Е.В. Воронкова, Ю.В. Полюхович, А.В. Савчук, О.Н. Гукасян, А.П. Ермишин
ПОЛЕВАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОФТОРОЗУ ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПУТЕМ ОПЫЛЕНИЯ ВИДА-ПОСРЕДНИКА SOLANUM VERRUCOSUM И SvSV-ЛИНИЙ НА ЕГО ОСНОВЕ ДИПЛОИДНЫМИ
1 EBN ВИДАМИ КАРТОФЕЛЯ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Создание устойчивых к комплексу патогенов сортов картофеля с широкой генетической основой - одно из основных направлений в селекции этой культуры. В связи с тем, что генетическая база культурного картофеля относительно узкая, актуальным является ее расширение за счет интрогрессии ценных генов устойчивости к болезням и вредителям от диких видов. Несмотря на большое разнообразие диких и примитивных культурных видов картофеля [1, 2 и др.], в родословной современных сортов представлены лишь некоторые из них [3]. Связано это с тем, что многие виды картофеля практически не изучены, а те из них, у которых обнаружены ценные селекционные признаки, плохо или вообще не скрещиваются с сортами культурного картофеля.
Для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров в лаборатории генетики картофеля ГНУ «Институт генетики и цитологии» НАН Беларуси был разработан ряд новых методов, с помощью которых получены уникальные межвидовые гибриды, обладающие высокой устойчивостью к важнейшим болезням. В частности, благодаря использованию вида-посредника Solanum verrucosum и SvSv-линий на его основе удалось вовлечь в селекцию дикие диплоидные 1 EBN виды картофеля S. hul-
bocastanum, S. pinnatisectum, S. polyadenium, S. commersonii, известные как перспективные источники долговременной ^-генной устойчивости к фитофторозу и вирусным болезням [1, 4-9 и др.]. Молекулярно-генетический анализ межвидовых гибридов подтвердил интрогрессию в их геном генетического материала 1 EBN видов [10, 11]. Проведена первичная оценка гибридов по ряду важных для интрогрессивной селекции признаков, таких как способность к формированию клубней в условиях характерного для Беларуси длинного дня, функциональная фертильность пыльцы межвидовых гибридов [12].
Целью настоящей работы являлась оценка полевой устойчивости межвидовых гибридов к фитофторозу картофеля. Такая оценка позволит выделить наиболее устойчивые к патогену генотипы. В ходе дальнейших исследований предполагается изучить генетический контроль выявленной устойчивости, идентифицировать гены, отвечающие за ее формирование. Результатом этих исследований должно стать создание линий-доноров признака и молекулярных маркеров, удобных для использования в селекционном процессе при идентификации новых генов устойчивости к фитофторозу в исходном материале.
Материалы и методы
В качестве материала использовали гибриды F у которых в качестве материнской формы был дикий самосовместимый диплоидный 2 EBN вид картофеля S. verrucosum или SvSv-линии, представляющие собой F2 гибриды между дигаплоидами S. tuberosum и S. verrucosum, имеющие S-гены в гомозиготном состоянии, полученные от S. verrucosum. При
получении данных межвидовых гибридов в качестве опылителей были использованы образцы диких диплоидных 1 EBN видов картофеля из Мексики & bulbocastanum, S. ртпаЫ-sectum, S. polyadenium и южноамериканского вида & commersonii [12].
