CC BY
36
УДК 617.7
показатели цитокинового профиля у пациентов с увеитами вак . 07
ГРНТИ 76.29.56
пациенюв с /веи^ами
при оппортунистических инфекциях
© О. И. Лебедев, А. В. Суров, Е. В. Молчанова
ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия»
О С целью выбора тактики ведения пациентов с инфекционными увеитами необходимо установление фазы инфекционного процесса и оценка адекватности иммунного ответа макроорганизма на воздействие патогенов. Проведено клинико-лабораторное обследование 65 пациентов с увеитами. В зависимости от состояния фазы исследуемой инфекции сформировано 3 группы больных с последующим изучением цитокинового профиля в каждой и в сравнении с группой контроля. Нами установлено, что у пациентов с увеитами в острую фазу течения инфекции активно вырабатываются провоспалительные цитокины, а при обострении хронически протекающей инфекции (микст-инфекции) происходит значительное угнетение синтеза преимущественно провоспалительных и нарастание противовоспалительных цитокинов.
О Ключевые слова: оппортунистические инфекции; увеит; цитокиновый профиль.
введение
В последние десятилетия отмечается повсеместный рост иммунодефицитных состояний в популяции. Вторичные иммунодефицитные состояния (ВИДС) могут быть вызваны разнообразными причинами — стресс, пожилой возраст, патологическими процессами инфекционной и неинфекционной этиологии, экологическими и социальными факторами и т. д. В этой связи ВИДС стали важнейшей проблемой здравоохранения во всем мире, поскольку иммунологическая недостаточность является причиной развития многих патологических процессов.
В этих условиях некоторые заболевания (герпетическая и цитомегаловирусная инфекции, инфекционный мононуклеоз, токсоплазмоз и др.) стали протекать тяжелее, все чаще стали регистрироваться атипичные и хронические формы, не поддающиеся стандартной противовирусной и противобактериаль-ной терапии [2]. В связи с этим, для выбора тактики ведения пациента и проведения адекватной терапии принципиально важной стала необходимость установления фазы инфекционного процесса и оценка адекватности иммунного ответа макроорганизма на воздействие патогенов, обладающих сильноимму-ногенными или слабоиммуногенными антигенными свойствами.
Известно, что оппортунистические инфекции (цитомегаловирусная инфекция — ЦМВИ [6], герпетическая инфекция, вызываемая вирусами простого герпеса 1 и 2 типов [5], инфекционный мононуклеоз, токсоплазмоз [4], кандидоз и др.) являются частой
причиной развития воспалительного процесса в органе зрения и обладают слабоиммуногенными свойствами [2].
Иммуноофтальмология, формируя представление
о состоянии иммуно-реактивности глаза, также обращает внимание на проблему иммунодефицитов. Так, например, использование кластерного анализа для всего массива данных, отражающих иммунный статус, в исследованиях Н. Е. Шевчук (2001) [3] позволило определить два основных типа иммунного ответа при герпесвирусной инфекции глаз. При первом типе иммунного ответа в 57 % случаев находили повышение уровней интерлейкина 1р (^-1р) и фактора некроза опухоли (Т№-а), без значимых изменений субпопуляций Т-лимфоцитов. Второй тип иммунного ответа соответствовал тяжелому течению офтальмогерпеса и наблюдался в 43 % случаев согласно данным автора. При таком типе определяется значительное снижение числа Т-хелперов, значения иммунорегуляторного индекса, увеличение числа CD95-клеток, экспрессирующих рецептор апопто-за, а также выраженное повышение уровня ^-1р, Т№-а, интерлейкина 6 (^-6). Повышенный уровень провоспалительных цитокинов ^-1р и TNF-a в данном случае, как считают исследователи, характеризует скорее повреждающую, чем защитную реакцию организма [3].
