CC BY
130
Том 150, кн. 2
Естественные науки
2008
УДК 579.8.22:576.851:577.352
ПОИСК НОВЫХ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ФОРМ БИОФЛОКУЛЯНТОВ
Т.В. Багаева, Е.Е. Зинурова Аннотация
В кратком обзоре рассмотрены вопросы получения эффективных биофлокулянтов на основе использования в данном процессе микроорганизмов. Проведен анализ наиболее эффективных групп микроорганизмов, синтезирующих биофлокулянты. Дан основной состав биофлокулянта, который участвует в реакциях образования агрегатов.
Ключевые слова: биофлокулянты, микроорганизмы, синтез полимеров, адгезия.
Введение
В случае очистки воды от взвешенных частиц, в интенсификации стадий выделения и концентрации биомассы или при извлечении продуктов метаболизма клеток, в пищевой промышленности, все большее применение находят биофлокулянты [1-6]. Не исключено расширение спектра использования биофлокулянтов, например, для извлечения компонентов подземных вод, сопровождающих добычу 1 т нефти, который, по данным медиа-пресс, содержат компоненты (№, С1, М§, Мп, I, Вг, Ы, Аи, А§, уран, радий и другие), стоимость которых на мировом рынке составляет 257 долларов за 1 т. Перечисленные частицы, клетки, соединения находятся в растворах в виде дисперсных систем.
Дисперсные системы бывают грубодисперсными и высокодисперсными. Грубодисперсные системы (взвеси, суспензии, эмульсии) состоят из частиц, которые оседают (или всплывают) в гравитационном поле, не проходят через бумажные фильтры, видимы в световом микроскопе. К этим системам можно отнести и биосуспензию, в которой дисперсной фазой являются клетки микроорганизмов, а дисперсионной средой - культуральная жидкость.
Высокодисперсные коллоидные растворы (золи) имеют размер частиц 10-7 -10- М. Частицы этих дисперсных систем проходят через бумажные фильтры, но задерживаются на ультрафильтрах из целлофана, пергамента, они не оседают и не всплывают, не видимы в световом микроскопе. К таким системам можно отнести подземные воды, содержащие различные химические соединения.
Для разделения фаз жидкость - твердое вещество или концентрирования взвешенных частиц необходимо их укрупнение, так как обычно частицы дисперсионных систем имеют малые размеры и обладают высокой седиментацион-ной устойчивостью. Существует два типа соединений, которые участвуют в данных процессах, это коагулянты и флокулянты. В настоящее время термины «коагуляция» и «флокуляция» часто рассматриваются как эквивалентные понятия, поскольку действие определенных соединений не редко можно отнести к
тому или иному процессу. Тем не менее некоторые авторы подчеркивают, что эти термины имеют существенные различия [4-6].
Низкомолекулярные неорганические и органические электролиты, приводящие к агрегации частиц, называют коагулянтами. К флокулянтам относят неорганические и органические высокомолекулярные соединения, способствующие образованию агрегатов за счет объединения нескольких частиц через макромо-лекулярную структуру адсорбированного или химически связанного полимера.
Общей основой как флокуляции, так и коагуляции является процесс агрегации частиц.
Процесс биофлокуляции возможен за счет взаимодействия веществ как непосредственно с клеточной поверхностью микроорганизмов, так и с продуктами их синтеза. Эффективность связывания соединений или клеток определяется видом микроорганизма, специфической химической структурой клеточной поверхности или структурой определенного вещества - биофлокулянта (фактора), синтезируемого микроорганизмом, а также природой самой минеральной или органической фазы и растворителя [7-10].
1. Характеристика флокулянтов
Все флокулянты делят на три группы: неорганические полимеры, природные высокомолекулярные вещества и синтетические органические полимеры. К биофлокулянтам можно отнести две последние указанные группы.
Среди неорганических полимеров-флокулянтов можно назвать активную кремневую кислоту, получаемую путем конденсации ее молекул или ее солей, полиалюминевый хлорид и т. д.
Вторая группа - высокомолекулярные соединения прежде всего природного происхождения. Это чрезвычайно эффективные флокулянты дисперсных систем, небольшие добавки которых в дисперсную систему могут радикально снизить агрегативную и седиментационную устойчивость дисперсий. Эти соединения относятся чаще к анионным полиэлектролитам, молекулярная масса которых от 100 тысяч до нескольких миллионов. Однако имеются и катионные, и амфотерные полиэлектролиты. Преимущество данных биофлокулянтов - отсутствие токсических свойств, безвредность для человека и окружающей среды. К этой группе принадлежит прежде всего крахмал. Крахмал состоит из линейного полимера амилозы и разветвленного амилопектина. Использование крахмала в качестве флокулянта было начато еще в 1950-х годах, когда картофельный крахмал использовали для ускорения седиментации и обезвоживания шламов уранового производства, а также для обогащения фосфосодержащих руд. В настоящее время получены так называемые привитые крахмалы, когда к основной цепи крахмала, состоящей из а-глюкозы, пришивают синтетические полимеры, такие, как полиакриламид, полиакриловая кислота и другие, образующие боковые цепи полиэлектролита [6].
