CC BY
117
УДК 547.56:616.36
в.А. мышкин, А.Б. Бакиров
полихлорированные бифенилы и новые модели патологии печени
ФГУН Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека Роспотребнадзора (Уфа)
В статье представлено описание молекулярно-патологических изменений в гепатоцитахпри отравлении животных совтолом — коммерческой смесью пентахлорбифенилов и трихлорбензола, а также новых способов экспериментального моделирования патологии, печени — токсической гепатопатии и цирроза печени. Обсуждаются, клинические и. патогенетические аспекты, гепатотоксического действия полихлорированных бифенилов (ПХБ). На основе полученных результатов разработана принципиальная схема патогенеза гепатотоксического действия полихлорированных бифенилов.
Ключевые слова: свободнорадикальная патология, цирроз печени, токсическая гепатопатия, полихлорированные бифенилы, антиоксиданты
poLicHLoRBipHENYLs AND NEw MoDELs oF HEpATOpATHoloGY
V.A. Myshkin, A.B. Bakirov
Ufa Institute of Occupational Health and Human Ecology, Ufa
The paper focuses on molecular pathologic changes in animal hepatocytes induced by sovtol intoxication, i.e. a commercial mixture of trichlorobenzene. It reviews new methods of an experimental modeling of the liver pathology — hepatopathology and liver cirrhosis. Clinical and pathogenetic aspects of hepatotoxic effects of polichlorbiphenyls are being discussed. Based, on the data obtained, a scheme of pathogenesis of polichlorbi-phenyl effects has been developed.
Key words: free radical pathology, liver cirrhosis, toxic hepatopathology, polichlorbiphenyls, antrioxidants
Начало века в Российской Федерации ознаменовалось катастрофическим нарастанием экологического неблагополучия, социальноэкономическим кризисом, снижением показателей общественного здоровья. Особую роль в этом явлении играют экотоксиканты — вещества чрезвычайно устойчивые в условиях окружающей среды, способные накапливаться в пищевых цепях.
Среди типичных экотоксикантов важное место занимают полихлорированные бифенилы [9, 13]. За долгие годы интенсивного использования ПХБ в промышленности огромное количество этих соединений были внесены в окружающую среду и включены в циркуляцию природных биоценозов.
Высокая опасность ПХБ для здоровья человека неоспорима, однако прогнозирование индивидуальных и популяционных рисков формирования
медицинских последствий требуют углубленного изучения токсогенеза ПХБ. Один из подходов к ее решению может быть основан на разработке адекватных моделей токсического действия ПХБ в эксперименте на животных.
Ранее нами (Мышкин В.А., 1998) экспериментально было показано, что печень крыс обладает чрезвычайно высокой чувствительностью к повреждающему действию смесей ПХБ — совола, арохлора и совтола, имеющих высокое содержание хлора, что явилось основанием для дальнейших исследований по разработке моделей патологии печени человека с использованием указанных экотоксикантов.
Модель токсической гепатопатии создавали путем однократного введения в желудок крысам 50%-го раствора совтола на оливковом масле из расчета 150 мг на 100 г массы тела [14]. Т оксическая
Таблица 1
Методы, использованные при изучении гепатоповреждающего действия совтола
№ Оцениваемые параметры Показатели, методы Источник
1 Морфометрические Относительная масса печени, поля фиброза, отношение стромы к паренхиме, ядерно-цитоплазматическое отношение 1
2 Биохимические, гистоэнзиматические Аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, уроканиназа, лактатдегидрогеназа, щелочная фосфатаза, общий билирубин, холестерин, биохимический анализатор Энкор-2 (Австрия), АТФаза, НАДН-ДГ, липиды, гликоген 2, 6, 7, 10, 14
3 Перекисное окисление Активные формы кислорода, диеновые конъюгаты, триеновые конъюгаты, ТБК-реагирующие продукты 3, 4, 5, 12, 16, 21, 22
4 Антиоксидантная система Активность супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, мочевая кислота 8, 17, 18, 19, 20
примечание: * - содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к Приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 г. № 755). В экспериментах использовано 96 крыс мужского пола, массой 170-230 г, выращенных в условиях вивария УфНИИ Мт ЭЧ от родительских особей из питомника «Рапполово».
