CC BY
4Ю.В. Полюхович, Е.В. Воронкова, А.В. Савчук, А.П. Ермишин
ХАРАКТЕРИСТИКА ГИБРИДОВ МЕжДУ 2 EBN ВИДОМ-ПОСРЕДНИКОМ SOLANUM VERRUCOSUM И 1 EBN ДИПЛОИДНЫМИ
ВИДАМИ КАРТОФЕЛЯ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, Академическая, 27
Введение
Наиболее перспективное направление интро-грессии генофонда диких видов в селекционный материал картофеля включает гибридизацию их с дигаплоидами S. tuberosum, проведение отбора на диплоидном уровне и мейотическое удвоение числа хромосом у отобранных клонов [1, 2]. Ди-гаплоиды S. tuberosum (2n=2x=24) относительно легко скрещиваются со многими диплоидными дикими видами картофеля, произрастающими в Южной Америке. Однако существует ряд интересных для селекции диких видов картофеля (мексиканские диплоидные виды из секций Bulbocastana, Pinnatisecta, Polyadenia, южноамериканские виды S. commersonii и S. circaeifolium и другие), которые не скрещиваются с дигаплоидами S. tuberosum либо дают потомство, которое сложно использовать в селекционном процессе.
Проблемы получения гибридов с участием этих видов обусловлены, прежде всего, гибелью гибридных зародышей вследствие недоразвития эндосперма и связаны с понятием EBN (endosperm balance number - балансового числа эндосперма). Каждому виду предписывается определенный специфический показатель (его EBN), значение которого определяет его поведение при гибридизации с другими видами. Дигаплоиды культурного картофеля S. tuberosum имеют 2 EBN, названные выше диплоидные дикие виды - 1 EBN. А для успешной гибридизации EBN родительских форм должны совпадать. Кроме того, для диплоидных видов картофеля из Мексики при гибридизации их с дигаплоидами S. tuberosum характерны также презиготные барьеры несовместимости, которые проявляются в виде ин-
гибирования роста пыльцевых трубок в пестике [3 ].
1 EBN диплоидные дикие виды относят к группе наиболее древних в систематическом отношении форм картофеля [4]. Считается, что 2 EBN виды произошли от них в результате некой мутации, связанной с изменением EBN без изменения пло-идности [4, 5]. Нами была предложена гипотеза, согласно которой подобная мутация (или мутации) до настоящего времени присутствуют в генофонде 1 EBN видов. Следовательно, в пуле пыльцы образцов 1 EBN видов наряду с обычными, 0,5 EBN пыльцевыми зернами, могут присутствовать отдельные нетипичные 1 EBN пыльцевые зерна [6].
На основании этой гипотезы нами разработаны подходы по вовлечению в селекцию ценного генофонда 1 EBN диплоидных диких видов. Они предполагают использование в качестве вида-посредника дикого диплоидного самосовместимого вида £ verrucosum в скрещиваниях с 1 EBN диплоидными видами картофеля, что дает возможность устранить презиготные барьеры несовместимости (Б. verrucosum не содержит пестичных S-РНКаз), а также дополнительного опыления цветков (через сутки после основного) пыльцой Б. рЬше]а ГуР 3 5 для предотвращения осыпания ма-лосемянных ягод. Реализация данных подходов на практике позволила нам получить большое количество жизнеспособных выполненных семян [7].
Целью настоящей работы была характеристика гибридов между Б. verrucosum и 1 EBN дикими диплоидными видами картофеля для подтверждения гибридности и предварительной оценки их селекционной ценности.
Материалы и методы
В качестве материала использовали ги- цами Б. verrucosum (РГ 190170, Р1 195171, бридные сеянцы, выращенные из семян, по- Р1 195172, Р1 275256, Р1 275257, Р1 310966, лученных в скрещиваниях между 12 образ- РГ 498010, РГ 570643, РГ 570644, РГ 570645,
PI 545745, PI 498060), и образцами диплоидных 1 EBN видов картофеля из Мексики S. pinnatisectum (PI 275231-275236, PI 537023), S. polyadenium (PI 230480, PI 275238, PI 347770, PI 498036), S. bulbocastanum (PI 243505, PI 243506, PI 243512, PI 243513, PI 255516, PI 275191, PI 275192, PI 498011), и Южной Америки: S. commersonii (PI 275168, PI 275169, PI 275265, PI 458319, PI 472844, PI 472845) и S. circaeifolium (PI 498116-PI 498118, PI 545973). Семена образцов диких видов были получены из Национального генного банка по картофелю США - NRSP-6 (в скобках после названий видов приведены регистрационные номера образцов в этом банке).
