot-гиб-ридизация", воспроизводимая на поверхности мембранного фильтра, на основе которой был создан и ряд коммерческих наборов для лабораторной диагностики целого ряда вирусных инфекций. Такие наборы, основанные на этом принципе и использовании в качестве "зонда" меченной радиоактивным фосфором клонированной вирусной ДНК, позволяли выявлять в исследуемом материале порядка 0,5 пг/мл, что в пересчете составляет, примерно, 150 тысяч молекул ДНК, т.е. обладали чувствительностью, превосходящую, примерно, в 100 раз таковую у иммуноферментного метода. Были созданы и тест-системы с аналогичными характеристиками, но основанные на протекании процесса гибридизации в жидкой фазе с последующим аффинным связыванием гибридизированных молекул на твердой фазе и детекции его по ферментативной активности.
Внедрение таких тест-систем в медицину началось с диагностики вирусных инфекций и привело к изменению семантики некоторых понятий и, к примеру, сегодня, говоря что у больного выявлена ДНК вируса - возбудителя той или иной, инфекции, мы понимаем это как выявление самого вируса. Применение методов гибридизации, отличающихся высокой специфичностью результатов (сопоставимой с таковой при применении иммуноферментного метода на основе моноклональных антител) в диагностическую медицину, ознаменовало начало современного этапа ее развития, а понятие "молекулярная диагностика", наряду с такими категориями как "молекулярная биология" и "молекулярная генетика", постепенно заняло прочное место в научной литературе и профессиональной лексике биологов и врачей.
Методы молекулярной диагностики основаны на индикации и идентификации в крови или других биожидкостях обследуемых лиц геномов (или их отдельных фрагментов) искомых вирусов: последние выступают как специфические "моле-
кулярные маркеры" инфицирования обследуемых лиц.
В то же время, внедрение методов гибридизации для изучения структуры генома, особенностей функционирования отдельных генов и, в итоге, выяснения механизмов генетической детерминации возникновения наследственных и некоторых соматических болезней человека тормозилось рядом технических трудностей, возникающих при работе с крупными молекулами ДНК эукариотов.
В первую очередь, проведение таких исследований неизменно сталкивалось с трудностью выделения клеточной ДНК в неповрежденном виде. Необычайно высокая диспропорция между толщиной (2 нм) и длиной (несколько метров) этой молекулы препятствовала выделению ее из клетки в интактном виде, даже при использовании самых щадящих методов: во всех случаях не удавалось предотвратить разрыва полинуклео-тидной цепи в случайно расположенных точках. В результате препарат ДНК, полученный, к примеру, из 100 идентичных клеток, содержит 100 копий исследуемого гена, но все они оказываются в составе разных фрагментов, имеющих различную длину. Изучение же ДНК с помощью исследования отдельных ее коротких фрагментов (олигонуклеотидов), используемых в качестве зондов, также не решало проблемы, так как такая методология отличалась чрезвычайной трудоемкостью, даже при полной автоматизации процесса.
Выход из создавшейся ситуации, по-сущест-ву тормозящей развитие исследований генома, наметился именно благодаря разработке принципов ПЦР - простого метода получения in vitro любой последовательности ДНК в течение нескольких часов в количествах, превышающих исходную в 100 млн раз.
Идеологическую основу ПЦР составляют: 1) принцип взаимной комплементарности полинук-леотидных цепей ДНК и 2) способность ДНК-по-лимеразы (специализированного фермента, открытого Артуром Корнбергом еще в 1955 г.) на матрице одной полинуклеотидной цепи ДНК "достраивать" ее вторую цепь, а также аналогичным образом восполнять недостающие фрагменты или образующиеся "бреши" в двойной спирали ДНК. При этом, синтез второй спирали, как и при естественном процессе внутриклеточной редупликации ДНК, осуществляется из "строительных блоков", функцию которых выполняют нуклеотиды (дезоксинуклеотидтрифосфа-ты).
В то же время, синтез новых полинуклеотид-ных цепей в процессе ПЦР отличался от ранее воспроизведенных in vitro синтезов по ряду особенностей.