Таблица 2
Морфофункциональные показатели крыс с токсической гепатопатией (M ± m)
Показатели Группы животных
Здоровые крысы (п = 10-12) Крысы с гепатопатией (п = 8)
Морфометрические показатели
Относительная масса печени, мг/г массы тела 33,7 ± 0,50 77,8 ± 1,50х“
Безъядерные гепатоциты, % 3,25 ± 0,50 21,0 ± 0,15™
Двуядерные гепатоциты, % 11,0 ± 0,60 2,9 ± 0,10“
Клетки кунсфера, % 4,3 ± 0,15 3,0 ± 0,10“
Ядерно-цитоплазматическое отношение, у.е. 0,44 ± 0,08 0,25 ± 0,01х*
Отношение стромы к паренхиме, у.е. 0,26 ± 0,03 0,22 ± 0,01х
Биохимические и гистоэнзиматические показатели
Аланинаминотрансфераза, ммоль/чл 3,3 ± 0,18 9,45 ± 0,45х“
Аспартатаминотрансфераза, ммоль/чл 10,7 ± 0,14 25,7 ± 0,43х“
Лактатдегидрогеназа, ммоль/чл 29,9 ± 1,0 122,0 ± 10,82““
Щелочная фосфатаза, ммоль/ч л 15,1 ± 0,40 28,5 ± 0,94х“
АТФаза, у.е. 7,4 ± 0,28 5,9 ± 0,19х“
НАДН-дегидрогеназа, у.е. 5,5 ± 0,18 3,7 ± 0,20“
Липиды, у.е. 8,4 ± 0,01 9,8 ± 0,02х
Гликоген, у.е. 8,5 ± 0,02 7,5 ± 0,01х“
Показатели реакций свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы
Активные формы кислорода, у.е. опт.пл. 1,8 ± 0,02 6,6 ± 0,02ххх
Изолированные двойные связи, у.е. опт.пл./100 г тк 2,7 ± 0,01 5,5 ± 0,02ххх
Диеновые конъюгаты, у.е. опт.пл./100 г 2,0 ± 0,09 4,1 ± 0,08хх
Триеновые конъюгаты, у.е. опт.пл./100 г 1,1 ± 0,10 2,1 ± 0,10хх
ТБК-реагирующие продукты, моль/г 90,4 ± 4,10 123,1 ± 3,40х
Супероксиддисмутаза, у.е./мин/г белка 168,8 ± 8,6 125,0 ± 4,5ХХХ
Глутатионпероксидаза, мкмоль/мин/г белка 20,6 ± 1,0 11,4 ± 1,1ххх
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, кат/г белка 528,0 ± 36,9 302,6 ± 23,4х
примечание: х - р < 0,05; хх - р < 0,01; ххх - р < 0,001 достоверно по сравнению с группой «здоровые крысы» (р - уровень значимости для Т-критерия Стьюдента; п - среднее число опытов для каждого показателя.
гепатопатия подтверждена результатами морфологических, гистохимических и биохимических исследований (табл. 1, 2).
К разряду важных свойств ферментов с точки зрения их биологической роли относят их специфичность. Наряду с печеночно-специфичным ферментом уроканиназой, важными биохимическими маркерами, характеризующими состояние пораженной патологическим процессом паренхимы печени, ее метаболизм и функцию, являются ферменты-маркеры цитолитического синдрома
— аланинаминотрансфераза (АлАТ), Аспартата-минотрансфераза (АсАТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), а маркером холестаза является щелочная фосфатаза (ЩФ) [2, 7, 8, 10].
Наличие выраженных метаболических нарушений в гепатоцитах подтверждается повышением трансаминаз в крови — АлАТ и АсАТ, а также увеличением активности ЛДГ, что свидетельствует о развитии цитолитического синдрома. Увеличение
активности ЩФ указывает на развитие холестаза (табл. 2).