Кроме того, в качестве биофлокулянтов используют декстрин - крахмал с уменьшенным содержанием амилозы; альгинат натрия - соль полиалгиниловой кислоты; производные целлюлозы - метилкарбометил-, оксиэтилцеллюлоза, которые, в отличие от целлюлозы, растворимы в воде; гуаровые смолы, активным началом которых является галактоманноза, имеющая длинную разветв-
ленную цепь и образующая клубки; лигнинсульфоновые кислоты и их соли -трехмерный жесткоцепочечный сетчатый полимер, имеющий фенилпропано-вое ядро с фенольными и сульфогруппами.
В качестве биофлокулянта изучается хитозан - полимер 1,4-Р-Б-глюкоза-мина, аминная группа которого придает хитозану свойства катионного полиэлектролита. Он образует комплексные соединения с солями тяжелых металлов: ртути, хрома, железа, меди, свинца и других соединений [7]. Не токсичен. Получены его производные, в том числе и алкилхитозаны.
В качестве флокулянтов можно использовать и смесь водорастворимых полимеров (полисахаридов, нуклеиновых кислот, белков), которые являются результатом жизнедеятельности микроорганизмов. Необходимо отметить, что в настоящее время поиск новых биофлокулянтов ведется именно в этом направлении.
Третья группа флокулянтов - это синтетические флокулянты, которые могут быть образованы как при участии микроорганизмов и их ферментных систем, так и химическим путем. Примером таких биофлокулянтов является поли-акриламид - неионогенный биофлокулянт. В настоящее время нашли штамм микроорганизма, который участвует в синтезе акриламида. Данный микроорганизм способствует образованию акрилата аммония из акрилонитрила. Если в реактор добавить щелочь и отогнать аммиак получается акрилат натрия. Он и идет на изготовление полиакриламида [11].
Все синтетические флокулянты имеют большую молекулярную массу, их пространственную структуру можно легко модифицировать под конкретную дисперсную систему, они устойчивы.
2. Получение и характеристика новых типов биофлокулянтов
Несмотря на многообразие имеющихся биофлокулянтов, продолжается поиск новых соединений и биообъектов способных к их синтезу. В настоящее время большинство работ, связанных с выделением и характеристикой новых типов биофлокулянтов, проводится в лабораториях России, Китая, Франции и Японии. В работах изучаются различные микроорганизмы, включая бактерии, простейшие, активный ил и т. д.
Наиболее частыми продуцентами биофлокулянтов являются бактерии разных родов и видов. Так, в качестве продуцент биофлокулянта изучается растущая техническая культура РаетЬасИНш ро1утуха ОЛ1. Показано, что бактерия, обозначенная как ОЛ1, продуцировала биофлокулянт с высокой флокули-рующей активностью. Данная культура была выделена из почвы. Выделенный штамм по своим морфологическим, физиологическим и биохимическим характеристикам, а также по сравнительному сходству последовательности 168 рРНК, обозначенной в ГенБанке под номером DQ 166375, был идентифицирован как РаетЬасИНш ро1утуха ОЛ1. В работе [12] был изучен состав питательной среды, при котором наблюдалась наибольшая продукция биофлокулянта. Показано, что оптимальная, питательная среда должна содержать (г/л): сахарозы -40.0; дрожжевой экстракт - 4.0; К2НР04 - 5.0; КН2Р04 - 2.0; №01 - 0.1. Сахароза и дрожжевой экстракт в данном соотношении являются оптимальными источниками углерода и азота для продукции биофлокулянта.
В проведенных экспериментах были установлены также условия культивирования микроорганизма, включая рН, температуру, скорость перемешивания, а также и необходимое количество вносимого в питательную среду инокулята. Показана зависимость между ростом культуры и продукцией биофлокулянта. Экспериментально доказано, что наибольшее количество биофлокулянта синтезируется растущей культурой в небольшой период времени.
Исследователями из Китая [13] был проведен скрининг микроорганизмов, продуцирующих флокулирующую субстанцию. Вид бактерий, секретирующий наибольшее количество биофлокулянта, был изолирован из образцов отработанной воды. Базируясь на морфологических свойствах и сходству последовательности 168 рРНК, изолят, обозначенный как W31, был классифицирован как Vagococcus 8р. Биофлокулянт, обозначенный как MBFW 31, был выделен из растущей культуры с помощью этанольной экстракции и очищен гельхроматогра-фией. Биофлокулянт был высокостабильным, имел сильную флокулирующую активность в широком диапазоне рН. В дальнейшем MBFW 31 был идентифицирован как полисахарид с молекулярной массой около 2-106 Ба. В его составе были обнаружены нейтральные сахара и уроновая кислота как мажорные и минорные компоненты соответственно. Инфракрасный спектр показал присутствие гидроксильных, карбоксильных и метильных групп в молекулах выделенного биофлокулянта. Авторы считают, что по своим характеристикам полученный биофлокулянт имеет потенциальную возможность для очистки сточных вод.