Во-первых, амплифицируемая ДНК искус-
ственно, посредством тепловой денатурации, разделяется на две полинуклеотидные цепи, каждая из которых в дальнейшем служит ампли-фицируемой матрицей.
Во-вторых, ампилифицируемый участок ДНК селективно обозначается (фланкируется) двумя "праймерами" - короткими (длиной в 20-30 нук-леотидов) олигонуклеотидными участками с известной последовательностью нуклеотидов.
Праймеры - семейство искусственно синтезированных олигонуклеотидов со строго заданной последовательностью звеньев, которые могут гибридизироваться лишь с определенными участками матричных цепей ДНК. Они и раньше использовались при изучении первичной структуры ДНК для разметки в ней нужных исследователю участков.
Праймеры, посредством водородных связей, сами прикрепляются к комплементарным участкам (гибридизируются с ними), расположенным на З'-концах каждой из ампилифицируе-мых одиночных цепей ДНК, и выступают в качестве "затравки" (стартовых блоков) для инициации последующего ферментативного синтеза недостающих полинуклеотидных цепей, причем, только на тех матрицах (цепях ДНК), которые обозначены праймерами. Именно последнее и обеспечивает высокую селективность амплификации.
В-третьих, "достройка" комплементарных матричной цепи ДНК полинуклеотидных цепей катализируется ДНК-полимеразой (ДНК-зависимой ДНК-полимеразой), которая вносится в реакционную систему извне. Такая "достройка" протекает в виде процесса удлинения прай-меров (стартовых блоков) за счет последовательного присоединения к их З'-концам новых и новых нуклеотидов, комплементарных нуклеоти-дам, расположенным напротив каждого из них в матричной цепи ДНК. Синтез происходит за счет наращивания все новых нуклеотидов вплоть до 5'-конца матричной цепи, с которой гибриди-зирован праймер, а его продуктом становится фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5'-концами праймеров на матричной ДНК.
В-четвертых, повторяя описанный выше цикл, можно добиться экспоненциального увеличения копий ДНК и "размножить" (амплифицировать) нужные фрагменты ДНК до получения их в необходимом количестве. Это и составляет важнейшую особенность ПЦР - амплификацию синтеза полинуклеотидной цепи ДНК de novo, позволяющую в течение короткого промежутка времени получить миллионы копий необходимых участков матричной цепи ДНК, "отмеченных" избранными праймерами.
Процесс амплификации достаточно прост. Первоначально исходную ДНК нагревают до температуры "плавления", при которой ее поли-
нуклеотидные цепи разъединяются. Далее в реакционную смесь вносят необходимые прай-меры и охлаждают ее - при этом праймеры гибридизируются с соответствующими участками обеих полинуклеотидных цепей. Затем в систему вносят достаточное количество нуклеоти-дов и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу и поддерживают температуру на уровне величины, оптимальной для "работы" ДНК-полимеразы, при участии которой осуществляется полный синтез необходимого участка ДНК. В заключение цикла систему вновь нагревают до температуры плавления, что приводит к отсоединению вновь синтезированной копии от матрицы, которая при повторении цикла вновь может присоединить соответствующий праймер. Причем, при осуществлении второго цикла в качестве матриц, в свою очередь, могут функционировать и вновь синтезированные цепи. Таким образом, повторение циклов амплификации позволяет удваивать копии необходимых участков исходной ДНК в геометрической прогрессии по формуле N=2*^
Однако, первоначально методика ПЦР была достаточно трудоемкой и включала внесение в реакционную смесь ДНК-полимеразы после каждого температурного цикла, поскольку этот фермент инактивировался при нагревании. Вскоре это затруднение было преодолено путем использования в реакции термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерии Т1пепт^ аquаticus, обитающих в водах термальных источников Оа^-полимеразы). В отличие от ранее применявшейся для ПЦР ДНК-полимера-зы, выделенной из Е.соН, Taq-полимераза не теряет активности в процессе термоденатурации ДНК, а ее высокий температурный оптимум (75°С) ощутимо повышает специфичность реакции. Благодяря этому, необходимость замены этого фермента после каждого цикла отпала.