В ходе моделирования в гистологических препаратах печени у крыс выявлены выраженные морфологические изменения, аналогичные или близкие к таковым у больных с токсической гепатопатией. При моделировании установлено увеличение относительной массы печени, численности популяции безъядерных гепатоцитов, снижение количества двуядерных гепатоцитов и купферовских клеток, а также уменьшение ядерноцитоплазматического отношения и отношения стромы к паренхиме [1].
При гистохимическом и биохимическом исследовании ткани печени обнаружено увеличение количества общих липидов, уменьшение содержания гликогена на фоне снижения активности НАДН-дегидрогеназы и АТФазы (табл. 2).
Согласно современным данным, важным звеном патогенеза заболеваний печени токсико-
химической этиологии является дисбаланс в системе ПОЛ — АОЗ (окислительный стресс). Полученные результаты свидетельствуют о том, что окислительный стресс в печени на фоне введения животным ПХБ проявляется увеличением активных форм кислорода (АФК), количества первичных и вторичных продуктов ПОЛ — изолированных двойных связей (ИДС), диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК), ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) на фоне подавления активности антиоксидантных ферментов — суперок-сиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГП) (табл. 2).
Моделирование цирроза печени осуществляли путем введения крысам 50%-го раствора совтола на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела дважды в неделю в течение одного месяца. Для питья животным давали 10%-ный раствор этанола [15]. По истечении 4-х недель с начала эксперимента проведена декапитация животных.
Морфогистохимический анализ показал наличие патологического процесса, основными про-
явлениями которого являются фиброз и цирроз печени.
Это подтверждается увеличением относительной массы органа и наличием в печеночной паренхиме полей фиброза, которые занимают 3,1 % (у здоровых крыс на долю соединительной ткани приходится 0,5 %).
Гепатоциты локализованы преимущественно в перипортальной зоне, в состоянии белковой и жировой дистрофии. Определяется декомплектация печеночных балок, пролиферация соединительной ткани в портальных трактах с проникновением фиброзных тяжей в глубь долек. В поле зрения большое количество некротизированных гепатоцитов, отек и разрыхление стромы, в клеточном инфильтрате скопления лимфоцитов. При морфометрии выявлено снижение ядерно-цитоплазматического отношения и отношения стромы к паренхиме (табл. 3).
Гистохимический анализ ткани печени показал увеличение активности кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы и снижение активности АТФазы. Возрастает общий уровень гликозоами-
Таблица 3
Морфо-функциональные показатели крыс с циррозом печени (M ± m)
Показатели Группы животных
здоровые крысы (п = 10-12) крысы с циррозом (п = 8)
Морфометрические показатели
Относительная масса печени, мг/г массы тела 30,2 ± 0,42 78,5 ± 2,4х
Полл фиброза, % площади среза 0,5 ± 0,02 3,1 ± 0,8х
Отношение стромы к паренхиме, у.е. 0,28 ± 0,09 0,11 ± 0,02х
Ядерно-цитоплазматическое отношение, у.е. 0,40 ± 0,06 0,17 ± 0,02х
Биохимические и гистоэнзиматические показатели
Щелочная фосфатаза, у.е. 8,0 ± 0,36 11,9 ± 1,4х
Кислая фосфатаза, у.е. 7,2 ± 0,19 10,5 ± 1,10х
АТФаза, у.е. 6,9 ± 0,10 3,5 ± 0,26х
Аланинаминотрансфераза, ммоль/чл 3,3 ± 0,18 9,45 ± 0,46х*
Аспартатаминотрансфераза, ммоль/чл 10,7 ± 0,14 25,7 ± 0,43х*
Уроканиназа, нмоль/сл - 54,9 ± 3,5х“
Лактатдегидрогеназа, ммоль/чл 29,9 ± 1,0 102,0 ± 16,2ХХХ
Гликозаминогликаны, ед.опт. пл. 58,0 ± 6,62 132,5 ± 12,8х*
Общий билирубин, мкмоль/л 29,0 ± 0,6 19,6 ± 0,81*
Холестерин, моль/л 4,9 ± 0,29 8,7 ± 0,8*
Мочевая кислота, моль/л 344,5 ± 15,8 17,5 ± 6,42***
Перекисное окисление липидов и состояние антиоксидантной системы
Диеновые конъюгаты, усл.ед.опт.пл.Д272 0,454 ± 0,022 0,632 ± 0,026*
ТБК-РП, нмоль/г 90,4 ± 4,1 128,8 ± 6,0*
Супероксиддисмутаза, усл.ед/мин/г белка 168,8 ± 8,6 95,8 ± 9,9*
Глутатионпероксидаза, мкмоль/мин/г белка 20,6 ± 1,0 9,8 ± 1,8**
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, кат/г белка 528,6 ± 36,9 806,5 ± 63,4*
примечание: х - р < 0,05; хх - р < 0,01; ххх - р < 0,001 достоверно по сравнению с группой «здоровые крысы» (р - уровень значимости для Т-критерия Стьюдента; п - среднее число опытов для каждого показателя).
