CC BY
44
УДК 612
ПОКАЗАТЕЛИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФЕМТОСЕКУНДНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА НАЧАЛЬНОЙ СТАДИИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ
© 2012 Т.В. Абакумова, И.И. Антонеева, С.О. Генинг
Ульяновский государственный университет
Поступила в редакцию 20.11.2012
Для оценки морфофункционального состояния нейтрофильных лейкоцитов использовали периферическую кровь 35 женщин с первичным раком шейки матки Ia стадии. Исследована фагоцитарная активность, уровень миелопероксидазы и катионных белков, жесткость мембраны нейтрофилов периферической крови больных до и после воздействия фемтосекундного лазерного излучения in vitro. Выявлено волнообразное и дозозависимое изменение исследуемых показателей после воздействия плотностью потока энергии - 0,27 Дж/см2 и 0,96 Дж/см2.
Ключевые слова: рак шейки матки, нейтрофильные лейкоциты, фемтосекундное лазерное излучение.
На сегодня показана возможность модуляции иммунных реакций, в частности, функционального состояния нейтрофилов периферической крови (Нф), под влияние лазерного излучения [2]. В литературе представлены результаты изучения влияния на Нф низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) [4, 8]. При этом обнаружены разнонаправленные эффекты. Лазеры с высокоинтенсивным излучением (ВИЛИ), в основном, используют в хирургии. Однако, на сегодня отсутствует адекватное экспериментальное обоснование применяемых доз воздействия ВИЛИ. Особый интерес представляют высокоинтенсивные фемтосекундные лазеры, преимуществами которых являются малая длительность импульса, высокая пиковая и малая средняя мощности.
Рак шейки матки (РШМ) занимает в мире первое место среди всех злокачественных новообразований женских половых органов [1]. Изучение возможностей модуляции иммунных реакций организма на различных клинических стадиях заболевания позволит разработать эффективные схемы иммунотерапии.
В соответствии с вышеизложенным, целью исследования было изучение морфофункцио-нального состояния Нф больных на начальной стадии РШМ после фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ).
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились Нф периферической
Абакумова Татьяна Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии и патофизиологии. E-mail: taty-abakumova@yandex.ru.
Антонеева Инна Ивановна, доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии и лучевой диагностики. E-mail: Naum-53@yandex.ru. Генинг Снежанна Олеговна, студентка.
крови 35 первичных больных (28—45 лет) на начальной стадии РШМ (1а стадии заболевания по FIGO). Контрольную группу составили практически здоровые женщины (n=35) в возрасте 1845 лет.
Нф, выделенные из венозной крови на двойном слое фиколла/урографина (1,117 и 1,077 г/ см3), облучали в пластиковых кюветах высотой 1 см интенсивностью - 4,5 мВт/см2 и 1,6 мВт/см2 фемтосекундным лазером, который является совместной уникальной разработкой НЦВО РАН и Ульяновского государственного университета, с характеристиками: длительность импульса — 100-10-15; средняя мощность — 1,26 ± 2%мВт; пиковая мощность — 6кВт; длина волны — 1,55 мкм.
Для определения фагоцитарной активности вычисляли следующие показатели фагоцитоза: фагоцитарное число (ФЧ) по Райту, и фагоцитарный индекс (ФИ) по Гамбургеру, интегральный фагоцитарный индекс (ИФИ), опсоничес-кий индекс поглощения (ОИП) [7]. Кроме того, в Нф цитохимически определяли активность мие-лопероксидазы (МПО), уровень катионных белков (КБ), долю активных нейтрофилов в спонтанном варианте НСТ-теста [3]. Результаты выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК).
Для оценки жесткости мембраны Нф использован метод сканирующей зондовой микроскопии (SolverPro NT-MDT, г.Зеленоград, Россия). Использовались фирменные кремниевые зонды с жесткостью 0,2 N/m, радиус закругления кончика зонда составлял примерно 50 nm. Нф, фиксированные глутаровым альдегидом, сканировались в полуконтактном режиме. Ригидность мембран оценивалась по модулю Юнга, который рассчитывали согласно теории Герца [6].
Известия Самарского научного центра Российской академии наук, т. 14, №4(4), 2012
Для выявления различий между данными, полученными в эксперименте и контрольной группе, применялся непараметрический и-кри-терий Манна-Уитни (81а1а 6.0). Статистически достоверными считались данные при рJ0,05.
Результаты. В результате проведенных нами исследований установлено, что относительное количество Нф при РШМ 1а статистически значимо увеличивается относительно контроля (61,7±2,91 % против 55,9±4,40 %). При этом абсолютное количество Нф крови женщин при РШМ на 1а стадии снижается в 2 раза по сравнению с таковым у практически здоровых женщин (3,5±0,52 х109/л против 6,4±0,68 х109/л). В Нф крови женщин при РШМ ИФИ составляет 0,62 ед., что заметно ниже по сравнению с таковым у практически здоровых женщин (0,81 ед.) (табл.1).