Трудоемкость воспроизведения ПЦР была преодлолена благодаря созданию прибора, автоматически меняющего температурный режим по заданной программе - амплификатора или термосайклера 0егтосус1ег).
С другой стороны, в первых тест-системах ПЦР, запатентованных уже в 1984 г. американской фирмой Се^ Согрога^оп, в качестве "метки", с помощью которой идентифицировался продукт реакции, выступали радионуклиды, что создавало трудности, связанные с необходимостью применения радиометрической аппаратуры и обеспечения радиационной защиты персонала и окружающей среды. При этом использовался электрофорез, результаты которого документировались с помощью авторадиографии. Вскоре на смену им "пришли" нерадиоактивные "метки" и, в первую очередь, флюорохромы. В этом случае детекция синтезируемого в реакции продукта стала осущес-
твляться путем разделения ампликонов (комплексов полимеразы и достраиваемой молекулы ДНК) в электрофорезе в геле и обработки электрофореграмм интеркалирующими флюоресцентными "зондами", вводимыми в состав ДНК. Позднее стали использоваться и ферментные "метки" ампликонов и субстратная визуализация результата.
В этих случаях полученные результаты документировались фотографически. В современных вариантах постановки ПЦР с этой целью используются системы, регистрирующие и анализирующие изображение геля в цифровом формате, что позволило отказаться от фотодокументации результатов, хотя не давало ощутимого повышения специфичности результата. Этого удалось добиться посредством использования для регистрации результатов ПЦР методов гибридизации, в основе которых лежат гибридизация амплифицированной ДНК с "меченым" олигонук-леотидным зондом и последующая детекция гиб-ридизационного комплекса с помощью метода, позволяющего идентифицировать метку этого зонда. В зависимости от природы такой метки, в качестве которой могут использоваться флюорохромы, ферменты и гаптены, для ее детекции используется соответствующий метод детекции гибридизационного комплекса, например, флюориметрия, энзимометрия или методы иммуноферментного анализа. Сегодня уже есть основания полагать, что применение гибридиза-ционных методов регистрации результатов ПЦР в медицинских исследованиях будет способствовать развитию более совершенных диагностических систем нового поколения.
Автоматизация процедуры ПЦР и ряд внедренных в ее методику усовершенствований значительно повысили производительность метода и обеспечили существенное расширение сферы его применения.
Необходимо отметить, что ПЦР как диагностический метод обладает рядом особенностей, придающих ему особую привлекательность.
Во-первых, современные варианты постановки метода ПЦР при наличии необходимых фланкирующих праймеров весьма просты и не требуют использования каких-то труднодоступных реагентов. Так, кроме праймеров достаточно иметь амплификатор с тремя фиксированными режимами температуры (96 градусов для денатурации ДНК, 55 градусов для отделения праймеров от матричной цепи и 72 градуса для синтеза комплементарных цепей искомой макромолекулы), а также нуклеотидтрифосфаты, из которых "строится" новая полинуклеотидная цепь. Продолжительность каждого цикла достигает нескольких минут.
Во-вторых, сегодня праймеры любого состава легко синтезируются с помощью современ-
ного оборудования. Многие из праймеров, широко используемых в диагностике производятся рядом фирм и химико-фармацевтических компаний. Кроме того, на современном этапе они могут быть не только приобретены, как коммерческие наборы, например, для иммуно-ферментного анализа, но и заказаны, если возникает необходимость решения каких-то нестандартных аналитических задач. Это освободило исследователей от решения задачи по конструированию праймеров требуемой специфичности.
В-третьих, ПЦР, в принципе, пригодна для амплификации не только геномной ДНК, но и вирусной РНК, что позволяет осуществлять поиск в исследуемом биологическом материале геномов как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов. Это может быть достигнуто посредством двух основных подходов.
Первый из них получил название "обратно-транскриционной ПЦР" или reverse-trаnscriptаse PCR (RT-PCR) и основан на использовании в реакции дополнительного фермента "обратной транскриптазы" (РНКзависимой ДНК-полимера-зы), катализирующей синтез одноцепочечной к-ДНК (ДНК-копии) на матрице вирусной РНК. Далее полученная к-ДНК амплифицируется с помощью Tаq-полимеразы.