При токсоплазменной инфекции уничтожение внутриклеточных форм токсоплазм происходит при адекватной продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов на системном и локальном уровнях, а также продукции интерферона-у
(IFN-y). У иммунокомпрометированных пациентов снижается способность Т-хелперов (CD4 + ) продуцировать лимфокины и активировать макрофаги, отмечается неадекватный ответ со стороны цито-киновой системы, снижается продукция IFN-y. Это формирует слабый гуморальный ответ на возбудителя, несмотря на поликлональную гипергаммаглобу-линемию и создает благоприятные условия для размножения токсоплазм [2].
В связи с этим, при увеитах и их рецидивирующих формах, этиологически связанных с оппортунистическими инфекциями, определение изменений показателей цитокинового профиля поможет установить фазу инфекционного процесса, что в свою очередь позволяет провести адекватную иммунокоррекцию с целью предупреждения обострения инфекции и профилактики рецидива увеита.
материал и методы
На базе БУЗ ООО «Клиническая офтальмологическая больница им. В. П. Выходцева» и ЦНИЛ Омской государственной медицинской академии проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 65 пациентов, проходивших стационарное лечение по поводу увеита, с первичным эпизодом или рецидивами увеита, из которых 29 пациентов страдали фибринозным иридоцикли-том, 18 пациентов — периферическим увеитом и 18 пациентов — хориоретинитом. Среди обследованных было 32 мужчины (49,2 %) и 33 женщины (50,8 %). Первая атака увеита выявлена у 43 пациентов (66,2 %), рецидив увеита — у 22 пациентов (33,8 %). Все обследованные были в возрасте от 18 до 50 лет. Средний возраст составил 35 ± 7,4 года.
С целью подтверждения этиологии заболевания глаз использовали реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), которая проводилась с использованием диагностических препаратов на основе моноклональных антител (фирмы «Vircell», Испания), специфичных к антигену вируса простого герпеса (ВПГ), а также антител, специфичных к сверхраннему и раннему белку цитомегаловируса (ЦМВ) рр 65 и р72 к ЦМВ.
При установлении клинико-лабораторных параллелей между клиническими проявлениями увеита, выявленной активностью герпесвирусов методом РИФ в соскобе конъюнктивы и иммунореактивностью макроорганизма к ВПГ, ЦМВ и Toxoplasma gondii (как к частой сопутствующей инфекции [2]) дополнительно исследовали сыворотку крови методом иммуноблотинга (westernblot, recomLine).
С целью диагностики ЦМВИ применяли наборы «Anti-CMV-Westernblot» фирмы «Euroimmun» (Германия), основанный на определении антител класса ^М, IgG к высокоспецифичным (рр130, рр28), низкоспецифичным (р55, рр52, р38) и неспецифичным (р65) антигенам ЦМВ.
С целью оценки специфического ответа к ВПГ 1-го и 2-го типов использовался набор «Anti-HSV-1/ HSV-2 Euroline-WB (IgM, IgG)» (Германия), заключающийся в определении антител (IgM, IgG) к комплексному антигену ВПГ 1-го типа и специфическому гликопротеину G-2 ВПГ 2-го типа (gG-1, gB-2, gD-1, gD-2) в сыворотке или плазме крови человека.
Методом recomLine («Microgen», ЗАО «Агрос-интернешнл», Россия) проводили стриповое иммунологическое исследование с рекомбинантными антигенами ROP1, MAG1, SAG1, GRA7, GRA8 для детекции IgM, IgG к Toxoplasma gondii.
По результатам обследования методом РИФ со-скоба конъюнктивы и иммуноблота (westernblot, recomLine) с исследованием сыворотки крови сформировано 3 группы: I группа — пациенты с остро протекающей инфекцией (одна или микст-формы),
II группа — пациенты с хронической инфекцией в стадии обострения (одна или микст-формы) ,
III группа — с хроническим инфицированием или без признаков инфекции.
Оценку функционального состояния иммунных клеток проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) по определению сывороточных концентраций интерлейкинов (IL)-1p, -2, -4, -6, -8, -1Ra; фактора некроза опухоли-а (TNF-а); интерферона-у (IFN-y) на тест-системах производства ООО «Протеиновый контур» и «Цитокин» (Россия).