ногликанов. У здоровых крыс активность фермента уроканиназы не определяется, а ее появление является следствием нарушения гистогематиче-ских барьеров печени в результате массированного некробиотического процесса [10]. Введение животным, потребляющим вместо воды этанол, смеси ПХБ по вышеприведенной схеме, повышает активность уроканиназы. Наряду с возрастанием в крови данного фермента у «цирротических» крыс повышается активность АлАТ, АсАТ, ЛДГ и КФ. В большей степени повышается активность ЛДГ (табл. 3).
О нарушении метаболической и синтетической функций печени свидетельствует также гиперхо-лестеринемия и гипобилирубинемия. Обращает внимание значительное падение концентрации мочевины, которая согласно современным представлениям является одним из важных компонентов эндогенной антиоксидантной системы организма [4]. Нарушение функционирования антиоксидантной системы (АОС) проявляется также подавлением активности антиоксидантных ферментов — СОД, ГП и повышением активности ключевого фермента глюкозо-фосфатного шунта — Г-6-ФДГ (табл. 3). В
рис. 1. Принципиальная схема молекулярно-патологических нарушений в гепатоцитах при поражении печени полихлорированными бифенилами. ЭТЦ - электронтранспортная сеть; АФК - активная форма кислорода; ПОЛ - перекисное окисление липидов.
условиях «токсической гепатопатии» активность данного фермента, напротив, снижена (табл. 2). По-видимому, различия в активности Г-6-ФДГ отражают преобладающую реакцию окисления глюкозы в гепатоцитах в условиях различного по интенсивности химического воздействия для синтетических или энергетических целей.
В заключение приводим принципиальную схему молекулярно — патологических нарушений печени ПХБ (рис. 1). Наряду с ранее опубликованными данными они свидетельствуют о ключевой роли ПОЛ в патогенезе индуцированного ПХБ поражения печени.
Описанные модели соответствуют основным критериям свободнорадикальной патологии, что подтверждается:
• повышением содержания в тканях печени продуктов свободнорадикального окисления — ДК, ТК, ТБК-РП, а также увеличением образования в печени AКМ при одновременном подавлении ферментных механизмов антиоксидантной защиты;
• снижением концентрации облигатного антиоксиданта (мочевой кислоты).
Вместе с тем, мы полагаем, что необходимы дальнейшие исследования, доказывающие значимость свободнорадикальных механизмов с применением более совершенных методов диагностики окислительного стресса, с одной стороны, и новых более узкоспецифических антиоксидантов — с другой.
литература
1. Двтандилов Г.Г. Медицинская морфометрия
I Г.Г. Двтандилов. — М.: Медицина, 1990. — З82 с.
2. Берстон М. Гистохимия ферментов I М. Бер-стон. — М.: Мир, 1965. — 4З8 с.
3. Владимиров ЮА. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах I ЮА. Владимиров, A.^ Aрчаков. — М.: Медицина, 1972.