Второй подход предполагает использование для амплификации не Taq-полимеразы, а ДНК-полимеразы, еще в 1991 г. выделенной из термофильных бактерий Thermus ^епгюрЫи и способной в присутствие катионов марганца ката-лизироватиь синтез на матрице РНК комплементарной ей одноцепочечной ДНК (к-ДНК). После завершения этапа синтеза к-ДНК, можно, добавив в реакционную среду катионы магния и удалив катионы марганца (путем добавления их хе-латоров), с помощью этого же фермента (Tht-полимеразы) катализировать амплификацию (праймированный синтез) этой к-ДНК. Иначе говоря, указанный фермент на первом этапе процесса осуществляет, по сути, обратную транскрипцию, а на последнем - процесс амплификации полученной к-ДНК.
В-четвертых, исключительно ценной для диагностики особенностью ПЦР является то, что благодаря использованию в ПЦР определенных праймеров с известной последовательностью нуклеотидов, маркирующих лишь определенные молекулы ДНК, этот метод обеспечивает высокую специфичность, выражающуюся в строгой избирательности "копирования", в основе которого лежит способность праймеров гибриди-зироваться только с заданными нуклеотидными последовательностями. Иными словами, тестируемый материал, в котором находится ДНК, подлежащая копированию, может быть "загрязнен" другими веществами и, в том числе, други-
ми посторонними молекулами ДНК.
Более того, было показано, что в одной и той же реакции можно использовать несколько разных пар праймеров. В диагностике инфекций этот подход позволяет проводить скрининг сразу по нескольким возбудителям или одновременно определять наличие в пробе комплекса генетических факторов вирулентности и резистентности к антибактериальным и противовирусным препаратам. С его помощью можно исследовать и состояние нескольких аллельных генов у эукари-отических организмов и, в том числе, у человека. Этот вариант постановки получил название муль-типраймерной или мультиплексорной ПЦР.
В-пятых, ПЦР обладает исключительно высокой чувствительностью: в принципе, с ее помощью можно обнаружить и амплифицировать синтез с матрицы даже одной молекулы ДНК или РНК. Однако реальная чувствительность даже современных тест-систем ПЦР ниже, а ее порог достигает несколько сотен молекул ДНК в 1 мл биопробы. Во всяком случае, чувствительность ПЦР, примерно, в 1000 раз превосходит чувствительность обычной молекулярной гибридизации.
Наиболее высокой чувствительностью отличается, так называемая, "гнездовая" ПЦР (nested PCR). Основной особенностью такой ПЦР является то, что после первого цикла амплификации реакционную смесь переносят в другую лунку, в которую вносят пару праймеров, способных "узнавать" последовательности, расположенные внутри основного ампликона (т.е., в промежутке между участками, "отмеченными" первой парой праймеров, и затем, проводят второй цикл амплификации. Важнейшим преимуществом такой ПЦР является высокая чувствительность и отсутствие необходимости подтверждения специфичности результатов.
В то же время, перенос реакционной смеси из пробирки в пробирку сопряжен с увеличением количества ложноположительных результатов вследствие перекрестной контаминации проб продуктами амплификации.
В-шестых, продукты амплификации поддаются количественной оценке ("количественная ПЦР"). Так, с ее помощью можно определить "вирусную нагрузку" (viral load), т.е. концентрацию вирусов в крови, что, порой, имеет важное клиническое значение. Помимо нередко используемого в практике, по существу, полуколичественного метода "конечных разведений", существует несколько подходов, позволяющих количественно оценивать концентрацию вирусных нуклеиновых кислот в пробе.
Касаясь особенности этих подходов, надо отметить, что на течение ПЦР, как и любой протекающей in vitro биохимической реакции, оказывает влияние целый ряд факторов: инактивация фермента в ходе процесса, присутствие в сме-
си его ингибиторов, изменение концентрации реагентов и др.). Это может приводить к отклонениям от теоретически предсказываемой закономерности накопления продукта ПЦР, а значит и к конфигурации отражающей ее кривой.