Оценку полевой устойчивости к фитофто-розу гибридов осуществляли визуально на
естественном инфекционном фоне по степени поражения болезнью кустов картофеля, произрастающих на экспериментальном поле Биологической опытной станции Института генетики и цитологии НАН Беларуси (г. Минск). Сбор данных проводили 6 раз за сезон вегетации в период с 5 июля по 16 августа 2011 г. (гибриды на основе S. verrucosum и SvSv-линий) и с 6 июля по 15 августа 2012 г. (гибриды на основе SvSv-линий) с периодичностью в 7-10 дней. Учитывали площадь поражения листовой и стеблевой поверхности растений (от 0 до 100%). По результатам данных поражения растений фитофторозом за период наблюдения рассчитывали индекс AUDPC (Areal Under Disease
Progress Curve - площадь под кривой нарастания болезни), позволяющий оценить не только абсолютные значения уровня развития заболевания, но и динамику его развития [13]. Индекс AUDPC рассчитывали согласно [14, 15]. Высокоустойчивыми (устойчивость 8,1-9,0 баллов по традиционной 9-бальной шкале) считали гибриды с AUDPC 0,00-0,20 (группа устойчивости 5); устойчивыми (6,1-8,0 баллов) - с AUDPC 0,21-0,40 (группа 4); среднеустойчи-выми (4,9-6,0 баллов) - с AUDPC 0,41-0,60 (группа 3); слабоустойчивыми (3,0-4,9 баллов) - с AUDPC 0,61-0,80 (группа 2); неустойчивыми (1,0-2,9 баллов) - с AUDPC 0,81-1,0 (группа 1) [15].
Результаты и обсуждение
Селекционный материал картофеля с ин-трогрессированными генами от диплоидных 1 EBN видов из Мексики представляет интерес в качестве источников вертикальной устойчивости к фитофторозу за счет Rpi-генов, которые, в отличие от давно используемых в селекции R-генов гексаплоидного вида demissum, не обладают выраженной расоспецифичностью и обеспечивают долговременную устойчивость вне зависимости от расового состава возбудителя фитофто-роза. В табл. 1 приведены данные оценки полевой устойчивости к фитофторозу межвидовых гибридов, полученных с использованием вида-посредника verrucosum. Оценка уровня устойчивости к фитофторозу гибридов между verrucosum и 1 EBN видами картофеля проводилась нами только в
2011 году, поскольку для этих гибридов было характерно слабое клубнеобразование [12], что не позволило повторить эксперимент в
2012 г. Как видно из представленных данных, в группу устойчивых (AUDPC 4-5 , что соответствует по общепринятой шкале 6,19,0 баллам устойчивости) попало более 70% всех оцененных гибридов, полученных при опылении verrucosum разными диплоидными 1 EBN видами картофеля. Появление среди образцов с высокой устойчивостью к фитофторозу (группа AUDPC 5) гибридов с участием мексиканских видов bulbocasta-num и pinnatisectum вполне закономерно. Эти виды рассматриваются в литературе как наиболее перспективные источники долго-
временной устойчивости к фитофторозу. Южноамериканский вид S. commersonii по данным [3] также можно отнести к видам, представляющим интерес в качестве источника генов устойчивости к фитофторозу (при многолетних испытаниях суммарная устойчивость различных популяций этого вида оказалась на уровне устойчивых и высоко устойчивых генотипов). polyadenium в этих же испытаниях проявил себя как вид со средней устойчивостью к фитофторозу (6,7 балла по 9-балльной шкале). Очевидно, это обстоятельство является причиной формирования самой незначительной доли высоко устойчивых генотипов с участием poly-adenium среди испытанных нами гибридов verrucosum х 2х 1 ЕВ^виды. В пределах этого вида была отмечена высокая вариация признака (коэффициент вариации 26,9). Поэтому, видимо, в потомстве polyadenium, как, впрочем, и в потомстве commersonii, наряду с устойчивыми присутствовали также и слабо устойчивые (на уровне 3-4 баллов по 9-балльной шкале) генотипы. При получении межвидовых гибридов каждый из 1 EBN видов был представлен одновременно несколькими различными генотипами, взятыми от разных коллекционных образцов, пыльца которых была включена в соответствующую виду-опылителю смесь пыльцы. Поэтому в качестве отцовской формы полученных гибридов могли быть генотипы с разным уровнем устойчивости к фито-фторозу.
*уег - X verrucosum; Ь1Ь - X bulbocastanum; рШ: - & pinnatisectum; рИ - & polyadenium; стт - X сотте^опИ; 2х 1 EBN - все диплоидные 1 EBN виды, использованные в скрещиваниях; **А - количество генотипов данной группы AUDPC (шт.); ***В - доля в гибридной популяции (%).
Таблица 1
Распределение гибридов между S. уеггиео$ит и диплоидными 1 EBN видами картофеля по признаку «полевая устойчивость к фитофторозу» (Минск, 2011 г.)
