Показатели системы оксида азота и морфофункционального состояния печени при экспериментальном циррозе

Олещук Александра Михайловна; Миколенко Анна Захаровна; Трач-Росоловская Светлана Василиевна

№ 2 - 2013 г.

14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 616.36-004:546.172.6]-092

ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ОКСИДА

АЗОТА

И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЦИРРОЗЕ

А. М. Олещук, А. З. Миколенко, С. В. Трач-Росоловская

ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского» МЗ Украины (г. Тернополь, Украина)

Результаты представленных экспериментальных исследований показали, что в патогенезе цирроза печени важное значение имеет снижение экспрессии эндотелиальной NO-синтазы и нарастание индуцибельной формы фермента, что приводит к повышению образования стабильного метаболита оксида азота нитрит-аниона в крови и его уменьшению в печени. Установлено, что при этом заболевании активируются процессы цитолиза и холестаза с ростом содержания компонентов желчи в крови, нарушается баланс прооксиданты-антиоксиданты, уменьшается активность митохондриальных и микросомальных ферментов, нарастает концентрация провоспалительных цитокинов. Развитие у подопытных животных сформированного цирроза подтверждено морфологически.

Ключевые слова: печень, крысы, экспериментальный цирроз, оксид азота.

Олещук Александра Михайловна — доцент кафедры фармакологии с клинической фармакологией ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского» г. Тернополь, Украина, рабочий телефон: 308352 523987, e-mail: oleksandrao@ukr.net

Миколенко Анна Захаровна — ассистент кафедры патологической анатомии c секционным курсом и судебной медицины ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского» г. Тернополь, Украина, рабочий телефон: 308352 525844, e-mail: mykolenko@tdmu.edu.te.ua

Трач-Росоловская Светлана Василиевна — ассистент кафедры патологической анатомии c секционным курсом и судебной медицины ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского» г. Тернополь, Украина, рабочий телефон: 308352 525844, e-mail: trachros@tdmu.edu.te.ua

Введение. Циррозы печени различной этиологии — это широко распространенные и прогностически крайне неблагоприятные заболевания, количество которых постоянно

увеличивается [1]. Морфологически этот патологический процесс характеризуется разрастанием соединительной ткани, перестройкой сосудистого русла паренхимы, гибелью значительной части гепатоцитов.

В патогенезе цирроза печени большое значение имеет развитие оксидативного стресса. Известно, что при этом заболевании возникает гиперпродукция активных форм кислорода: супероксидных, пероксидных и гидропероксидных радикалов, оксида азота (NO) [4]. Последний играет ведущую роль в нарушении системной гемодинамики и формировании портальной гипертензии при циррозе [6].

Целью нашего исследования было изучение состояния печени и показателей системы оксида азота, липопероксидации, детоксикации, митохондиального дыхания, уровня провоспалительных цитокинов при экспериментальном циррозе печени, вызванном длительным введением тетрахлорметана.

Материалы и методы.Исследования проводились на 24-х белых крысах-самцах массой 170-210 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Эксперименты выполнены в соответствии с положением «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (г. Страсбург, 1986). Цирроз печени был смоделирован по методике, описанной S. Kurabe et al. (1991) [3]. 50 % раствор тетрахлорметана вводили перорально дважды в неделю в течение 3-х месяцев из расчета 2 мл на 1 кг массы животного. В гомогенатах печени определяли содержание ТБК-активных продуктов (ТБК), гидроперекисей липидов (ГПЛ), количество восстановленного глутатиона (GSH), стабильных метаболитов NO — NO2- и NO3-, молочной (лактат) и пировиноградной кислот (пируват), активность супероксиддисмутазы (СОД) [13], каталазы (КАТ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), цитохромоксидазы (ЦХО), N-деметилазную и р-гидроксилазную активность микросом. В сыворотке крови определяли активность АлАТ, АсАТ, щелочной фосфатазы (ЩФ) (стандартные наборы реактивов «Фелисит-диагностика»), каталазы, количество ТБК-активных продуктов, церулоплазмина, стабильных метаболитов NO: NO2- и NO3- [5], мочевины (стандартный набор реактивов «Фелисит-диагностика»), молекул средней массы МСМ1, МСМ2. Иммуноферментным методом (ИФА) с помощью тест-систем USCN Life Science Inc. в гепатоцитах и сыворотке определяли экспрессию эндотелиальной (eNOS) и индуцибельной (iNOS) NO-синтазы. Методом ИФА с помощью адаптированных к виду подопытных животных тест-систем фирмы USCN Life Science Inc. в сыворотке крови крыс определяли уровень провоспалительных цитокинов: интерлейкина-1Р (IL-1P), интерлейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухолей-а (TNF-а). Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью Origin 7.5 (OriginLab Corp., США) и Microsoft Excel XP. Сравнение полученных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента и методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Изменения считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что при экспериментальном циррозе печени, вызванном длительным введением тетрахлорметана, в сыворотке крови наблюдается рост активности ферментов, которые являются маркерами поражения печени. Установлено, что активность АлАТ, АсАТ, ЩФ превышала показатели контрольной группы животных в 3,4; 2,9 и 1,3 раза соответственно, что свидетельствует о развитии гепатопатии с проявлениями цитолиза и холестаза. Содержание мочевины в сыворотке крови снижалось на 33,3 %, что указывает на нарушение аргиназного синтеза мочевины в печени при данном типе поражения органа [5]. Содержание компонентов желчи в крови возрастало. Так, концентрация билирубина, холестерина и желчных кислот превышала показатели контроля при циррозе в 1,8; 2,1