Целью работ Зханга с сотрудниками [14] являлось выделение новых экзопо-лисахаридных биофлокулянтов, продуцируемых Sorangium cellulosum КИ8Т06. Необходимо было охарактеризовать химический состав биофлокулянта и выяснить зависимость продукции экзополисахарида относительно используемого источника углерода. Было показано, что получение биофлокулянта видом Sorangium cellulosum КИ8Т06 на минеральной солевой среде возможно при внесении в питательную среду крахмала как источника углерода. Глюкоза в питательной среде при концентрации 3 г/л полностью ингибировала рост клеток и продукцию экзополисахарида. Однако ее низкие концентрации 1-2 г/л стимулировали рост клеток и утилизацию субстрата. Полученный биофлоку-лянт содержал 38.3% белка и 58.5% углеводов, из которых глюкоза, маноза и глюкуроновая кислота были в концентрации 51.3, 39.2 и 10.5% соответственно. Установлено, что флокулирующая активность КИ8Т06 зависела от присутствия катионов. Таким образом, использование Sorangium cellulosum КИ8Т06 может быть выгодно для коммерческой продукции биофлокулянта, а также существенно способствовать обогащению общих знаний о миксобактериях.
В работах с бактериальными клетками [15] была показана продуцирующая способность двух видов BaciШus 8р. образовывать биофлокулянт на разнообразных источниках углерода. Два вида бацилл F2 и F6 были способны образовывать биофлокулянт с высоким флокулирующим эффектом как в изолированном виде, так и в смешанной популяции. Среди органических источников углерода были такие соединения, как сахариды, спиртовые альдегиды, жирные и органические кислоты, молекулярный вес которых не превышал 200. Установлено, что для промышленной продукции биофлокулянта хорошим источником углерода для этих бактерий могут являться такие отходы, как барда после цел-
люлозной ферментации или барда из реактора, продуцирующего водород из сточных вод [15].
Среди исследований бациллярных продуцентов биофлокулянтов можно назвать работы по выделению полимеров из Bacillius mucilaginosus [16]. Так, био-флокулянт МББЛ9 был продуцирован бактерией? изолированной из образцов грунта. Биофлокулянт имел хорошую флокулирующую способность (до 99.6% флокулирующей активности в каолиновой суспензии при дозировке 0.1 мл/л). Биофлокулянт был представлен полисахаридом, главными компонентами которого являлись уроновая кислота (19.1%), нейтральные сахара (47.4%) и аминоса-хара (2.7%). Анализ ИК-области спектра этого биофлокулянта показал присутствие в нем карбоксильных и гидроксильных групп. Было установлено, что МББЛ9 нетоксичен и может быть использован в пищевой промышленности для удаления взвешенных частиц. Кроме того, он может быть использован для обработки сточных вод, так как активно ускоряет процесс формирования флокул и осаждения органических частиц в присутствии ионов Са . Было показано, что после 5 мин действия биофлокулянта удельный съем частиц и химическое потребление кислорода составило 85.5 и 68.5% соответственно. Таким образом, предложенный биофлокулянт был лучше, чем традиционно химические флокулянты.
Bacillius licheniformis ССЯС 12826 продуцировала превосходный внеклеточный биополимер. Наибольшее количество флокулянта культура продуцировала, когда росла в аэробных условиях на питательной среде, содержащей лимонную кислоту, глутаминовую кислоту и глицерин как источники углерода. Биополимер-флокулянт был чрезвычайно вязким материалом с молекулярной массой 2-106 Da, определенной с помощью гельпроникающей хроматографии. Извлечение биофлокулянта из культуральной жидкости проводили с помощью осаждения этанолом. Аминокислотный анализ и тонкослойная хроматография показали, что биофлокулянт - гомополимер, состоящий из глютаминовой кислоты, то есть полиглютаминовая кислота. Этот биофлокулянт эффективно флокулировал различные органические и неорганические суспензии. Он флоккулировал каолиновую суспензию без катионов, хотя его флокулирующая активность синергетически стимулировалась добавлением двух- и трехвалентных катионов (Са , Бе , Л1 ). Однако синергетический эффект катионов металлов был наиболее эффективен при нейтральных значениях рН. Сравнение флоку-лирующего действия данного биополимера с коммерческим препаратом, имеющим более низкую молекулярную массу, показало, что существующий биофлокулянт имеет более высокую активность. Авторы считают, что высокая продуктивность выделенного штамма бацилл в получении биофлокулянта, а также его высокая флокулирующая активность делают полученный биофлоку-лянт экономичным и выгодным. Кроме того, полученный биофлокулянт безопасен для человека и окружающей среды, а также может легко разлагаться микроорганизмами [17].