Гибриды* Количество, шт. Группа AUDPC
5 4 3 2 1
А** В*** А В А В А В А В
ver х blb 8 2 25,0 5 62,5 1 12,5 0 0,0 0 0,0
ver х pnt 12 4 33,3 6 50,0 2 16,7 0 0,0 0 0,0
ver х pld 13 2 15,4 5 38,5 5 38,5 1 7,7 0 0,0
ver х cmm 12 4 33,3 4 33,3 3 25,0 1 8,3 0 0,0
Все гибриды ver х 2x 1 EBN 45 12 26,7 20 44,4 11 24,4 2 4,4 0 0,0
По-видимому, существенный вклад в формирование высокой или очень высокой устойчивости к фитофторозу гибридов вносит и материнский вид S. verrucosum, многие образцы которого, согласно [3, 16], могут служить в качестве источников генов устойчивости к фи-тофторозу. В частности, в результате пяти лет испытаний в РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодо-овощеводству» большого числа генотипов этого вида, взятых из разных источников, была показана их суммарная устойчивость на уровне 8,4 балла, то есть они относились к группе высокоустойчивых [3]. Этот вид отличался одним из наиболее низких коэффициентов вариации по данному признаку. Таким образом, ценность S. verrucosum при вовлечении в генетический пул культурного картофеля генофонда диких видов состоит не только в использовании его в качестве вида-посредника, но также и источника важных для селекции генов. Однако существенной проблемой использования в селекции гибридов между S. verrucosum и диплоидными 1 EBN видами картофеля является низкий уровень клубнеобразования у гибридов, что ведет к потере большей части селекционного материала при полевых испытаниях, предшествующих отбору генотипов для дальнейшей гибридизации и, тем самым, снижает селекционную ценность таких гибридов.
Решением проблемы слабого клубнеобразования межвидовых гибридов с участием 1 EBN диплоидных видов может быть использование в качестве вида-посредника не дикого вида S. verrucosum, а созданных на его основе диплоидных линий культурного картофеля, так называемых SvSv-линий [17]. Гибриды между SvSv-линиями и 1 EBN дикими видами картофеля лучше приспособлены к климатическим условиям Беларуси (умеренные широты, длинный летний день), так как создаются на основе дигаплоидов S. tuberosum - вида имеющего длительную историю выращивания и селекции на хорошее клубнео-бразование в умеренных широтах. В силу этого межвидовые гибриды на основе SvSv-линий обладают более высокой, по сравнению с гибридами S. verrucosum, способностью образовывать клубни. Несмотря на то, что среди гибридов с участием SvSv-линий также наблюдалась достаточно большая часть генотипов, не формирующих клубни [12], нам удалось сохранить достаточное количество гибридов для проведения многолетних испытаний. Оценка полевой устойчивости к фитофторозу в разные годы важна для отбора генотипов с устойчивостью к фитофторозу без выраженного расоспецифического характера. Такая .R-генная устойчивость представляет наибольший интерес для селекции. В табл. 2 представлены результаты испытаний полученных на основе SvSv-линий межвидовых гибридов в 2011 и 2012 гг.
Таблица 2
Распределение гибридов между SvSv-линиями и диплоидными 1 EBN видами картофеля по признаку «полевая устойчивость к фитофторозу»
(Минск, 2011, 2012 гг.)
Гибриды* Количество, шт. Группа AUDPC
5 4 3 2 1
А** В*** А В А В А В А В
2011 г.
SvSv х blb 126 45 35,7 43 34,1 33 26,2 5 4,0 0 0,0
SvSv х pnt 139 45 32,4 41 29,5 27 19,4 17 12,2 9 6,5
SvSv х pld 59 23 39,0 20 33,9 10 17,0 3 5,1 3 5,1
SvSv х cmm 11 1 9,1 4 36,4 4 36,4 0 0,0 2 18,2
Все гибриды SvSv х 2x 1 EBN 335 114 34,0 108 32,2 74 22,1 25 7,5 14 4,2
2012 г.