Семена, полученные в скрещиваниях 2009 г, проращивали в плошках с торфогрунтом в конце апреля-начале мая 2010 г., предварительно замочив на 12 ч в водном растворе гибберел-лина (100 мг/л). Рассаду с 5-6 настоящими листьями высаживали в горшочки с торфогрун-том (1 л), которые размещались на расстоянии 0,3 м друг от друга на участке, расположенном между двумя теплицами, оборудованном устройством для мелкокапельного полива. Учитывали морфологические признаки растений, функциональную фертильность пыльцы, а также способность к клубнеобразованию и массу клубней с растения (если клубнеобра-зование имело место).
Часть сеянцев (11 случайно выбранных до цветения и 4 отобранных по морфологии цветка гибридов S. verrucosum х S. bulbocastanum, всего 15 растений), а также родительские формы (образцы S.verrucosum и S. bulbocastanum) были проанализированы на предмет наличия у них видоспецифических RAPD-маркеров S. bulbocastanum, а также наличие маркера гена Rpi-blb1 устойчивости к фитофторозу S. bulbocastanum.
Выделение и очистку ДНК исследуемых образцов проводили из листьев растений накануне или в фазу цветения с помощью набора реагентов Genomic DNA Purification Kit («Fermentas», Литва) по методике, предложенной производителем. Реакционная смесь для одной ПЦР-реакции при проведении RAPD-анализа в пересчете на 10 мкл содержала: 1 мкл 10х буфера для ПЦР, «DIALAT Ltd» (г. Москва, Россия); 0.2 цМ праймера; 4 mM MgCl2; 0.2 mM каждого dNTP;
1U BioRedTaqpolymerase или BioTaqpolymerase, «DIALAT Ltd» и 20 ng ДНК исследуемого образца. Реакции амплификации осуществляли на автоматическом программируемом тер-моциклере GeneAmp PCR System 2700, «PE Applied Biosystems» (США). Программа для ПЦР-реакции: денатурация - 5 мин при 94 оС; далее 35 циклов по 30 сек при 94 оС, 30 сек при 36 оС и 1мин при 72 оС; финальная элонгация в течение 7 мин при температуре 72 оС. Использовали праймеры 0PA-04, OPA-15, OPA-18, 0PC-06, OPC-19 (Operon Technologies, Alameda, CA), которые, по данным литературы, могут амплифицировать ДНК-маркеры, специфичные для S. bulbocastanum [8]. Длину амплифицированных фрагментов ДНК определяли при помощи стандартного маркера длин фрагментов ДНК 100 bp + 1.5 Kb + 3 Kb (М27) («DIALAT Ltd»). Для горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия брали 7-8 мкл реакционной смеси и 2 мкл 10* бромфенолового-синего. Электрофорез продуктов амплификации проводили в 1*ТАЕ-буфере в течение 1,5-2 ч при напряжении в 80 V и силе тока 6mA.
Для детекции гена Rpi-blb1 устойчивости к фитофторозу S. bulbocastanum использовали SCAR-маркер RGA2 [9]. Состав реакционной смеси: в пересчете объема на 10 мкл: 1 мкл 10 * буфера без MgCl2; 0.4 цМ праймеры (прямой и обратный); 2,5 mM MgCl2; 0.25 mM каждого dNTP; 1U BioRedTaqpolymerase или BioTaqpolymerase («DIALAT Ltd») и 50 ng ДНК исследуемого образца. Программа для ПЦР: начальная денатурация в течение 7 мин при 95 оС; далее 38 циклов по 20 сек при 95 оС, 20 сек. при 68 оС и 2 мин при 72 оС; финальная элонгация в течение 7 мин при температуре 72 оС.
Межвидовые гибриды в 2010 г. скрещивали с диплоидными клонами культурного картофеля. Для этого использовали в качестве опылителей вторичные дигаплоиды S. tuberosum 881-10, 882-5, 883-6, 895-40 (получены на основе дигаплоидов сортов Юбель, Полесский розовый, а также клона A15 S. chacoense), отобранные в ходе специальной селекции по высокой функциональной фертильности пыльцы [10]. Первичные дигаплоиды сорта Carlita (Нидерланды), а также диплоидные селекционные формы 08/18.1, 08/18.2, 08/28.1, 08/28.2,
созданные на основе диплоидных гибридов между дигаплоидами S. tuberosum и аллотетра-плоидными видами S. acaule и S. stoloniferum [11], использовали в качестве материнских форм для опыления пыльцой фертильных межвидовых гибридов. В начале периода скрещиваний 2010 г. были благоприятные условия
для гибридизации: умеренно теплая погода с частыми дождями. Однако затем наступил продолжительный период экстремально высоких температур (более 30 оС), что привело к резкому снижению фертильности опылителей.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ «Statistica».