Среди бактериальных форм, способных к синтезу биофлокулянтов, исследуются и бактерии рода CytroЬacter. Так, в работе Хуяита с сотрудниками [18] был выделен отдельный вид бактерий, обозначенный как ТКБ04, который продуцировал биофлокулянт при росте на уксусной или пропионовой кислотах. Штамм был изолирован из биопленки сформированной в районе хозяйственной
канализации. Данный вид микроорганизма был идентифицирован как род Cytrobacter на основании изучения морфологических и физиологических особенностей, включая нуклеотидные последовательности 16S рРНК. Было показано, что ТКБ04 продуцировал биофлокулянт в течение логарифмической фазы роста популяции. Оптимальная температура для синтеза биофлокулянта -30 °С, рН питательной среды может находиться в диапазоне 7.2-10.0. Данный микроорганизм мог расти и использовать в качестве единственного источника углерода в питательной среде различные соединения, органические кислоты и сахара. Однако наиболее активный синтез биофлокулянта наблюдался при внесении уксусной или пропионовой кислот в питательную среду, содержащую дрожжевой экстракт.
Cytrobacter sp. TKF04 был обнаружен во многих природных изолятах как бактериальный вид, способный синтезировать биофлокулянт из уксусной и про-пионовой кислот. Было установлено, что при периодическом культивировании с подпиткой, когда в питательную среду добавляли уксусную кислоту и аммоний (10 и 1 мМ), поддерживая рН на уровне 8.5, осуществляется гиперпродукция биофлокулянта.
Биофлокулянт получали из культуральной жидкости растущей культуры бактерий с помощью экстракции этанолом и последующим диализом относительно деионизированной воды. В работе [19] было установлено, что полученный биофлокулянт эффективно флокулировал в каолиновой суспензии, когда конечная концентрации его была 1-10 мг/л. Флокулирующая активность биофлокулянта проявлялась в широком диапазоне рН (2-8) и температуры (395 °С). Присутствие катионов (Na, K, Ca2+, Mg2+, Fe2+,Al 3+ или Fe3+) в среде не влияло на флокулирующую активность биофлокулянта. Дальнейшие исследования показали, что биофлокулянт мог эффективно флокулировать различные неорганические и органические суспензионные частицы, включая диатомит, бентонит, активированный уголь, почву и активный ил. Он обладал действием сопоставимым или превосходящим таковые способности синтетических фло-кулянтов. Основным компонентом структуры биофлокулянта был глюкозамин. Его молекулярный вес, установленный с помощью гельфильтрации, был в пределах 232 и 440 kDa. Более подробное изучение биофлокулянта показало, что данный биополимер структурно близок к хитину и хитозану.
Изучена и структура внеклеточного полисахаридного биофлокулянта из Klebsiella pneumoniae Н12. Биофлокулянт состоял из Д-глюкозы, Д-маннозы, Д-галактозы и Д-глюконовой кислоты в молярном соотношении 3.9 : 1.0 : 2.3 : 3.6. При изучении последовательности полученного гликозида он был частично гидролизован обработкой кислотой и ферментом. Полученные результаты показали, что Н12 имеет структуру линейного полимера, включающего в свой состав пентасахарид с боковой цепью из Д-глюконовой кислоты и Д-глюкозы. Существование других последовательностей или других составных элементов гликозида не установлено, но не исключается [20].
Сравнительно недавно был получен новый биофлокулянт - полигалакту-роновая кислота - биофлокулянт REA-11. Этот биофлокулянт был выделен из изолированного вида Corynebacterium glutamicum ССТСС М201005. В качестве единственного источника углерода для продукции биофлокулянта бактерией
была использована сахароза. Азот был представлен в питательной среде в виде комплекса, содержащего мочевину и органический азот кукурузного экстракта, который использовался клетками, как для роста, так и для синтеза биофлоку-лянта. Лучший эффект для синтеза биофлокулянта был достигнут, когда среда содержала 17 г/л сахарозы, 0.45 г/л мочевины и 5 мл/л кукурузного экстракта. В этих условиях продукция биофлокулянта составила 390 ед/мл. Молярное соотношение С : N существенно влияло на продукцию биофлокулянта, соотношение 20 : 1 было лучшим. Интересно, что одновременная подача сахарозы и мочевины в соотношении 20 : 1 в течение 24 ч ферментации повышала продукцию ИЕЛ-П на 17% по отношению к контролю и составляла 458 ед/мл. Полученные в лабораторных исследованиях результаты [21] были проверены на 10-литровом ферментере с перемешивающим устройством. Полученный биофло-кулянт был термостабилен при низких значениях рН 3.0-6.5. Он имел значительно более сильный флокулирующий эффект в каолиновой суспензии по сравнению с химическими агентами и был рекомендован для очистки сточных вод.
В работах с данным биофлокулянтом был предложен его биосинтетический путь в клетках бактерий CoryneЬacterium glutamicum. Доказательствами предложенного биосинтетического пути являлись данные по:
1) ответу клеток на добавление УДФ-глюкозы в питательную среду;
2) определению присутствия некоторых промежуточных продуктов в пути метаболизма;
3) нахождению некоторых активных ферментов, участвующих в пути синтеза биофлокулянта.