SvSv х blb 61 10 16,4 15 24,6 12 19,7 10 16,4 14 23,0
SvSv х pnt 79 12 15,2 31 39,2 10 12,7 8 10,1 18 22,8
SvSv х pld 30 3 10,0 6 20,0 5 16,7 4 13,3 12 40,0
SvSv х cmm 7 2 28,6 2 28,6 1 4,3 1 14,3 1 14,3
Все гибриды SvSv х 2x 1 EBN 177 27 15,3 54 30,5 28 15,8 23 13,0 45 25,4
* SvSv - SvSv линии, ver - S. verrucosum; blb - S. bulbocastanum; pnt - S. pinnatisectum; pld - S. polyadenium; cmm - S. commersonii; 2x 1 EBN - все диплоидные 1 EBN виды, использованные в скрещиваниях; **А - количество генотипов данной группы AUDPC (шт.); ***В - доля в гибридной популяции (%).
Результаты двух лет испытаний гибридов, полученных на основе SvSv-линий, показали, что их использование для передачи признака устойчивости к фитофторозу от диких видов обладает высокой эффективностью. Хотя, в отличие от селекционного материала на основе 5. verrucosum, среди гибридов, полученных с участием SvSv-линий, наблюдали появление неустойчивых (группа 1 AUDPC) образцов, их количество, особенно в первый год испытаний, было невелико (менее 5%), а в потомстве от опыления SvSv-линий bulbocastanum они отсутствовали полностью.
До половины генотипов гибридных популяций наследовали высокий уровень полевой устойчивости к фитофторозу и в 2012 году, который отличался более значительной поражае-мостью растений фитофторозом, чем 2011 г. Так, 41% гибридов на основе 5. bulbocastanum в 2012 г. был отнесен к устойчивым (4 группа АЦОРС) и высоко устойчивым к патогену
(5 группа АЦОРС). Доля устойчивых гибридов на основе 5. pinnatisectum составила более 54%. Наиболее высокая частота устойчивых генотипов в 2012 г. была среди гибридов с участием 5. commersonii. Однако небольшая выборка генотипов, оцененных в ходе испытаний, не дает оснований считать этот вид картофеля более эффективным источником генов устойчивости к фитофторозу, чем 5. bulbocas-tanum или Б. pinnatisectum.
Наличие значительной доли генотипов с очень высокой устойчивостью (более 8 баллов по 9-балльной шкале) среди гибридов, полученных при скрещивании 5. bulbocastanum, как с 5. verrucosum, так и SvSv-линиями, было вполне ожидаемым. У семи из восьми генотипов дикого вида, пыльца которых вошла в смесь для опыления, нами отмечено наличие ПЦР-маркера высокоэффективного гена устойчивости к фитофторозу Кр^ЫЬ1 [10]. По-видимому, следует ожидать выявления вы-
сокоэффективных генов устойчивости к фитофторозу у S. pinnatisectum и S. commersonii. Об этом свидетельствует количество высоко устойчивых генотипов у гибридов с участием этих видов, сопоставимое с отмеченным у гибридов на основе S. bulbocastanum. Наименьшее количество устойчивых генотипов было среди гибридов на основе S. polyadenium. Однако и в данном случае устойчивыми оказались около трети оценивавшихся генотипов.
Снижение доли устойчивых генотипов и одновременное повышение доли неустойчивых во второй год испытаний в популяции гибридов, полученных на основе SvSv-линий, может быть связано с несколькими причинами. Во-первых, различия могут быть обусловлены изменением интенсивности воздействия внешних факторов среды на развитие патогена, во-вторых, не исключена вариабельность в расовом составе гриба. В этом случае снижение уровня устойчивости должно проявляться у тех генотипов, устойчивость которых носит полигенный характер или определяется наличием расоспецифических Rpi-генов, родственных описанным у S. demissum [5, 18]. Например, известен расоспецифический характер взаимодействия с патогеном картированного у S. bulbocastanum гена Rpi-blb3 [19]. Снижение числа устойчивых генотипов в оцениваемой гибридной популяции может быть связано и с определенной количественной потерей в ней генотипов из-за отсутствия клубнеобра-зования у части устойчивых к фитофторозу гибридов. Отсутствие клубнеобразования в большинстве случаев являлось следствием
замедленного развития растении и их позднеспелостью, вызванной наличием у них генетического материала генов диких видов, относящихся к короткодневным видам картофеля. Таким образом, снижение уровня устойчивости в популяции межвидовых гибридов может быть обусловлено и негативным влиянием ин-трогрессированного генетического материала диких видов (отсутствие завязывания клубней, очень длинный период покоя клубней, позднеспелость). Тем не менее, во всех гибридных популяциях, полученных на основе SvSv-линий, были выделены генотипы со стабильно высокой и стабильно низкой устойчивостью, которые могут послужить родительскими образцами для получения расщепляющихся популяций, предназначенных для маркирования и картирования новых Rpi-генов.