При оценке состояния системы иммунитета иммунологические показатели сравнивались с показателями контрольной группы, которую составили 30 доноров в возрасте от 18 до 50 лет (средний возраст 26,5 ± 5,4 лет). Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ Statisti -ca 6,0. С учетом небольшого объёма выборок в диагностических группах для их сравнения использовался непараметрический U-критерий Манна-Уитни.
результаты
В результате обследования методом РИФ с исследованием соскоба конъюнктивы у 25 пациентов (38,5 %) обнаруживалась активность герпесвирусов: в 11 случаях — ВПГ (2 + , 3+), в 6 случаях — ЦМВ (2+, 3+), а в 8 случаях — микст-инфекция (ВПГ и ЦМВ).
Методом иммуноблота у 1 пациента выявлена остро протекающая ВПГ-инфекция, у 3 пациен-
Таблица 1
Иммунологические показатели цитокинового профиля у пациентов в группах
Группы Контроль n = 30
Показатель I n = 6 II n = 29 III n = 31
^-1р, пкг/мл *** — ооо 104,95 ± 16,50 *** ### 6,01 ± 1,54 27,31 ± 4,53 22,63 ± 2,S5
^-2, пкг/мл *** “ ооо 76,26 ± 4,S7 *** ### 173,21 ± 21,00 ** 37,34 ± 1,S9 29,31 ± 2,S1
^-4, пкг/мл 5,72 ± 1,19 *** ### 50,4 ± 4,03 13,01 ± 2,57 7,09 ± 1,67
^-6, пкг/мл 7,45 ± 2,1S # 4,63 ± 0,20 4,02 ± 0,1S 4,3 ± 1,74
^-8, пкг/мл ** ооо 60,11 ± 4,S9 *** ### 73,95 ± 5,55 22,50 ± 1,90 20,46 ± 1,51
^-Ща, пкг/мл *** “ ооо 165,S7 ± 11,31 *** ### 273,15 ± 17,71 3SS,S4 ± 16,95 400,52 ± 20,22
TNF-a, пкг/мл *** — ооо 57,91 ± 7,43 ### 1,94 ± 0,44 7,71 ± 1,9S 6,1S ± 1,7
^N-7 нативный, пкг/мл 16,52 ± 2,27 *** ### 42,34 ± 5,47 13,36 ± 1,05 13,21 ± 3,25
^N-7 стим. ФГА, пкг/ мл * “ ооо 25S5,57 ± 162,32 *** ### 307,60 ± 44,60 1109,33 ± 124,69 1494,6S ± 246,50
Примечание: *, **, *** — статистически значимая разница по отношению к контролю (р < 0,05; 0,01; 0,001); статистически зна-
чимая разница различии между группами: , , — 0,01; 0,001) по и-критерию. между I и II; о, оо, ооо между — I и III; #, ##, ### - - между II и III (р < 0,05;
тов — токсоплазменная инфекция, у 1 пациента — микст-инфекция (ВПГ и токсоплазменная инфекция) и еще у 1 пациента — остро протекающая ЦМВИ. В 2 случаях определялось обострение только ВПГ-инфекции, а в 27 случаях — нескольких видов инфекций (микст-формы). У 31 пациента активности данных инфекций не выявлено.
Результаты исследования цитокинового профиля у пациентов с увеитами в группах представлены в таблице 1.
обсуждеиие
Исследования показали, что во II группе уровень ^-4 превышал аналогичный показатель контрольной группы в 7,1 раза (и; р < 0,001) при одновременном повышении содержания нативного ^N-7 в 3,2 раза (и; р < 0,001) и снижении в 4,9 раза (и; р < 0,001) концентрации стимулированного №N-7. Такая дискордантность изменений, скорее всего свидетельствует о падении функциональной активности секретирующих ^N-7 Т-лимфоцитов 1 типа как в результате прямого ингибирующего действия ^-4, так и в результате истощения функциональных резервов синтеза вследствие увеличения антигенной нагрузки. Об уменьшении функциональной способ-
ности к синтезу адекватных антигенной нагрузке количеств ^N-7 также свидетельствует сниженная на 25 % в III группе по сравнению с контролем продукция стимулированного №N-7. В то же время у лиц из
I группы уровень стимулированного ^N-7 превышал контроль в 1,7 раза (и; р < 0,001), что свидетельствовало об активации ^^7—продуцирующих клеток в ответ на внедрение инфекционного агента с развитием реакций преимущественно Т-хелперов 1-го типа (ТЫ), препятствующих выраженному повреждающему действию патогена на макроорганизм.