Так, было показано [22], что после добавления в питательную среду 100 мМ УДФ-глюкозы продукция биофлокулянта увеличивается на 24%, а активность УДФ-галактозэпимиразы и УДФ-галактоздегидрогеназы повышается на 200 и 50% соответственно. Кроме того, ключевые продукты, предположенные в биосинтетическом пути, такие, как УДФ-глюкоза, УДФ-галактоза и УДФ-глюконовая кислота, были обнаружены в бесклеточных экстрактах. Активности УДФ-глюкозпирофосфарилазы (0.97), УДФ-галактозэпимиразы (0.75) и УДФ-га-лактоздегидрогеназы (0.89) хорошо коррелировали с выходом биофлокулянта, когда различные сахара использовались как единственные источники углерода. Поэтому биосинтетический путь ИЕЛ-П в CoryneЬacterium glutamicum начинался от фосфат-1-глюкозы, которая затем конвертировалась в УДФ-глюкозу с помощью УДФ-пирофосфарилазы. УДФ-глюкоза далее конвертировалась в УДФ-галактозу с помощью УДФ-галактозэпимиразы, последняя в дальнейшем была конвертируема в УДФ-галактуроновую кислоту УДФ-галактоздегидрогеназой. И, наконец, УДФ-галактуроновая кислота была полимеризована в биофлоку-лянт ИЕЛ-П с помощью неустановленных ферментов - глюкозтрансферазы и полимеразы.
Кроме бактерий на способность к синтезу биофлокулянтов изучался и фи-топатогенный мицелиальный гриб рода Aspergillius. Данный гриб был способен к синтезу биофлокулянта для каолиновой суспензии и водно-солевых красителей. Результаты исследований показали, что источниками углерода и азота для синтеза этого биофлокулянта может выступать крахмал. Оптимальными условиями для синтеза биофлокулянта была температура 28 °С и интервал рН пита-
тельной среды 5.0-6.0. Кроме того, для синтеза биофлокулянта был необходим процесс перемешивания питательной среды со скоростью 150 об/мин. Полученный биофлокулянт содержал 76.3% сахара и 21.6% белка. Молекулярный вес 3.2-105 Ба. Изучение биофлокулянта фотоэлектронным спектрофотометром и инфракрасным излучателем показало, что он содержит амино-, амидные и гид-роксильные группы в своем составе. Наиболее интенсивная флокулирующая активность биофлокулянта была показана для каолиновой суспензии - 98.1%. Биофлокулянт был эффективен в флокуляции некоторых растворимых анионных красителей в растворе, в частности он флокулировал голубой и желтый красители на 92.4 и 92.9% соответственно. В работе [23] установлена необходимая доза биофлокулянта и значение рН среды, при которых достигается наиболее эффективная агрегация частиц. Более детальное исследование структуры биофлокулянта показало, что присутствующие в нем аминогруппы были про-тонированы при рН 5.0, поэтому, возможно, биофлокулянт атакует негативную связь молекул красителя, способствуя процессу флокуляции. Сделано предположение, что амино- и амидогруппы, которые присутствуют в молекуле био-флокулянта, играют, по-видимому, важную роль в процессах флотации за счет участия электростатических взаимодействий.
В ряде работ по выделению биофлокулянтов был изучен механизм биофло-куляции. Образование мостиков между дисперсными частицами через молекулы (ионы) адсорбированного высокомолекулярного соединения подавляющим большинством исследователей считается механизмом флокуляции. Так, в лаборатории Кен с сотрудниками [24] был изучен механизм флокулирующего действия биофлокулянта MBFTRJ21, используемого для флокуляции природной соды. Сам биофлокулянт продуцировался клетками лактобацилл и имел лучшие показатели по вносимой дозе и активности флокуляции относительно применения ряда известных и применяемых в промышленности биофлокулянтов. Сам био-флокулянт MBFTRJ21 состоял в основном из полисахарида. Было показано, что при взаимодействии между биофлокулянтом и природной содой образуется водородная связь. Ее наличие регистрировалось по электростатическому потенциалу. Кроме того, при взаимодействии образуется и электровалентная связь. Тепловая обработка биофлокулянта и обработка К104 показала, что активным инградиентом биофлокулянта является белок и озамин. Образование связей между биофлокулянтом и содой происходит в течение всего флокулирующего процесса. Механизм флокуляции связан с комбинацией соды и MBFTRJ21, когда происходит взаимодействие между ними с образованием водородных связей при активной позиции глюкозаминогликана.