Хотя частота высокоустойчивых и устойчивых к фитофторозу гибридов в популяциях, полученных на основе SvSv-линий несколько ниже, чем среди гибридов на основе S. verrucosum, при использовании для вовлечения в селекцию диплоидных 1 EBN видов картофеля первые, по нашему мнению, более перспективны. Они несут большее количество признаков культурного картофеля и меньшее количество нежелательных для селекции признаков дикого вида. Поэтому при создании на их основе продвинутого селекционного материала потребуется меньше циклов беккросса культурным картофелем. Это свойство SvSv-линий может быть усилено в ходе специальной селекции, включающей их беккроссирование дигаплоидами S. tuberosum в сочетании с отбором гомозигот SvSv.
Заключение
В результате двухлетней оценки межвидовых гибридов картофеля, полученных при опылении вида-посредника S. verrucosum и SvSv-линий на его основе диплоидными 1 EBN видами картофеля S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. polyadenium и S. commersonii, показана высокая наследуемость межвидовыми гибридами признака полевой устойчивости к фитофторозу, интро-грессированного от 1 EBN диких видов. Несмотря на более высокую частоту устойчивых генотипов (8,1-9 баллов по 9-балльной шкале) среди межвидовых гибридов на основе S. verrucosum, по сравнению с гибридами на
основе SvSv-линий, последние представляются более перспективными для интрогрес-сии R-генной устойчивости к фитофторозу от диплоидных 1 EBN видов в селекционный материал. При относительно большой среди этих гибридов доле (более трети популяции) устойчивых (6,1-8 баллов) и высоко устойчивых (8,1-9 баллов) генотипов, они несут большее количество признаков культурного картофеля, в частности способность к стабильному клубнеобразованию в условиях длинного дня. Несмотря на изменчивость уровня устойчивости к фитофторозу в гибридных популяциях в разные годы испытания, среди гибридов
на основе SvSv-линий выделены образцы ных для маркирования и картирования новых со стабильно высокой и стабильно низкой Rpi-генов, интрогрессированных в селекци-
устойчивостью к фитофторозу. Такие генотипы могут быть использованы в качестве родительских форм при создании расщепляющихся гибридных популяций, предназначен-
онный материал от диплоидных 1 EBN видов картофеля. Полученный материал является источником генов высокой устойчивости картофеля к фитофторозу.
Список использованной литературы
1. Hawkes, J.G. The Potato: Evolution, biodiversity and genetic resources / J.G. Hawkes. -London : Belhaven Press, 1990. - 259 p.
2. Горбатенко, Л.Е. Конспект системы секции Petota Dumort. рода Solanum L. из Южной Америки / Л.Е. Горбатенко // Сборник научных трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции. - Ленинград: Мир, 1984. -С.92-108.
3. Ермишин, А.П. Картофель / А.П. Ер-мишин, Е.В. Воронкова, В.А. Козлов // Генетические основы селекции растений Т. 2. Частная генетика растений / под науч. ред. А.В. Кильчевского, Л.В. Хотылевой. -Минск: Беларус. навука, 2010. - С. 156-234.
4. Иванюк, В.Г. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков / В.Г. Иванюк, С.А. Банадысев, Г.К. Журомский. - Минск: Белпринт, 2005. - 696 с.