Результаты и обсуждение
Всхожесть гибридных семян, особенности морфологии гибридныгх сеянцев и родительских видов
Большинство гибридных семян, полученных в
2009 г, обладало высокой выполненностью и жизнеспособностью, их всхожесть составила от 47% у гибридов £ verrucosum х £ ро1усЛтит до 88% у гибридов £ verrucosum х S. pmnatisectum (табл. 1).
Таблица 1
Всхожесть семян, клубнеобразование и фертильность гибридов F1 между 8. verrucosum и 1 EBN дикими видами картофеля (Минск, 2010 г.)
Образование клубней Фертильность
Гибриды Всхожесть семян, % Изучено растений, шт Способность к образованию клубней Масса клубней с растения Изучено растений, шт в 5? © Стерильных и низкофертиль-ных,* % - Н -Я & * н* В* Высокофертиль- ных,***% Завязали ягоды при свободном опылении
S. verrumsum х S. bubocastanum 50,0 24 54,2 2,9 18 7,14 55,6 22,2 22,2 -
S. verrucüsum х S. pinnatisectum 88,1 24 62,5 3,3 23 8,98 34,8 30,4 34,8 58,3
S. verrucüsum х S. polyadenium 46,4 24 83,3 2,9 22 6,06 63,6 0 36,4 -
S. verrucüsum х S. commersonii 68,0 41 41,5 3,4 27 3,43 74,0 11,1 14,9 -
S. verrucüsum х S. citcaeifolium 66,2 14 21,4 0,4 11 7,31 63,7 9,0 27,3 33,3
Итого (средняя) 63,0 127 54,0 3,1 101 6,40 58,4 14,9 26,7 -
* - пыльца не образуется, или ФФП ниже 2,0%; ** - ФФП от 2,1 до 10,0%; *** - ффп более 10%.
Растения родительского вида S. verrucosum в фазу цветения имели высоту 20-40 см. Стебель и черешки листьев с антоциановой окраской. Листьев 2-5, парные, конечная доля несколько крупнее боковых. Венчик колесовидной формы, темно-сине-фиолетовый.
Растения 1EBN дикого вида картофеля X bulbocastanum имели высоту 40-80 см. Листья толстые, цельные, густо опушенные. Венчик звездчатый, глубоко рассеченный, окраска кремовая. Было высеяно 100 семян гибридов X. verrucosum х X. bulbocastanum, взошло
50 (50%). Сеянцы в фазе 5-6 листьев имели более округлую форму листовой пластинки, по сравнению с Б. verrucosum. Они развивались быстрее, чем материнский родительский вид, на всех этапах развития превосходили его по мощности. В открытый грунт были высажены 24 гибридных сеянца. Высота сеянцев в фазу цветения была около 50 см. Пигментация стебля и черешков листьев отсутствовала у 9 сеянцев (37,5%), слабая пигментация была отмечена у
14 растений (58,3%), интенсивная окраска стеблей - у 1 сеянца (4,2%). У 3 растений (12,5%) бутоны осыпались, у остальных 21 (100%) наблюдалось расщепление по окраске цветков: белые цветки были у 2 растений (8,3%), светло-голубые - у 6 растений (25%), голубые - у 8 растений (33,3%), 5 растений (20,8%) имели темно-голубую и синюю окраску венчика. Некоторые гибриды имели звездчатые цветки, как у Б. bulbocastanum (рис. 1).
Рис. 1. Различия в форме и окраске цветка у исходных диких видов и их гибридов
А - Solanum verrucosum, B - межвидовой гибрид S. verrucosum х S. bulbocastanum, С - Solanum bulbocastanum
Растения 1EBN дикого вида картофеля Б. pinnatisectum были 50-60 см высотой. Листья непарноперисторассеченные, доли листа ланцетовидные, узкие. Конечная доля близка по размерам боковым. Листья светло-зеленые, опушение короткое, редкое. Венчик белый, звездчатый. Было высеяно 59 семян гибридов Б. verrucosum х Б. pinnatisectum, взошло 52 (88,14%). В открытый грунт было высажено 24 гибридных сеянца. Высота растений в фазу цветения - около 50 см. Слабая пигментация стебля отмечена у 11 сеянцев (45,83%), у остальных пигментация была выражена более сильно. По окраске цветка растения разделились на две группы по 12 растений (50%) с голубыми и синими цветками.