Результаты изучения ферментов кислородза-висимой и анаэробной активности Нф представлены в табл.1. Установлено, что в Нф больных РШМ увеличивается количество активированных Нф в спонтанном НСТ-тесте и активность МПО по сравнению с Нф доноров.
Результаты оценки влияния ФСЛИ на фагоцитарную активность Нф доноров представлены на рис. 1.
ФЧ Нф периферической крови практически
здоровых женщин снижается при влиянии ФСЛИ средней интенсивности в 0,27 Дж/см2 (1,41±0,083 против 1,97±0,174 ус.ед. в контроле), 2,70 Дж/см2 (1,46±0,028 против 1,97±0,174 ус.ед. в контроле) и 0,96 Дж/см2 (1,33±0,071 против 1,97±0,174 ус.ед. в контроле). При этом ИФИ в Нф крови здоровых женщин при облучении средней интенсивности 0,27 и 0,96 Дж/см2 составляет 0,52, а при 2,7 мДж/см2 - 0,68 (рис. 1).
Таким образом, ФСЛИ дозозависимо снижает ФЧ Нф доноров и волнообразно дозозависи-мо изменяет ФИ и ИФИ этих Нф, сохраняя их в пределах коридора нормы. Результаты изучения показателей фагоцитоза у Нф больных РШМ после ФСЛИ представлены на рис. 2.
Как следует из приведенных данных, наиболее значимые колебания показателей фагоцитоза имели место при дозах ФСЛИ 0,27 Дж/см2, при которых ФИ, ФЧ и ИФИ в Нф снижаются по сравнению с необлученными клетками больных РШМ, и доза 0,10 Дж/см2, при которой ФИ, ФЧ и ИФИ возрастают. ОИП возрастает при всех использованных дозах ФСЛИ. При анализе влияния ФСЛИ на активность ферментов аэробной и кислороднезависимой бактерицидности Нф установлено, что активность МПО Нф здоровых женщин статистически значимо возрастает при
Таблица 1. Функциональное состояние Нф здоровых женщин и при РШМ 1а стадии
Исследуемая ФИ, % ФЧ, ус.ед. МПО, СЦК НСТ-тест КБ,
группа СЦК
Здоровые 41,20 1,97 1,56 1,06 1,79
женщины ±6,437 ±0,174 ±0,169 ±0,177 ±0,124
РШМ 40,38 1,54 2,05 1,40 1,80
1а стадия ±5,375 ±0,079 ±0,139* ±0,175* ±0,063
Примечание: * - данные статистически значимо отличаются от аналогичных в группе контроля
Рис. 1. Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов в крови здоровых женщин после воздействия фемтосекундного лазерного излучения различной интенсивности (ИФИ - интегральный фагоцитарный индекс, ФИ - фагоцитарный индекс, ФЧ - фагоцитарное число)
Рис. 2. Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов в крови больных раком шейки матки на 1а стадии после воздействия фемтосекундного лазерного излучения различной интенсивности (ИФИ - интегральный фагоцитарный индекс, ФИ - фагоцитарный индекс, ФЧ - фагоцитарное число,
ОИП - опсонический индекс поглощения)
облучении дозой 0,29 Дж/см2, 0,81 Дж/см2 и 1,35 Дж/см2. При этом увеличивается количество НСТ-положительных Нф при облучении 0,10 Дж/см2 и 2,70 Дж/см2. Уровень КБ в Нф, облученные дозой 0,10 Дж/см2, 0,27 Дж/см2, 0,29 Дж/ см2 и 2,7 Дж/см2 (рис. 3).
У больных РШМ 1а стадии снижается количество НСТ-положительных Нф при облучении 0,96 Дж/см2 (1,08±0,153 СЦК против 1,40±0,175 СЦК в необлученных Нф). Уровень КБ и активность МПО изменяется волнообразно в преде-
лах коридора нормы. При оценке влияния ФСЛИ на Нф больных РШМ было установлено изменение ригидности в зависимости от интенсивности излучения (табл. 2).
Данные, представленные в табл.2, позволяют предполагать значимое увеличение ригидности Нф доноров при всех использованных дозах ФСЛИ. При ФСЛИ Нф пациенток с РШМ 1а ригидность клеток значимо снижалась при низких (0,10-0,27 Дж/см2) и высоких (1,35-2,70 Дж/ см2) дозах облучения.
