Показана возможность лечения анемии Фанкони путём генетической коррекции iPS-клеток Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

■■■ ■ I I I I I I I 4- I ■ ■ тп

Новости клеточных технологий

НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИИ

КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

Показана возможность лечения анемии Фанкони путём генетической коррекции клеток

Возможность перепрограммирования соматических клеток взрослых для получения индуцированных плю-рипотентных стволовых клеток [1] ПРБ-клеток) открыла дорогу совершенно новым методам экспериментального моделирования человеческих заболеваний.

!РБ-клетки, специфичные пациенту, могут стать основой нового метода лечения анемии Фанкони (АФ), генетического заболевания, при котором наблюдается

несколько гематологических аномалий, ослабляющих способность к борьбе с инфекциями, ухудшающих доставку кислорода и свертываемость крови [2]. Частота возникновения АФ в Европе и США составляет 3 на 1 млн населения [2]. Существует 13 генов (один из них сцеплен с половой X хромосомой), мутации в которых могут стать причиной АФ [3]. Все эти гены относятся к одному метаболическому пути. У пациентов с АФ кроме

Схема коррекции анемии Фанкони с помощью генетической модификации /РЭ-кпеток, В исследовании были выполнены все этапы [за исключением трансплантации), необходимые для лечения анемии Фанкони с помощью генетической коррекции РЭ-клеток, Фактически, в настоящее время началу клинических испытаний препятствует лишь отсутствие эффективных методов получения РЭ-клеток без использования генетических конструкций

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 4, 2009

■ И I II II

■тп

Новости клеточных технологий

нарушения гемопоэза также проявляется высокая предрасположенность к опухолеобразованию. В настоящий момент анемию Фанкони лечат пересадкой костного мозга от здоровых братьев или сестер пациента, полностью или частично идентичных по антигенам главного комплекса гистосовместимости. Однако и в этом случае остаётся высокая вероятность отторжения и других осложнений.

В связи с тем, что недостаточность костного мозга у пациентов с АФ проявляется в результате существенного снижения числа функциональных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), то генетическую коррекцию рационально проводить не на самих ГСК, а на !РБ-клет-ках, что и было продемонстрировано в совместной работе испанских учёных. Они показали возможность получения !РБ-клеток пациентов с АФ и произвели их дальнейшую генетическую коррекцию. Такой подход позволит производить большое количество аутогенных, генетически стабильных гемопоэтических клеток, которые можно будет использовать в лечении, без опасности отторжений.

Генетическая коррекция заключалась во введении лентивирусного вектора, как наиболее устойчивого к подавлению экспрессии в человеческих клетках[4], кодирующего исправленные белки метаболического пути АФ — ГА1\1СА или ГА1\1С02. Перепрограммирование соматических клеток исследователи осуществляли путём инфицирования полученных кожных фибробластов от пациентов с АФ ретровирусом, кодирующим меченые с |\1-конца белки 0СТ4, БОХ2, К1-Г4, с-МУС, сразу после генетической коррекции мутаций. Затем клетки высаживались на фидерный слой человеческих фибробластов, где в случае успешного перепрограммирования превращались в !РБ-клетки и формировали колонии. Иммунофлуоресцентным анализом было показано, что полученные клетки экспрессировали транскрипционные факторы и поверхностные маркеры, специфичные для плюрипотентных клеток, что подтверждает успешное перепрограммирование.

При дальнейшей характеристике !РБ-клеток было подтверждено присутствие в них перепрограммирующих трансгенов, однако уровень их экспрессии оказался низким, что показал метод количественной ПЦР. Более того, была показана реактивация экспрессии собственных

белков 0СТ4 и с-МУС, а также других транскрипционных факторов, ассоциированных с плюрипотентностью. Это говорит о том, что присутствие экзогенных перепрограммирующих агентов необходимо лишь на начальной стадии.

В условиях in vitro полученные iPS-клетки были способны дифференцироваться в эктодермальные, ме-зодермальные и энтодермальные производные, о чём можно судить по клеточной морфологии, а также по иммунофлуоресцестному окрашиванию против —-фе-топротеина/ГОХА2, TuJ1/GFAP и —-актинина, соответственно.

Функциональная активность метаболического пути АФ в полученных клетках проверялась следующим образом. С помощью высокоэнергетического ультрафиолетового воздействия в клетках индуцировалось накопление блокированных репликационных вилок, куда в норме перемещается белок FANCD2I5L Такой эффект наблюдался у генетически скорректированных клеток, что говорит о полном восстановлении АФ пути, т.е. излечении на клеточном уровне.

Исследователями была показана способность полученных iPS-клеток дифференцироваться в гемопоэти-ческие клетки. В культурах были определены CD34+ и CD45+ клетки. Очищенные CD34+ клетки, полученные из генетически скорректированных iPS-клеток пациентов с АФ, формировали обширные эритроидные и мие-лоидные колонии, сравнимые с контролем. Кроме того, было подтверждено, что АФ путь в таких клетках полностью восстановлен.

В данной работе впервые была показана принципиальная возможность лечения человеческих генетических заболеваний путём комбинации генной терапии и технологии iPS-клеток. Однако до того как новый метод будет применен в клинике, нужно решить еще большое количество проблем. Несмотря на то, что в процессе перепрограммирования уменьшается экспрессия введённых трансгенов, остаётся опасность их реактивации при дифференцировке, что может приводить к образованию опухолей. Кроме того, существует опасность инфицирования при использовании вирусных векторов для доставки трансгенов. Ясно одно, необходимо разрабатывать технологии перепрограммирования без введения чужеродных генов [6].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Takahashi К., Tanabe К., Ohnuki М. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131: 861-72.

2. Tischkowitz M. D., Hodgson S.V. Fanconi anaemia. J. Med. Genet. 2003; 40: 1-10.

3. Wang W. Emergence of a DNA-damage response network consisting of Fanconi anaemia and BRCA proteins. Nature Rev. Genet. 2007; 8: 735-48.

4. Pfeifer A., Ikawa M., Dayn Y., Verma I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. PNAS 2002; 99: 2140—5.

5. Bogliolo M., Lyakhovich A., Callen E. et al. Flistone FI2AX and Fanconi anemia FAIMCD2 function in the same pathway tomaintain chromosome stability. EMBO J. 2007; 26: 1340—51.

6. Zhou FI., Wu S., Joo J.Y. et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell 2009; 4[5): 381-4.

Подготовила П.Ю. Новикова

По материалам: Raya А„ Rodroguez-Piza" I.Guenechea G, et al. Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells. Nature 2009; 460: 53-9

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 4, 2009