Проводятся работы и по использованию биофлокулянтов для удаления гумусовых кислот из устойчивых фильтратов свалок. Так, была проведена оценка действия полученного из бактерий биофлокулянта по сравнению с традиционными неорганическими коагулянтами по удалению гумусовых кислот из фильтратов свалок при биологической обработке. Были установлены оптимальные значения рН (7.0-7.5) и доза биофлокулянта (20 мг/л), достаточная для удаления гумусовых кислот из фильтратов свалок более чем на 85%. Данные результаты были сопоставимы с теми, которые были получены при применении обычных коагулянтов типа квасцов алюминия или полиалюминиевого хлорида, поэтому
полученный биофлокулянт может рассматриваться как реальная альтернатива в обработке фильтратов свалок, применяющих коагуляцию [25].
Интересными являются работы, связанные с получением биофлокулянтов из галотолерантных форм бактерий [26]. Так, морской вид миксобактерий NU-2 был изолирован из ила, взятого из Хуангхай моря (Китай). Этот микроорганизм мог расти при высоких концентрациях NaCl (до 7%). Морфологические свойства и 16S рРНК секвенирование показали, что изолят - новый вид микроорганизмов - связан с родом Nannocystic. Данный вид продуцировал биофлокулянт на среде с крахмалом, при этом его выход составлял 14.8 г/л. Биохимический анализ полученного биофлокулянта показал, что он состоит из белка на 40.3% и полисахаридов на 56.5%. Основными компонентами полисахаридов была глюкоза, манноза и глюкуроновая кислота в отношении 5 : 4 : 1. Флокулирую-щая активность NU-2 строго зависела от наличия катионов Fe2+ и Al3+. Так, когда 30 мг/л FeCl3 было растворено в суспензии каолиновой глины, то флоку-лянт проявлял высокую флокулирующую активность (до 90%), которая не изменялась в широком диапазоне рН (2.0-13.0). Биофлокулянт был способен также осветлять красящие жидкости. Было показано, что он осветлял раствор на 98.2% от красной краски в концентрации 100 мг/л и на 99.0% от изумрудно-синего красителя в концентрации 50 мг/л. Однако использование флокулянта для того, чтобы осветлить раствор от розовой или синей красящих жидкостей, было не эффективным.
Исследовали и биофлокулирующую способность самих морских бактерий, способных к росту в сточной воде текстильных предприятий [27]. Доминирующими видами микроорганизмов были представители рода Pseudomonas. Клетки обладали гидрофобностью, что важно для их практического применения для очистки сточных вод. Было установлено, что некоторые двухвалентные катионы (Са, Mg) оказывали влияние на гидрофобные свойства клеток и, соответственно, на их биофлокулирующую способность. Концентрация глюкозы такого влияния не оказывала. Гидрофобные свойства клеток зависели также от их физиологического состояния, от стадии роста популяции. Лучший флокули-рующий эффект достигался клетками, находящимися в экспоненциальной фазе.
Из образцов активного ила двух перерабатывающих дары моря заводов в Южном Тайланде было выделено 16 видов полимер-продуцирующих бактерий. Их культуральные жидкости были способны флокулировать каолиновую суспензию в присутствии 1% CaCl2. Основываясь на данных по наиболее высокой флокулирующей активности культуральной жидкости, был выделен вид микроорганизма, обозначенный как S11, который в дальнейшем был идентифицирован как Klebsiella sp. Рост культуры был максимальным (1.026 г/л сухой клеточной массы) после 1 дня культивирования клеток, в то время как самый высокий выход полимера (0.973 г/л) был достигнут после 5 дней культивирования популяции. Однако наиболее высокая флокулирующая активность культураль-ной среды наблюдалась после 2 дней культивирования. Полученный из культу-ральной жидкости полимер был идентифицирован как кислый полисахарид, содержащий нейтральные сахара и уроновую кислоту в виде мажорных и минорных компонентов соответственно. Результаты по изучению свойств частично очищенного полисахарида из Klebsiella sp. показали, что он состоит из га-
лактозы, глюкозы и манозы в приблизительном соотношении 5 : 2 : 1. Полимер был растворим в кислых и основных растворах, но не в органических растворителях. Его молекулярная масса была несколько больше чем 2-106 Da. Инфракрасные спектры показали присутствие в молекулах биофлокулянта гидро-ксильных, карбоксильных и метоксильных групп. Была установлена также его точка плавления - 314 °C. Самое высокое флокулирующее действие биофлокулянта наблюдалось при оптимальной дозе полисахарида 15 мг/л и в присутствии 1% CaCl2 [28].
В качестве продуцентов биофлокулянтов была выделена группа фталат-ассимилирующих микроорганизмов из активного ила. Смесь видов, обозначенных как R-3, эффективно продуцировала биофлокулянт (APR-3) в жидкой среде культивации. Особенно большое количество биофлокулянта синтезировалось на питательной среде, содержащей крахмал и глюкозу (1 : 1) как источники углерода. Идентификация этой группы биофлокулянт-продуцирующих микроорганизмов показала, что она состоит из четырех видов: Oerskovia, Acinetobacter, Agrobacterium и Enterobacter. Синтезируемый ими биофлокулянт был очищен электрофоретически до гомогенного состояния. Его молекулярная масса была приблизительно 2-10 Da. Анализ его состава показал, что APR-3 - кислый полисахарид, состоящий из глюкозы, галактозы, янтарной кислоты и пировино-градной кислоты. Молярное соотношение 5.5 : 1.0 : 0.6 : 2.5 [29].