Растения 1EBN дикого вида картофеля Б. polyadenium были мощные, высотой 80100 см. Листьев 3-5, парные, конечная доля несколько крупнее боковых. Растения густоо-пушенные, с сильным неприятным запахом. Венчик колесовидный, белый. Было высеяно 56 семян, взошло 26, из них 1 растение было альбиносным. По внешнему виду сеянцы были ближе к Б. verrucosum. В открытый грунт было высажено 24 гибридных сеянца. Высота растений в фазу цветения составляла около 40 см, кусты компактные, листовые пластинки более крупные и плотные по сравнению с
Б. verrucosum. Наличие слабой антоциановой окраски стебля отмечено у 4 растений (16,7%), у всех остальных - без окраски. У 2 растений (8,3%) имело место осыпание бутонов, у остальных 21 (100%) наблюдалось расщепление по окраске цветков (все цветы имели колесовидную форму): темно-голубой венчик имели 3 растения (13,6%), голубой и светло-голубой -13 (59%), белый - 6 (27,3%).
Растения 1 EBN дикого вида картофеля Б. commersonii были компактные, розетковидные, высотой до 30 см. Листьев 3-5, непарноперисто-рассеченные, парные. Доли листа овально эллиптические, сидячие, опушенные. Венчик белый, звездчатый. Было высеяно 100 семян гибридов Б. verrucosum х Б. commersonii, взошло 68. Сеянцы были довольно единообразны по внешнему виду, ближе к Б. verrucosum. В открытый грунт был высажен 41 сеянец. У 8 растений (19,5%) отсутствовал пигмент на стебле и черешках листьев, остальные имели антоциановую окраску. У 14 растений (30%) цветы не развились, либо опадали бутоны. Среди остальных 27 (100%) наблюдалось расщепление по окраске цветков: синий венчик имели 13 растений (48%), голубой -11 (40,7%), белый и светло-голубой - 3 (11,3%).
Растения 1EBN дикого вида картофеля Б. circaeifolium были небольшие, до 40 см высотой. Листья простые или непарноперисто-
рассеченные, конечная доля крупнее боковых. Растения неопушенные, светло-зеленого цвета. Листья тонкие, блестящие. Венчик звездчатый, белый. Было высеяно 77 семян гибридов S. verrucosum х S. circaeifolium, взошло 51 (66,23%). Сеянцы в фазе 4-5 листьев отличались сильно рассеченной листовой пластинкой и вытянутым, тонким стеблем (куст не компактный, в отличие от остальных межвидовых гибридов). В открытый грунт было высажено 14 сеянцев. Для всех растений было характерно наличие пигмента на стеблях и черешках листьев. У 1 растения (7,1%) не развились цветы, а еще у 2 (14,3%) интенсивность цветения была очень низкой (единичные цветы). Цветки у всех цветущих растений имели синюю окраску.
Jansky and Hamernik [12] предлагают проводить отбор гибридов между S. verrucosum и 1 EBN видами картофеля на уровне сеянцев по внешнему виду. При этом, по мнению авторов, имеется возможность отсеивать сеянцы материнского родителя S. verrucosum, по-видимому, полученные в результате самоопыления.
В настоящей работе гибридизации обязательно предшествовала кастрация (удаление пыльников) нераскрывшихся бутонов материнских форм. По данным Abdalla and Hermsen [13], у S. verrucosum высвобождение пыльцы происходит только из зрелых пыльников. В связи с этим вероятность нежелательного самоопыления крайне низка. Гибридные сеянцы на ранних стадиях развития по внешнему виду были ближе к S. verrucosum. По интенсивности роста они значительно превосходили родительские формы. На стадии цветения
наблюдалось расщепление по окраске цветка. По данным Kameraz et al. [14], гибриды Fj между S. verrucosum и S. spegazzinii, S. verrucosum и S. chomatophilum по габитусу были ближе к материнской форме, в том числе по окраске цветков (венчик сине-фиолетовый), и лишь в F2 наблюдали расщепление. Следовательно, отсеивание предположительно негибридных форм среди сеянцев S. verrucosum х дикие виды картофеля на основании их морфологии и даже по окраске цветков не всегда может быть оправданным.