и 1,3 раза. Установлено, что при этих патологических условиях отмечается активация процессов липопероксидации, о чем свидетельствовало нарастание в пораженном органе и крови содержания ТБК-активных продуктов (на 56,1 и 94,1 % соответственно) и ГПЛ в печени (на 94,1 %). Одновременно отмечалось снижение активности антиоксидантных ферментов в печени, а именно СОД — на 37,3 % и КАТ — на 48,7 %. Активность последнего в сыворотке крови достоверно возрастала на 50,9 %, что свидетельствует о выходе внутриклеточного фермента во внеклеточное пространство в условиях активного цитолиза. Сывороточный уровень церулоплазмина снижался на 18,6 %, что указывает на подавление синтеза этого медьсодержащего антиоксидантного белка в печени. Содержание GSH в пораженном органе в этой серии эксперимента снизилось на 40,4 % по сравнению с контрольным показателем.

Активность митохондриальных ферментов СДГ и ЦХО снижалась (на 24,0 и 28,9 % соответственно) по сравнению с интактными животными, что свидетельствует о нарушении процессов энергообеспечения гепатоцитов при этом патологическом состоянии. Концентрация молочной кислоты в группе животных с циррозом возрастала на 24,2 %, а пировиноградной — снижалась на 52,0 %, что привело к нарастанию в 2,6 раза соотношения лактат/пируват. Это указывает на нарушение углеводного обмена и активацию анаэробного гликолиза при циррозе. О значительном угнетении процессов детоксикации в печени свидетельствовало снижение скорости процессов N-деметилирования и р-гидроксилирования (на 44,0 и 42,0 % соответственно). Нарастание явлений эндотоксикоза подтверждалось достоверным увеличением уровня обеих фракций молекул средней массы в сыворотке крови: МСМ1 (до 0,71 ± 0,02) у.е. и МСМ2 (до 0,57 ±

0,02) у.е. по отношению к их уровню у особей контрольной группы — (0,42 ± 0,01) и (0,27 ± 0,01) у.е. соответственно.

Все вышеуказанные изменения происходили на фоне уменьшения содержания нитрит аниона в печени на 24,9 % и его нарастания в 3 раза в сыворотке крови. Уровень NO3-в крови возрастал на 23,5 %, а в печени не менялся относительно контроля. Методом ИФА установлено, что содержание эндотелиальной формы NO-синтазы в печени и крови снижалось на 38,8 и 58,6 %, а индуцибельной формы фермента NOS возрастало в 2,5 и 4,1 раза соответственно. Активация iNOS может быть вызвана ростом продукции провоспалительных цитокинов IL-1P, IL-6 и TNFa, уровень которых при циррозе превышал контрольные показатели в 4,0; 4,1 и 5,8 раза (рис. 1).

IL-lbeta IL-6 TN F-alfa

Рис. 1. Изменения уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови при циррозе

печени

(* — достоверность относительно контроля)

Полученные нами результаты согласуются с данными А. I. Sarela и соавт. (1999), которые установили существенное снижение активности еNOS у больных с циррозом печени, которым проводили трансплантацию органа. Рост уровня N02" и N03" в сыворотке крови, который мы получили в наших исследованиях, обусловлен, по нашему мнению, активацией iN0S, экспрессия которой в печени возрастала.

Светооптическое изучение микропрепаратов подтвердило формирование цирроза у животных, которым в течение трех месяцев вводили тетрахлорметан. При гистологическом исследовании ткани печени (рис. 2) выявлено, что структура печеночной дольки была нарушена. Трабекулы гепатоцитов деформированы, синусоидальные пространства — расширены. Гепатоциты печеночных долек были разными по форме, некоторые из них не содержали ядер, в других — ядра были с резко выраженными явлениями апоптоза. Визуализировались также клетки печени с явлениями компенсаторной гипертрофии. Центролобулярно наблюдалась умеренная белковая и пылеобразная жировая дистрофия. Портальные тракты расширялись за счет выраженного склероза и лимфо"гистоцитарной инфильтрации. В них формировались скопления гепатоцитов с разноформными ядрами, что можно расценить как участки компенсаторной регенерации в виде псевдодолек. Стенки сосудов были склерозированы и гиалинизированы.