Значительное число работ посвящено избыточному активному илу, который, как предполагается, может являться активным биофлокулянтом [30]. Однако данный процесс может быть эффективным только при оптимизации управления процессом биофлокуляции. Так, с помощью электронного микроскопа было показано, что у бактерий активного ила на поверхности имеется развитый чехол, основным элементом которого являются регулярные спирали, состоящие из внеклеточных биополимеров. Сделано предположение, что именно данные спирали могут принимать участие в процессе флокуляции. Процесс биофлоку-ляции может быть ускорен путем физико-химического воздействия на микроорганизмы активного ила. При этом происходит систематическое разрушение чехлов клеток микроорганизмов и их восстановление за счет наличия в клетках запасных веществ. Таким образом, в окружающую среду идет непрерывное выделение биополимеров, способствующих интенсификации процесса флоку-ляции [31].
С другой стороны, сам активный ил является проблемой при биологической очистке сточных вод, когда наблюдается неполное отделение активного ила от биологически очищенной воды. Эта проблема особенно актуальна для предприятий с большим выбросом, в частности, в целлюлозно-бумажной промышленности, где сброс воды составляет десять тысяч кубометров в час. Поэтому все больше предприятий используют в данных процессах дополнительные био-флокулянты [32].
Среди способов, успешно применяемых для очистки сточных вод, сорбци-онная очистка считается наиболее перспективной. При этом основная надежда, как отмечалось выше, возлагается на новые биофлокулянты. Изучение штаммов микроорганизмов позволило выделить продуценты биополимеров, обладающих высоким флокулирующим эффектом. Полученные из различных микроорганиз-
мов биополимеры были отнесены к гликопротеинам, наибольший флокулирую-щий эффект у которых проявлялся в широком диапазоне рН 6.0-11.0. На фло-кулирующую способность оказывали влияние температура (до 55 °С) и присутствие ионов Са2+. Механизм флокуляции при использовании выделенных био-флокулянтов связывают с «мостиковой» флокуляцией [33].
В настоящее время спектр биофлокулянтов расширяется, так в качестве биофлокулянта изучается полигалактуриновая кислота, выделяемая рядом бактерий. Исследуется зооглейный биофлокулянт, биофлокулянт из отходов пивоваренных заводов с добавление микроорганизмов Saccharomyces сerevisia и MycoЬactrrium phlei. Существуют готовые препараты биофлокулянтов «Зетол 32», «Зетол 7692», «Праистол 650 ВС» [32]. Начаты работы по получению хитина в качестве биофлокулянта из мицелиальных грибов [7].
Заключение
Как видно из приведенных данных, основными продуцентами биофлоку-лянтов в настоящее время рассматриваются различные микроорганизмы. Преимущество в данном процессе отдается бактериальным формам, имеющим как фирмакутное (гр+) строение клеточной стенки, так и грациликутное (гр-). Многие из изученных продуцентов относятся к миксобактериям и бациллам. Основными источниками выделения продуцентов являются почва, отработанная вода, ил. Источником углерода для большинства выделяемых биофлокулянтов являются органические соединения, включая углеводы, спирты, органические кислоты. Для многих микроорганизмов лучшим источником углерода является сахароза. Синтез биофлокулянтов наблюдается главным образом в растущих культурах в период экспоненциальной фазы роста популяции.
По биохимической природе выделяемые биофлокулянты относятся к полисахаридам, в состав которых нередко входят белки и органические кислоты. Молекулярная масса выделяемых биофлокулянтов разнообразна, но наиболее часто она находится в близком к 2-106 Da диапазоне.
Действие выделяемых биофлокулянтов на дисперсные системы зависит от природы и количества добавляемого полимера, его молекулярной массы и заряда, от условий введения реагента, содержания в системе дисперсионной фазы и электролитов. Не редко в начале внесения флокулянта наблюдается усиление его флокулирующей активности по мере увеличения дозы, а затем происходит стабилизация системы, и дальнейшее увеличение дозы реагента не влияет на процесс флокуляции, то есть в реакциях наблюдается дозозависимый эффект.
Лучшим способом внесения биофлокулянта в дисперсную систему является дробный, как это характерно для флокулянтов небиологического происхождения. Вторичные флокулы, образованные при дробном внесении полимера, по размерам превосходят первичные и оседают с большой скоростью.
Механизм флокулирующего действия биофлокулянтов также связан с образованием «мостиков», как это характерно для других флокулянтов.