RAPD- и SCAR-маркеры у гибридов между S. verrucosum х S. bulbocastanum
Все использованные RAPD-маркеры, за исключением OPA-18, были представлены у образцов мужского родительского вида S. bulbocastanum и отсутствовали у образцов второго родителя S. verrucosum, который выступал в скрещиваниях в качестве материнской формы. В связи с этим для подтверждения гибридности сеянца было достаточным детектировать у него маркер, специфичный для S. bulbocastanum. Из использованных RAPD-маркеров наиболее информативными оказались OPA-15 (590 bp) и OPC-06 (1050 bp), которые были представлены у 7 и 9 гибридов соответственно (рис. 2). При этом нечеткие полосы продуктов ампликафиции второго из названных маркеров были отмечены на электрофореграммах еще у 3 гибридов. В целом, у 13 из 15 проанализированных гибридов имелся хотя бы один из использованных RAPD-маркеров, а у оставшихся двух присутствие маркера OPC-06 было нечетким.
M ЫЬ hl h2 ИЗ h4 h5 h6 K7 Ь8 h9 hlO hll h!2 hl3 hl4 hl5 ver ver
мЩОО
600 * 500
* * *
Рис. 2. RAPD-полиморфизм у родительских видов S. bulbocastanum, S. verrucosum и гибридов между ними при использовании праймера OPA15. 1 - маркер длин фрагментов ДНК; 2 - S. bulbocastanum; 3-18 - гибриды F1 S. verrucosum х S. bulbocastanum; 19 - S. verrucosum. Видоспецифический RAPD-маркер 590 п.н. (отмечен звездочкой) имеется у отцовского родителя S. bulbocastanum и у 7 из 15 изученных гибридов Fj S. verrucosum х S. bulbocastanum. Он отсутствует у материнской родительской формы S. verrucosum
SCAR-маркер RGA2 гена Rpi-blb1 устойчивости к фитофторозу был обнаружен у 6 из 8 образцов S. bulbocastanum, использованных в работе, и не был выявлен у образцов S. verrucosum. Его наличие было установлено у 4 гибридных сеянцев из 15 проанализированных. Интересно, что все эти сеянцы были отобраны в период цветения по окраске венчика (они имели, в отличие от материнской формы S. verrucosum, белые или светло-голубые цветки). Кроме того, у этих четырех гибридов наиболее полно были представлены специфичные для S. bulbocastanum RAPD-маркеры: OPA-04 (600bp) - у двух гибридов (еще у одного нечетко), OPA 15 (590 bp) - у трех гибридов, OPC-06 (1050 bp) и OPC-19 (1250 bp ) - у всех 4-х гибридов.
Использование белковых или ДНК-маркеров для подтверждения гибридности межвидовых гибридов обычно практикуется в тех случаях, когда их происхождение остается неясным (например, при получении гибридов путем слияния протопластов), или когда удается получить единичные гибридные растения в скрещиваниях между практически несовместимыми видами. В настоящей работе было получено очень большое количество гибридных семян и растений в условиях, когда появление негибридных форм было маловероятным. Кроме того, большинство гибридных сеянцев заметно отличалось по морфологии от растений материнских форм S. verrucosum, особенно на стадии цветения. Тем не менее, чтобы окончательно убедиться в гибридности полученных растений, нами был проведен выборочный анализ ДНК сеянцев. Были выбраны гибриды с участием S. bulbocastanum - дикого вида, который имеет наиболее жесткие пре- и постзиготные барьеры несовместимости с дигаплои-дами S. tuberosum [3].
Как видно из приведенных выше результатов, использование даже небольшого количества ДНК-маркеров четко продемонстрировало гибридное происхождение большинства проанализированных гибридов. Особенно это касается сеянцев, заметно отличающихся от материнских форм S. verrucosum по морфологическим признакам.
Показатели мужской фертильности гибридов между S. verrucosum и 1 EBN дикими видами картофеля
Многие из гибридных сеянцев, в отличие от S. verrucosum, сбрасывали бутоны (см. выше), имели стерильную или низкофертильную пыльцу (табл. 1). Особенно много стерильных форм было среди гибридов S. verrucosum х S. commersonii (74%). Функциональная фер-тильность пыльцы гибридов, которые ее образовывали, в целом была невысокой (менее 10%). Тем не менее, среди гибридов с участием всех изученных видов попадались растения с относительно высокой фертильностью пыльцы (ФФП более 10%), которые можно было успешно использовать в скрещиваниях в качестве опылителей. Наибольшее количество мужски фертильных форм отмечено среди гибридов между S. verrucosum и S. polyadenium (36,4%), S. pinnatisectum (34,8%), а также S. circaeifolium (27,3%). Как следствие, гибриды с участием двух последних видов образовывали ягоды при свободном опылении с достаточно высокой частотой (58,3% и 33,3% соответственно).