Рис. 2. Гистологическая структура печеночной дольки при циррозе печени.

Окраска гематоксилином и эозином, х 160

Выводы

1. Развитие цирротического поражения в печени морфологически подтверждено наличием выраженного склероза перипоральных полей и формированием псевдодолек.

2. При экспериментальном циррозе наблюдаются снижение содержания эндотелиальной и нарастание концентрации индуцибельной NO-синтазы, стабильного метаболита оксида азота нитрит-аниона в крови и ее уменьшение в печени.

3. Цирроз печени сопровождается развитием процессов цитолиза и холестаза с ростом содержания компонентов желчи в крови, нарушения синтеза мочевины, активацией процессов липопероксидации и нарушениями ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной системы, уменьшением активности митохондриальных и микросомальных ферментов печени, нарастанием эндотоксикоза и содержания провоспалительных цитокинов в крови.

Список литературы

1. Ткач С. М. Эффективность и безопасность гепатопротекторов с точки зрения доказательной медицины / С. М. Ткач // Здоровье Украины. — 2009. — № 6/1. — С. 7-10.

2. Hepatic and splanchnic nitric oxide activity in patients with cirrhosis / A. I. Sarela, F. M.A. Mihaimeed, J. J. Batten [et al.] // Gut. — 1999. — Vol. 44. — P. 749-753.

3. Kurabe S. Systemic histopathology of rats with CCl4-induced hepatic cirrhosis / S. Kurabe, N. Shimazu, M. Inagaki / Laboratory Animals. — 1991. — Vol. 25. — P. 21-25.

4. Maeda Y. Oxidative stress / Y. Maeda, T. Inoguchi // Nippon Rinsho. — 2010. — Vol. 68, N 5. — P. 814-818.

5. Morris S. M. Regulation of enzymes of the urea cycle and arginine metabolism / S. M. Morris // Annual Review of Nutrition. — 2002. — Vol. 22. — P. 87-105.

6. Valance P. Hyperdynamic circulation in cirrhosis: a role of nitric oxide? / P. Valance,

S. Moncada // Lancet. — 1991. — Vol. 337. — P. 776-778.

INDICATORS OF NITROGEN OXIDE SYSTEM AND LIVER MORPHOFUNCTIONAL STATE AT EXPERIMENTAL CIRRHOSIS

A. M. Oleshchuk, A. Z. Mikolenko, S. V. Trach-Rosolovskaya

SHPE «Ternopil state medical university n. a. I. Y. Gorbachevsky» of Ministry of Health of the

Ukraine (Ternopol, the Ukraine)

Results of the presented pilot studies showed that the decrease in expression of endothelial endothelial NO-synthase and increase of inducible form of enzyme has great importance at nosogenesis cirrhosis that leads to increase in formation of stable metabolite of oxide of nitrogen nitrite-anion in blood and to its reduction in a liver. It is established that at this disease cytolysis and cholestasis processes with growth of the maintenance of bile components in blood are activated, the balance pro-oxidizers antioxidants is broken, activity of mitochondrial and microsomal enzymes decreases, concentration pro-inflammatory cytokines increases. The progress of created cirrhosis at experimental animals is confirmed morphologically.

Keywords: liver, rats, experimental cirrhosis, nitrogen oxide.

About authors:

Oleshchuk Alexandra Mikhaelovna — assistant professor of pharmacology chair with clinical pharmacology «Ternopil state medical university n. a. I. Y. Gorbachevsky» of Ministry of Health of the Ukraine, office phone: 308352 523987, e-mail: oleksandrao@ukr.net

Mikolenko Anna Zakharovna — assistant of pathological anatomy and forensic medicine chair with a section course at «Ternopil state medical university n. a. I. Y. Gorbachevsky» of Ministry of Health of the Ukraine, office phone: 308352 525844, e-mail: mykolenko@tdmu.edu.te.ua

Trach-Rosolovskaya Svetlana Vasiliyevna — assistant of pathological anatomy and forensic medicine chair with a section course at «Ternopil state medical university n. a. I. Y. Gorbachevsky» of Ministry of Health of the Ukraine, office phone: 308352 525844, e-mail: trachros@tdmu.edu.te.ua

List of the Literature:

1. Tkach S. M. Effectiveness and safety of hepatoprotectors from the point of view of evidential medicine / S M. Tkach // Health of Ukraine. — 2009. — № 6/1. — Pro 710.

2. Hepatic and splanchnic nitric oxide activity in patients with cirrhosis / A. I. Sarela, F. M. A. Mihaimeed, J. J. Batten [et al.] // Gut. — 1999. — Vol. 44. — P. 749-753.