Поскольку при построении калибровочных кривых очень сложно принять во внимание все возможные сторонние факторы, способные влиять на кинетику ПЦР, необходимы эталонные образцы (с известным количеством копий), которые, как и тестируемая ДНК, выступают в качестве реагента в ПЦР (стандартный контроль). Экстраполируя результаты их участия в ПЦР и учитывая идентичность условий амплификации стандарта и определяемой ДНК или РНК, нетрудно определить и количество копий матрицы, участвующей в реакции.
Решить эту проблему могут и методики, позволяющие учитывать основные параметры реакции в ходе самой ПЦР. Такие методики, получившие название "ПЦР в реальном времени" (real time PCR), позволяют регистрировать течение реакции по накоплению ее продуктов и строить калибровочные кривые по реальным процессам, происходящим с каждой конкретной пробой. Это достигается применением кинетической регистрации образования продуктов ПЦР за счет, как правило, использования специального зонда, связанными двумя флюорохромами с близкими максимумами поглощения таким образом, чтобы промежуток между ними позволял передавать первичный квант флюоресценции от одной молекулы к другой, генерирующей квант света с большей длиной волны. В этом случае амплифицируется не продукт, а квантовый сигнал, регистрируемый флюоресцентный сигнал прибором со спектральным разрешением анализируемого сигнала.
Анализ кинетики флюоресценции в реальном времени позволяет не только рассчитывать количество исходной ДНК или РНК, используемой в реакции амплификации, но и, детектируя влияние сторонних факторов, вносить необходимые поправки в получаемый результат.
И, наконец, в-седьмых, отметим, что с помощью ПЦР можно не только специфически амп-лифицировать определенную последовательность ДНК, но и с высокой точностью определить ее внутриклеточную локализацию. Этот вариант метода, получивший название "in situ PCR" (IS-PCR) оказался неоценимым как в исследовании латентных вирусных инфекций и экспрессии генов в клетке, так и при оценке эффективности новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровне.
Необычайно большие диагностические и аналитические возможности ПЦР были раскрыты уже к началу 90-х гг. минувшего столетия. С ее помощью был решен целый ряд важных задач,
имевших важное общебиологическое и прикладное значение, только перечень которых занял бы многие десятки страниц.
В медицинских исследованиях внедрение ПЦР оказалось наиболее результативным в вирусологии, микробиологии, онкологии и медицинской генетике.
Всего за 2 года, начиная с 1988 г., были разработаны тест-системы для ПЦР-диагностики целого ряда вирусных, бактериальных и прото-зойных инфекций.
Однако сегодня очевидно, что ее значение в этих областях неравноценно.
Так, в бактериологии ПЦР лишь дополняет уже существующие методы, способствуя уточнению биологических свойств и таксономического положения возбудителей (включая точное определение видовой и подвидовой принадлежности изолятов) и обнаружению атипичных бактерий и трудно идентифицируемых другими методами биопатогенов (хламидии, микоплазмы). Поэтому считается, что применение этого метода оправдано лишь тогда, когда другие методы недостаточно эффективны, например, при диагностике урогенитальных хламидиозов и микоп-лазмозов, хеликобактериоза, для дифференциации вирусных и бактериальных пневмоний и др. Ее применение оправдано и при идентификации резистентности возбудителей к антибиотикам.
В вирусологии же ПЦР обрела прочный статус весьма ценного, а порой, и незаменимого метода. Более того, уже невозможно представить себе область современной вирусологии, где не используется ПЦР.
В зависимости от роли и диагностического значения ПЦР все вирусные инфекции можно условно подразделить на три группы:
1. Инфекции, при которых ПЦР является единственным методом диагностики. Это, в основном, трудно поддающиеся серологической диагностике латентно протекающие инфекции (ретровирусные инфекции, лентивирусные инфекции, герпетические, цитомегаловирусные и др. инфекции) и, в первую очередь, протекающие у иммунокомпрометированных лиц с депрессией продукции антител, а также инфекции, вызванные вирусами гепатита G, TTV и SEN.