Мужская стерильность межвидовых гибридов, полученных при использовании S. verrucosum в качестве материнской формы, является их характерной особенностью [13,15]. Полагают, что она является результатом взаимодействия специфического плаз-мона S. verrucosum и определенных плазмон-чувствительных ядерных генов многих видов картофеля. По данным Abdalla and Hermsen [15], такие гены в использованном авторами материале присутствовали в гомозиготном состоянии, поэтому все полученные межвидовые гибриды с S. verrucosum формировали стерильную пыльцу. В настоящем исследовании, несмотря на значительную долю мужски стерильных межвидовых гибридов (особенно среди гибридов с S. commersonii), было достаточно много гибридов с высокой функциональной фертильностью пыльцы (особенно среди гибридов с S. polyadenium и S. pinnatisectum). Мужски фертильные межвидовые гибриды с участием S. verrucosum были получены также Kameraz et al. [14] и Jansky and Hamernik [12]. Очевидно, плазмон-чувствительные ядерные гены могут быть представлены у диких видов не только в гомозиготном, но и гетерозиготном состоянии [16].
Клубнеобразование гибридов между 8. ver-rucosum и 1EBNдикими видами картофеля
Большинство гибридов были не способны к образованию клубней в условиях длинного дня в Беларуси (табл. 1). Особенно много таких форм было среди гибридов Б. verrucosum х Б. circaeifolium (75%). В тех случаях, когда клубни формировались, их было немного (2-5), при этом их масса также была невелика (0,5-1 г). Лучшие по этому показателю сеянцы: №75 Б. verrucosum х Б. commersonii (8 клубней, масса клубня с растения 27,7 г), №61 Б. verrucosumх Б. pinnatisectum (10 клубней, 14,1 г), №13 Б. verrucosumх Б. bulbocastanum (12 клубней, 12,8 г). Было заметно, что в момент уборки (в начале сентября) формирование клубней у гибридов только началось.
Пониженная способность к клубнеобра-зованию изучаемых межвидовых гибридов очевидно является существенным недостатком предложенного метода вовлечения в селекцию ценного генофонда 1 EBN диких диплоидных видов картофеля, так как существенно затрудняет их последующую оценку, гибридизацию с культурным картофелем.
Ягоды, как правило, содержали сравнительно много выполненных семян (среднее количество семян на ягоду - 44,7). Лишь три ягоды, которые завязались на гибридах S. verrucosum х S. pinnatisectum (одна на одном сеянце и две на другом), не содержали выполненных семян. Наиболее высокую скрещиваемость с дигаплоидами S. tuberosum имели гибриды S. verrucosum х S. bulbocastanum (89,3
Скрещиваемость гибридов между S. verrucosum и 1EBN дикими видами картофеля с дигаплоидами S. tuberosum
Успех интрогрессии ценного генофонда 1 EBN видов в селекционный материал определяется не только получением межвидовых гибридов с их участием, но и возможностью их беккроссирова-ния культурным картофелем. В скрещивания в качестве материнских форм были включены преимущественно те гибриды, которые по внешнему виду, окраске и морфологии цветков заметно отличались от родительского вида S. verrucosum. До наступления жаркой погоды удалось опылить смесью пыльцы высоко фертильных дигаплоидов S. tuberosum от 3 (гибриды S. verrucosum х S. commersonii) до 14 (гибриды S. verrucosum х S. polyadenium) сеянцев. Гибриды S. verrucosum х S. circaeifolium цвели скудно и в поздние сроки (после наступления жаркой погоды), поэтому в скрещивания с дигаплоидами S. tuberosum они не были включены. В тех случаях, когда удалось провести скрещивания между гибридами и дигаплоидами S. tuberosum, отмечена высокая завязываемость ягод: от 72,9% у гибридов S. verrucosum х S. polyadenium до 100% у гибридов S. verrucosum х S. bulbocastanum и S. verrucosum х S. commersonii (табл. 2).
семян на опыление). Интересно, что удалось получить семена (от 58 до 462 семян) у всех четырех гибридов, у которых был обнаружен маркер гена Rpi-blb1 устойчивости к фитоф-торозу от S. bulbocastanum.