5. Росс, Х. Селекция картофеля. Проблемы и перспективы (пер. с англ.) / Х. Росс - М.: Агропромиздат, 1989. - 183 с.
6. Yermishin, A.P. The development of initial parental material for breeding disease resistant potatoes at the diploid level / А.Р. Yermishin. // Plant Breeding and Seed Science. - 2000. -Vol. 44, N 2. - P. 105-115.
7. Swiezynski, K.M. Breeding potato culti-vars with tubers resistant to Phytophtora infes-tans / K.M. Swiezynski, E. Zimnoch-Guzowska // Potato Research. - 2001. - Vol. 44. - P. 97-117.
8. Zoteyeva, N.M. Evaluation of wild potato species adapted to long day condition for resistance to Phytophtora infestans and other valuable traits. / N.M. Zoteyeva // Breeding and adaptation of potatoes. Abstracts of EAPR conference papers and posters (26-30th July, 2003, Oulu, Finland). - 2003. - P. 10.
9. Sliwka, J. Genetic factors encoding resistance to late blight caused by Phytophthora in-festans (Mont.) De Bary on the potato genetic map / J. Sliwka // Cell. Mol. Biol. Let. - 2004. -Vol. 9. - P. 855-867.
10. Полюхович, Ю.В. Интрогрессия специфических локусов дикого вида картофеля Solanum bulbocastanum в межвидовые гибриды / Ю.В. Полюхович, Е.В. Воронкова, А.П. Ермишин / Материалы I конференции молодых ученых Украины с международным участием «Биология растений и биотехнология», 5-7 октября 2011 г., ИПБГ, Белая Церковь, Украина. - Белая Церковь: ИПБГ - С. 62.
11. Yermishin, A.P. A new look at the problem of inter-EBN interspecific crosses in potato / А.Е Yermishin [et al.] / In: EAPR 2011 (Abstracts of the 18th Triennial Conference of the European Association for Potato Research July 24-29, 2011 Oulu, Finland), J. Santala and J.P.T. Valkonen (eds.). - Helsinki, Finland, 2011. -P. 71.
12. Полюхович, Ю.В. Характеристика гибридов между 2 EBN видом-посредником Solanum verrucosum и 1 EBN диплоидными видами картофеля / Ю.В. Полюхович [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. трудов / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; редколл: А.В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск: Право и экономика, 2012. - С. 55-63.
13. Shaner, G. The effect of nitrogen fertilization on the expression of slow-mildening resistance in knox wheat / G. Shaner, R.E. Finney // Phytopathology. - 1977. - Vol. 67. - P. 10511056.
14. Shaw, M.W. Pathogen population dynamics / M.W. Shaw, G. Shaner, R.E. Finney // The epidemiology of plant diseases (B.M. Cooke, D. Gareth Jones and B. Kaye eds.). - Springer, 1998. - P. 193-214.
15. Jenkins, J.C. Classifying the relative host reaction in potato cultivars and breeding lines to the US-8 strain of Phytophtora infestans in Minnesota / J.C. Jenkins, R.K. Jones // Plant Disease. - 2003. - Vol. 87, N 8. - P. 983-990.
16. Устойчивость образцов диких видов картофеля к болезням и вредителям. Каталог
мировой коллекции ВИР / С.Д. Киру [и др.]; ВИР им. Н.И. Вавилова. - Санкт-Петербург, 2004. - Вып.761. - 56 с.
17. Полюхович, Ю.В. Создание линий-посредников для преодоления межвидовой несовместимости у картофеля / Ю.В. Полюхович [и др.] // Вести НАН Беларуси, сер. биол. наук. - 2010, № 2. - С. 51-58.
18. Gebhardt, C. Organization of genes controlling disease resistance in the potato genome / C. Gebhardt, J.P.T. Valkonen // Annu. Rev. Phy-topathol. - 2001. - Vol.39. - P. 79-102.
19. Lokossou, A.A. Diversity, distribution and evolution of Solanum bulbocastanum late blight resistance genes / A.A. Lokossou [et al.] / Mol. Plant. Microbe Interact. - 2010. - Vol. 23, N 9. - P. 1206-1216.
Дата поступления статьи 18 июня 2013 г.