Во всех анализируемых группах отмечалось конкордантное увеличение концентрации ^-2: его уровень по сравнению с контролем был выше в
I группе — в 2,7 раза (и; р < 0,001), во II группе — в 6,0 раз (и; р < 0,001), в III группе — в 1,3 раза (и; р < 0,01). Увеличение данного показателя отражало степень активации антигенами инфекционного агента Т-хелперных клеток — основных продуцентов ^-2, мишенями которого являются ТЫ, цито-токсические Т-клетки, В-клетки, натуральные киллеры ^К) и макрофаги, играющие ведущую роль в развитии нестерильного иммунитета на любой стадии течения оппортунистической инфекции (микст-формы).
Уровень IL-1 р и TNF-a в I группе достоверно превышали контроль в 4,7 раза (U; р < 0,001) и 9,4 раза (U; р < 0,001) соответственно. Учитывая, что данные цитокины участвуют в запуске местной и системной воспалительной реакции, активируют Т-, В-, NK-клетки, полиморфноядерные лейкоциты, а также играют значительную роль в координации воспалительного ответа и запуске ци-токинового каскада, являясь индуктором для синтеза других цитокинов [1], гиперпродукция IL-1Р и TNF-a в остром периоде инфекции, по нашему мнению, имеет положительное значение, инициируя и направляя реакции всех звеньев иммунитета в сторону элиминации возбудителя. В то же время, снижение уровней TNF-a в 3,2 раза и IL-1 р в 3,8 раза (U; р < 0,001) во II группе по сравнению с контролем можно расценить как неадекватную реакцию иммунной системы на повышенную антигенную нагрузку с истощением ее резервов, сопровождающуюся как снижением количества иммуно-компетентных клеток, продуцирующих цитокины, так и падением их функциональной активности, что в условиях реактивации латентно протекающей оппортунистической инфекции играет отрицательную роль, способствуя сдвигу равновесия в сторону развития ответа по Th2 пути.
Продукция IL-1Ra, ограничивающего эффекты IL-1 р и являющегося естественным противовоспалительным агентом, не соответствовала повышенной (в I группе) и пониженной (во II группе) концентрации сывороточного IL-1 р и была достоверно ниже контрольной: в 2,4 раза (U; р < 0,001) и в 1,5 раза (U; р < 0,001) соответственно. Учитывая важную роль in vivo баланса между IL-1 и IL-1Ra в защите организма от инфекций, в том числе и от внутриклеточных патогенов [1], по нашему мнению, такое уменьшение продукции IL-1Ra может являться с одной стороны причиной истощения синтеза IL-1 р, а с другой — способствовать поддержанию и распространению воспалительного процесса в органах и тканях, поражённых одной или несколькими из исследуемых инфекций.
Статистически значимое увеличение концентрации IL-8, основной функцией которого является усиление хемотаксиса лейкоцитов, в I и II группах в 2,9 раза (U; р < 0,01) и 3,6 раза (U; р < 0,001) соответственно по сравнению с контрольными значениями, отражает повышенную интенсивность реакций внеклеточного цитолиза.
выводы
Таким образом, рассматривая отклонения иммунной системы в показателях цитокинового профиля
у пациентов с увеитами различной локализации и объединенных в группы с учетом активности разных видов оппортунистических инфекций, можно сделать несколько выводов:
1. У пациентов с увеитами, протекающими на фоне оппортунистических инфекций, преобладают рецидивирующие микст-формы инфекционного процесса.