В общей сложности в результате беккрос-сирования межвидовых гибридов дигаплои-дами S. tuberosum было получено 2818 семян, эффективность гибридизации составила в
Таблица 2
Скрещиваемость с дигаплоидами S. tuberosum гибридов Ft S.verrucosum х 1 EBN дикие
виды картофеля (Минск, 2010)
Гибриды Опылено цветков, шт. Ягод, шт. Завязываемость ягод, % Семян, шт. Семян на ягоду, шт. Семян на опыление, шт.
S.verrucosumх S.bulbocastanum 17 17 100 1518 89,3 89,3
S.verrucosum х S.pinnatisectum 21 19 90,5 403 21,2 19,2
S.verrucosumх S.polyadenium 37 27 73 897 33,2 24,2
Итого 75 63 84 2818 44,7 37,6
среднем 37,6 семян на опыление. У гибридов S. verrucosum х S. commersonii в результате опыления 9 цветков завязалось 9 полновесных ягод, однако они были утрачены в процессе уборки, поэтому количество содержащихся в них семян не было определено.
Использование в скрещиваниях с дигапло-идами S. tuberosum межвидовых гибридов с высокой ФФП оказалось мало результативным. В общей сложности было опылено 173 цветка. Завязалось три ягоды от опыления 4 цветков диплоидной селекционной формы 08/18.2 (сложный гибрид между дигаплоида-ми S. tuberosum и аллотетраплоидными видами S. acaule и S. stoloniferum) и одним из гибридов S. verrucosum х S.pinnatisectum. В ягодах оказалось 26 выполненных семян (6,5 семян на опыление). Очевидно, неудача этих скрещиваний обусловлена явлением односторонней несовместимости, характерным
для скрещиваний между самосовместимым видом S. verrucosum и самонесовместимыми диплоидными видами картофеля [17].
Таким образом, нами были получены ягоды и семена при опылении смесью пыльцы дига-плоидов S. tuberosum всех межвидовых гибридов, за исключением гибридов S. verrucosum х S. circaeifolium, которые не успели зацвести до наступления жары. Практически во всех случаях ягоды содержали выполненные семена. То есть, межвидовые гибриды, использованные в скрещиваниях в качестве материнских форм, имели 2 EBN. Лишь два сеянца S. verrucosum х S. pinnatisectum завязали при опылении пыльцой дигаплоидов S. tuberosum ягоды, не содержащие семян. По-видимому, эти сеянцы являются редкими inter-EBN формами, или несут какие-либо генетические факторы, связанные с нарушением развития эндосперма.
Заключение
Семена, полученные в результате гибридизации между 2 EBN самосовместимым видом картофеля S. verrucosum и 1 EBN диплоидными видами S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. polyadenium, S. commersonii и S. circaeifolium, обладали высокой выполненностью и жизнеспособностью, их всхожесть составила от 47% до 88%. Гибридные сеянцы на ранних стадиях развития по внешнему виду были ближе к S. verrucosum. По интенсивности роста они значительно превосходили родительские формы. На стадии цветения наблюдалось расщепление по окраске цветка и функциональной фертильности пыльцы. Гибридность сеянцев S. verrucosumх S. bulbocastanum подтверждена с помощью RAPD-анализа, несколько гибридов имели ДНК маркер гена устойчивости к фитофторозу Rpi-blb1, который считается геном длительного действия, эффективного против широкого круга рас патогена. Для межвидовых гибридов, как и родительских видов, была характерна пониженная способность
к клубнеобразованию в условиях Беларуси. Большинство сеянцев межвидовых гибридов, в отличие от S. verrucosum, имели стерильную пыльцу, однако часть из них была достаточно фертильна, чтобы их можно было использовать в скрещиваниях в качестве опылителей. Были получены ягоды и семена при опылении смесью пыльцы дигаплоидов S. tuberosum всех межвидовых гибридов, за исключением гибридов S. verrucosum х S. circaeifolium. Практически во всех случаях ягоды содержали выполненные семена. То есть, межвидовые гибриды, которые использовали в скрещиваниях в качестве материнских форм, имели 2 EBN. Обратные скрещивания с участием мужски фертильных гибридов оказались мало результативными. Полученные межвидовые гибриды и их беккроссное потомство представляют значительный интерес для селекции, поскольку с их помощью можно интрогрессировать в селекционный материал ряд ценных генов 1 EBN диких диплоидных видов картофеля.