Рис. 3. Изменение бактерицидной активности нейтрофилов здоровых женщин после воздействия фемтосекундного лазерного излучения различной интенсивности (НСТ - нитросиний тетразолий, КБ - катионные белки, МПО - миелопероксидаза, СЦК - средний цитохимический коэффициент)
Известия Самарского научного центра Российской академии наук, т. 14, №°4(4), 2012
Таблица 2. Показатели ригидности мембраны Нф крови после ФСЛИ различной интенсивности in vitro
Ригидность, Па Контроль Средняя доза облучения (Дж/см2)
0,10 0,27 0,29 0,48 0,81 0,96 1,35 2,70
Здоровые женщины 360,8 ±14,1 515,9±14 ,96* 561,7±2 2,88* 481,6±1 9,32* 382,0±1 7,72 569,6±2 2,62* 937,4±3 3,09* 550,1±2 9,95* 496,3±2 6,43*
РШМ Ia 314,8 ±23,00 216,7±18 ,11* 197,9±1 0,34* 274,8±2 3,60 295,7±2 3,32 340,8±3 4,25 296,9±1 7,05 200,8±9 ,34* 192,8±1 0,6*
Примечание: * - данные статистически значимо отличаются от аналогичных в контроле
ВЫВОДЫ
1. При РШМ на начальной стадии снижается абсолютное количество Нф и их фагоцитарная активность неизменной бактерицидной активности.
2. ФСЛИ волнообразно и дозозависимо изменяет фагоцитарную активность и бактерицид-ность Нф доноров при значимом их снижении после воздействия доз 0,27 Дж/см2 и 0,96 Дж/см2.
3. Доза ФСЛИ 0,10 Дж/см2 праймирует Нф на начальной стадии РШМ; повышение дозы до
0.27 Дж/см2 снижает в этих Нф фагоцитарную активность.
4. При облучении Нф больных РШМ ФСЛИ in vitro жесткость мембраны снижается, а у Нф крови здоровых женщин повышается.
Работа поддержана гос. заданием Минобрна-уки РФ и грантом Президента РФ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вирусно-бактериальная природа дисплазии и рака
шейки матки / М.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, С.С.
Афанасьев // Вестник РАМН. 2004. №6. С.35-40.
2. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на иммунологическую реактивность организма / И.И. Долгушин, О.А. Гизингер, К.Г. Ишпахтин // ВНМТ. 2008. Т. XV. № 2. С. 95-97.
3. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии (справочник). С-Пб.: Интермедика, 1999. 656 с.
4. Использование метода сканирующей зондовой микроскопии для исследования морфологических параметров нейтрофильных гранулоцитов / С.Н. Плес-кова, М.Б. Звонкова, Ю.Ю. Гущина // Морфология. 2005. Т.127, №1. С.60-62.
5. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И. Методы изучения процесса фагоцитоза и функционально-метаболического состояния фагоцитирующих клеток. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. 112 с.
6. Monitoring of the effect of low-intensity laser radiation with constant pulse generation on neutrophil granulocytes in vitro / I.I. Dolgushin, V.A. Markova, O.A. Gizinger // Bull Exp Biol Med. 2010. Vol.150. №2. Р.222-224.
7. Siposan D.G., Lukacs A. Relative variation to received dose of some erythrocytic and leukocytic indices of human blood as a result of low-level laser radiation : an in vitro study // J.Clin.Laser Med.Surg. 2001. Vol. 19. № 2. P. 89-103.
8. Weiderpass E. Hormonal risk factors of cancer in human point of cancer epidemiologist // Proc. of International ^^ere^e «Hormonal cancerogenesis». SPb, 2000. P.22-23.
INDEXES OF NONSPECIFIC IMMUNITY IN CASE OF INFLUENCE OF A FEMTOSEKOND LASER RADIATION ON INITIAL STAGE OF CERVICAL CANCER
© 2012 T.V. Abakumova, I.I. Antoneeva, S.O. Geninmk
Ulyanovsk State University
For an assessment of a morphofunctional condition of neutrophil leukocytes used peripheral blood of 35 women with primary cancer of a neck of a uterus of Ia of a stage. Phagocytic activity, level myeloperoxidase and cationic protein, rigidity of a membrane of neutrophils of peripheral blood of patients before impact of femtosecond laser radiation of in vitro is investigated. Wavy and dose-dependently change of studied indicators after influence in density of a stream of energy - 0,27 J/cm2 and 0,96 J/cm2 is revealed. Key words: cervical cancer, neutrophil leukocytes, femtosecond laser radiation.
Tatyana Abakumova, Candidate of Biology, Associate Professor at the physiology and pathophysiology Department. E-mail: taty-abakumova@yandex.ru
Inna Antoneeva, Doctor of Medicine, Professor at the Oncology and Ray Diagnostics Department. E-mail: Naum-53@yandex.ru Snezhanna Gening, Student.