2. В острую фазу течения инфекции значительно увеличен синтез провоспалительных цитокинов, что обусловлено прямым цитотоксическим действием антигенов на ткани макрорганизма, в том числе и органа зрения.
3. При рецидивирующей форме инфекции (микст-инфекции) наблюдается угнетение синтеза преимущественно провоспалительных цитокинов и нарастанием противовоспалительных, что может в дальнейшем привести к развитию аутоиммунного характера воспаления органа зрения, а антигены возбудителя будут выступать в данном случае как триггер-факторы.
список литературы
1. Демьянов А. В., Котов А. Ю., Симбирцев А. С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление. — 2003. — № 3. — С. 20-35.
2. Долгих Т. И. Современные возможности лабораторной диагностики инфекционных заболеваний (методы, алгоритмы, интерпретация результатов): Пособие для врачей. — Омск, 2005. — 40 с.
3. Шевчук Н. Е. Особенности иммунного ответа при вирусных и хла-мидийной офтальмоинфекциях: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. — Уфа, 2002. — 22 с.
4. Macarie S, Hulpu§ A, Rusu I. Toxoplasmic central chorioretinitis // Oftalmologia. — 2010. — Vol. 54, № 2. — Р. 71-74.
5. Pleyer U., Winterhalter S. Diagnostic and therapeutic aspects of herpes virus associated uveitis // Klin. Monbl. Augenheilkd.—2010. — Vol. 227, № 5. — P. 407-412.
6. Yoganathan K. Cystoid macular edema secondary to immune recovery uveitis in a man with cytomegalovirus retinitis and AIDS // Clin Ophthalmol. — 2010. — Vol. 5, № 4. — Р. 1065-1067.
indicators of a cytokine profile in patients with uveitis at opportunistic infections
Lebedev O. I., Surov A. V., Molchanova E. V.
G Summary. To choose the proper management for patients with infectious uveitis, it is necessary to specify the infectious process phase, and to evaluate the adequacy of the microorganism’s immune response to pathogen action. A clinical and laboratory analysis of 65 patients with
uveitis was carried out. Depending on the investigated infection phase, 3 groups were formed, with subsequent cytokine profile analysis in every group and in comparison with control group. We established that in patients with uveitis, during acute infection phase, pro-inflammatory cytokines are actively produced, and at an exacerbation of a chronic infection (mixt-infection), there is a considerable synthesis depression of mainly pro-inflammatory cytokines and an anti-inflammatory cytokines increase.
G Key words: opportunistic infections; uveitis; cytokine profile.
Сведения об авторах:___________________________________________
Лебедев Олег Иванович — д. м. н., профессор, заведующий кафедрой офтальмологии.
ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия». 644034, г. Омск, ул. Ленина, 12, кафедра офтальмологии.
E-mail: leo.55@mail.ru.
Суров Александр Владимирович — доцент кафедры офтальмологии, к. м. н.
ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия». 644034, г. Омск, ул. Ленина, 12, кафедра офтальмологии.
E-mail: abc55.79@mail.ru.
Молчанова Евгения Владимировна — к. м. н., ассистент кафедры офтальмологии.
ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия». 644034, г. Омск, ул. Ленина, 12, кафедра офтальмологии.
E-mail: molchanovaev@mail.ru.
Lebedev Oleg Ivanovich — managing ophthalmology chair, the professor, the doctor of medical sciences.
GOU VPO «Omsk state medical academy».
644034 Omsk, Lenin’s street, 12. Chair of ophthalmology. E-mail: leo.55@mail.ru.
Surov Alexandr Vladimirovich — the senior lecturer of chair of ophthalmology, the candidate of medical sciences.
GOU VPO «Omsk state medical academy».
644034 Omsk, Lenin’s street, 12. Chair of ophthalmology. E-mail: abc55.79@mail.ru.
Molchanova Evgenia Vladimirovna — the assistant to chair of ophthalmology, the candidate of medical sciences.
GOU VPO «Omsk state medical academy».
644034 Omsk, Lenin’s street, 12. Chair of ophthalmology. E-mail: molchanovaev@mail.ru.