Список использованных источников
1. Peloquin, S.J. Potato breeding with haploids and 2. Jansky, S.H. Use of potato haploids to 2n gametes // S.J. Peloquin, G.L. Yerk, J.E. Werner, put 2x wild species germplasm in usable form / E. Darmo // Genome. - 1989. - Vol. 31. - P. 1000-1004. S.H. Jansky, S.J. Peloquin, G.L Yerk // Plant
Breeding. - 1990. - Vol. 104. - P. 290-294.
3. Маханько, О.В. Межвидовая несовместимость в диплоидной селекции картофеля / О.В. Маханько // Земляробства i ахова раслш. - 2008. - №1. - С. 11-14.
4. Hawkes, J.G. Taxonomic and evolutionary implications of the endosperm balance number hypothesis in potatoes / J.G. Hawkes, M.T. Jackson // Theor Appl Genet. - 1992. -Vol. 84. - P. 180-185.
5. Johnston, S.A. Support of the endosperm balance number hypothesis utilizing some tuber-bearing Solanum species / S.A. Johnston, R.E. Jr. Hanneman // Am Potato J. - 1980. - Vol. 57. - P. 7-14.
6. Yermishin, A.P. A new look at the problem of inter-EBN interspecific crosses in potato / A.P. Yermishin [et al.] // In: 18th Triennial Conference of the European Association for Potato Research. Ed. by J. Santala and J.P.T. Valkonen. - Oulu, Finland. - 2011 - P. 71.
7. Полюхович, Ю.В. Эффективность гибридизации между Solanum verrucosum Schlechtd. и 1EBN дикими диплоидными видами картофеля с использованием приема доопыления цветков пыльцой S. Phureja IVP 35 / Ю.В. Полюхович [и др.] // Доклады Национальной академии наук Беларуси. -2011. - Т. 55, №3. - С. 92-96.
8. Naess, S.K. Analysis of the introgression of Solanum bulbocastanum DNA into potato breeding lines / S.K. Naess [et al.] // Mol. Genet. Genomics. - 2001. - Vol. 265.- P. 694-704.
9. DNA markers for potato introgression breeding / M.P. Beketova [et al] // In: Potato production and innovative technologies. / Ed. by A.J. Haverkort and B. Anisimov. - Wageningen, 2007. - P. 397-405.
10. Лукша, В.И Результаты отбора по признаку «высокая функциональная фертильность пыльцы» и ряду селекционно-важных
показателей в популяциях вторичных дига-плоидов Solanum tuberosum L. / В.И. Лукша // Картофелеводство. - Минск, 2010. - Т. 17. -С.137-148.
11. Воронкова, Е.В. Диплоидные гибриды между аллотетраплоидными дикими видами картофеля Solanum acaule Bitt., Solanum stoloniferum Schltdl. и дигаплоидами Solanum tuberosum L. / Е.В. Воронкова [и др.] // Генетика. - 2007. - Т. 43, №8. - С. 882-890.
12. Jansky, S.H. The Use of Solanum verrucosum as a Bridge Species / S.H. Jansky, A.J Hamernik // Genetic Resources and Crop Evolution. - 2009. - Vol. 56, №28. - P. 1107-1116.
13. Abdalla, M.M.F. An evaluation of Sola-num verrucosum Schlechtd. for its possible use in potato breeding / M.M.F. Abdalla, J.G.Th. Hermsen // Euphytica. - 1973. -Vol. 22. - P. 19-27.
14. Камераз, А.Я. Межвидовая гибридизация картофеля с участием дикорастущего диплоидного вида S.verrucosum Schlechtd. / А.Я Камераз [и др.] // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 1982. -Т. 73. - №2. - С. 56-65.
15. Abdalla,M.M.F.Unilateralincompatibility: hypotheses, debate and its implications for plant breeding / M.M.F. Abdalla, J.G.Th. Hermsen // Euphytica. - 1972. - Vol. 21. - P. 32-47.
16. Лукша, В.И., Савчук, А.В., Воронкова, Е.В., Ермишин, А.П. Генно-цитоплазматическая мужская стерильность гибридов между дигаплоидами Solanum tuberosum и диплоидными видами картофеля / В.И. Лукша [и др.] // Вести НАН Беларуси, сер. биол. наук. - 2010. - №4. - С. 65-70.
17. Grun, P. The inheritance and expression of unilateral incompatibility in Solanum / P. Grun, M. Aubertin // Heredity. - 1966. -Vol. 21. - P. 131-138.
Дата поступления статьи 1 ноября 2011 г.