2. Инфекции, диагностируемые с помощью, в основном, серологических методов, а ПЦР используется лишь для уточнения особенностей течения инфекционного процесса. Это большинство вирусных инфекций, для которых характерны частая хронизация инфекционного процесса и его субклиническое течение. Наиболее демонстративными примерами таких инфекций могут стать инфекции, вызванные ВИЧ и вирусом гепатита С, при которых отрицательные результаты серологических исследований далеко не всегда означают, что инфекция отсутству-
ет.
При первой из них ПЦР, позволяет выявить "дремлющий" вирус и контролировать латентную ВИЧ-инфекцию у инфицированных, особенно на ранних стадиях ее развития. При инфекции же, вызванной вирусом гепатита С, роль ПЦР особенно велика: она позволяет не только точно выставить этиологический диагноз, но и определить генотип вируса и оценить уровень "вирусной нагрузки", т.е. получить информацию, позволяющую осуществлять рациональный выбор тактики лечения больных и динамический мони-иторинг его эффективности.
3. Инфекции, при которых ПЦР используется как подтверждающий метод, позволяющий верифицировать или отвергнуть результаты серологических методов.
Это те вирусные инфекции, возбудители которых поддаются идентификации с помощью традиционных диагностических методов.
Разумеется, сказанное не относится к использованию ПЦР для решения научных задач, связанных с изучением биологии вирусов и углубленным исследованием патогенеза вирусных инфекций. С этой целью ПЦР может успешно использоваться при всех вышеперечисленных группах вирусных инфекций.
И, наконец, методы, основанные на ПЦР, сегодня остаются наиболее надежными "арбитражными" методами. Поэтому возможностями его применения должны быть обеспечены, по меньшей мере, научные учреждения национального ранга.
Однако, методы ПЦР-диагностики вирусных инфекций пока еще не могут считаться широко доступными для лабораторной службы практического здравоохранения, а целесообразность их применения в диагностических целях в каждом конкретном случае должна определяться, исходя из особенностей стоящей задачи, и рационально соотноситься с соображениями экономического характера и других обстоятельств.
Весьма перспективным применение методов ПЦР оказалось и в онкологии. Сегодня эти методы позволяют не только углубленно исследовать молекулярные механизмы канцерогенеза, но и решать конкретные диагностические задачи. Уже разработаны методы для выявления микрометастазов злокачественных опухолей и молекулярного типирования опухолей разного гистогенеза и лейкозов.
С помощью этих методов осуществляется идентификация и количественная оценка экспрессии отдельных генов, что имеет важное значение для оценки прогноза заболевания и индивидуализации подбора больных для лечения современными биотехнологическими препаратами.
Используя ПЦР, можно определить функциональное состояние онкогенов и генов-супрес-соров (например, генов р16, р53 и др.), и тем самым количественно охарактеризовать относительный риск возникновения той или иной опухоли у конкретного индивидуума. Результаты таких исследований приобретают особо важное значение в случаях, когда фенотипические и генеалогические данные косвенно позволяют подозревать у него наличие выраженной предис-позиции к данному онкологическому заболеванию.
ПЦР-диагностика заняла важное место в пренатальной и постнатальной диагностике целого ряда наследственных заболеваний, а также в оценке состояния отдельных звеньев метаболического гомеостаза при некоторых соматических заболеваний у человека.
Завершая наш краткий очерк, надо заметить, что изложенное не исчерпывает возможностей этих методов, тем более, что мы не затронули таких важных областей их применения, как криминалистика и судебно-медицинская экспертиза (молекулярная идентификация личности и определение видовой и индивидуальной принадлежности биообъектов), генной фармакологии и др.
Значение данного метода в развитии целого ряда современных отраслей биологии и медицины трудно переоценить даже сегодня. Надо особо подчеркнуть, что появление метода ПЦР на протяжение двух минувших десятилетий служило не только необычайно мощным стимулом к дальнейшему развитию методологии молекулярных исследований, но и во многом изменило идеологию этих изысканий, приведя к появлению целой группы подходов к манипулированию с носителями генетической информации и разработке большого семейства амплификационных методов, коренным образом изменившим лицо современной биомедицины.
С. М. Мамедова Медицинский центр "Евромед", г. Баку