— 252 с.
4. Волчегорский ИА. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма I ИА. Волчегорский, И.И. Долгушин, ОА. Колесников и др. — Челябинск, 2000.
— 167 с.
5. Гаврилов В.Б. Спектрофотометрическое определение содержания перекисей липидов в плазме крови I В.Б. Гаврилов, М.Н. Мишкорудная
II Лабор. дело. — 198З. — № З. — С. ЗЗ — З6.
6. Журавлева Т.Б. Введение в количественную гистохимию ферментов I Т.Б. Журавлева, P.A. Прочуханов. — М.: Медицина, 1978. — 244 с.
7. Колб В.Г. Клиническая биохимия I В.Г. Колб, В.С. Камышников. — Минск. — 1976. — З12 с.
8. Королюк МА. Метод определения активности каталазы I МА. Королюк, Л.И. Иванова,
И.Г. Майорова // Лабораторное дело. — 1988. — № 1. - С. 16-18.
9. Курляндский Б.А. Токсикология на рубеже веков: состояние. Проблемы, перспективы / Б.А. Курляндский // Токсикологический вестник.
- 1998. - № 6. - С. 6-9.
10. Мардашев С.Р. Обнаружение уроканиназы в крови при отравлении четыреххлористым углеродом / С.Р. Мардашев, В.А. Буробин // Вопросы медицинской химии. - 1963. - № 7. - С. 93-94.
11. Пирс Э. Гистохимия: теоретическая и прикладная / Э. Пирс. - М.: Мир, 1962. - 929 с.
12. Плацер З. Процессы переокисления липидов при повреждении и ожирении печени / З. Плацер, М. Видлакова, Л. Кушелева // Чехословацкое медицинское обозрение. - 1970. - Т. 16, № 1. - С. 30-41.
13. Софронов Г.А. Экотоксиканты и здоровье населения / Г.А. Софронов, В.С. Румак, А.В. Епифанова // Вестник РАМН. - 2002. - № 11. - С. 24-26.
14. Способ моделирования токсической ге-патопатии / В.А. Мышкин [и др.] // Патент на изобретение № 2188457 по заявке № 2000103102 от 27.08.2002.
15. Способ моделирования цирроза печени / В.А. Мышкин [и др.] // Патент на изобретение № 2197018 по заявке 32000103880 от 20.01.2003.
16. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвилли // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1988. - С. 66-68.
17. Чумаков В.Н. Количественный метод определения Zn, Cu-зависимой супероксиддисму-тазы в биологическом материале / В.Н. Чумаков, Л.Ф. Осинская // Вопросы медицинской химии.
- 1977. - № 5. - С. 712-716.
18. Fridovich J. Superoxide radical and superoxide dismutase / J. Fridovich // Accounts Chem. Soc.
- 1972. - Vol. 5, N 10. - P. 321 -326.
19. Fridovich J.Superoxide dismutase / J. Fridovich // Ann. Rev. Biochem. - 1975. - Vol. 44. -P. 147-159.
20. Gloc G. Further studies on the properties and assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase of rat liver / G. Gloc, P.Mclean // Biochem. - 1953. - Vol. 55, N 3. - P. 400-408.
21. May H.E. A kinetic assay of TPNH-dependent microsomal lipid peroxidation by changes in difference spectra / H.E. May, D.J. Reed // Anal. Biochem. -1973. - Vol. 55, N 2. - P. 331 -337.
22. Tappel A.K. Lipid peroxidation damage to all components / A.K. Tappel // Fed. Proc. - 1973. -Vol. 32, N 8. - P. 1870-1874.
сведения об авторах:
ФГУН Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека Роспотребнадзора. 450106, г. Уфа, ул. Степана Кувыкина, 94. Мышкин Владимир Александрович, ведущий научный сотрудник отдела токсикологии д.м.н., профессор.
Бакиров Ахат Бариевич, директор, д.м.н, профессор, чл-корр. АНРБ, т. (347) 255-19-57, тел/факс (347) 255-56-84, [email protected].