Электролиты обычно улучшают флокулирующую активность как заряженных, так и незаряженных биополимеров. Можно предположить, что в этом случае происходит образование мостиков «частица - макроион - многозарядный противоион - макроион - частица», как это характерно для большинства фло-
кулянтов. Однако есть биофлокулянты, которые не требуют дополнительного внесения ионов металлов в диссперсионную систему для осуществления реакции агрегации частиц.
В настоящее время биофлокулянты находят все более широкое применение в промышленности. Прежде всего это водоочистка на разных этапах. Данный процесс включает три основных процесса отделения твердой фазы: осаждение в отстойниках, осветление во взвешенном слое и фильтрование через зернистую загрузку. Для повышения эффективности очистки используют флокулян-ты, которые ускоряют формирование и осаждение хлопьев в камерах хлопье-образования и отстойниках [2, 6, 21, 34].
Используются биофлокулянты и в пищевой промышленности. Так, например, для осветления диффузного сока сахарной свеклы при производстве сахара, при производстве соков, в молочной промышленности для осаждения белков [6, 19].
Начаты работы по использованию биофлокулянтов для концентрации клеточных суспензий, поскольку методы сепарации, коагуляции, высаливания ведут к значительным потерям целевого продукта и загрязняют окружающую среду [5, 19]. Кроме того, разрабатывается селективная биофлокуляция - это флокуляция частиц одного вещества при неизменной или очень слабой агрегации частиц другого. Она используется для обогащения полезных ископаемых, например, для отделения глинистых минералов, удаления окрашенных примесей и т. д.
Значительный интерес исследователей к этой проблеме стимулирует процесс поиска новых биофлокулянтов и их продуцентов и остается в центре внимания ученых как одно из направлений совершенствования производственных процессов и улучшения экологического состояния окружающей среды.
Работа выполняется при поддержке Госконтракта №08-8.4-40/2006 (Г) и гранта Правительства Республики Татарстан по повышению квалификации специалистов.
Summary
T.V. Bagaeva, E.E. Zinurova. The Foundation of the New Efficient Forms of Biofloccu-lants.
The article observes the questions of obtaining efficient bioflocculants on the base of microorganism usage. The most efficient microorganism groups synthesizing bioflocculants were analyzed. The basic composition of bioflocculant taking part in aggregate production reactions was estimated.
Key words: bioflocculants, microorganisms, polymer synthesis, adhesion.
Литература
1. Хенце М., Армоэс П., Ля-Кур-Янсен Й., Арван Э. Очитка сточных вод: Биологические и химические процессы. - М.: Мир, 2004. - 480 с.
2. Бабенко Ю.Д. Очистка воды коагулянтами. - М.: Наука, 2000. - 478 с.
3. Pascale P.S., JacquesM. Des bacteries epuratrices // Biofutur. - 1997. - № 165. -P. 38-40.
4. Тесленко А.Л., Перфанова П.Ф., Медведев Ю.В. Концентрирование суспензий микроорганизмов с помощью флокулянтов. - М.: ВНИИСЭНТИ, 1984. - 25 с.
5. Шкоп Я.Я., Фомченко Н.В. Агрегация клеток микроорганизмов в процессе разделения микробных суспензий. - М.: ИНТИТЕЙ микробпром, 2002. - 60 с.
6. Запольский А.К., Бирни А.А. Коагулянты и флокулянты в процессах очистки воды. -Л.: Химия, 1987. - 203 с.
7. Хитин и хитазан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Наука, 2002. - 368 с.
8. Кармушка В.И., Ульберг Э.Р., Грузина Т.Г., Подольская В.И., Перцов Н.В. Исследование роли структуры компонентов поверхности микроорганизмов в гетерокоагу-ляции с частицами коллоидного золота // Приклад. биохимия и микробиол. - 1987. -Т. 23, № 5. - С. 697-702.
9. Ульберг З.Р., Кармушка В.И., Грузина Т.Г., Подольская В.И., Гарбара В.С., Закопай-ло Л.Г. Перцов Н.В. Определение локализации и выделение фактора, связывающего коллоидное золото из микробных клеток // Биотехнол. - 1986. - № 1. - С. 109-114.
10. Овчаренко Ф.Д., Ульберг З. Р., Кармушка В.И., Грузина Т.Г., Подольская В.И., Перцов Н.В. Роль биохимических факторов в селективной гетерокоагуляции микроорганизмов //Докл. АН СССР. - 1986. - Т. 287, № 4. - С. 1009-1012.
11. Стрельников А. Живые технологии // Химия и жизнь. - 2006. - № 2. - С. 4-12.
12. Yang Z.H., Tao R., Zery G.M., Xiao Y., Deng E.J. Culture medium and grading culture technics for bioflocculant production by Paenibacillius polymyxa GA1 // Huan Jing Ke Xue. - 2006. -V. 27, No 7. - P. 1444-1449.
13. Gao J., Bao H.Y., XinM.X., Liu Y.X., Li Q., Zhang Y.F. Characterization of a bioflocculant from a newly isolated Vagococcus sp. W31 // J. Zhejiany Univ. Sci. B. - 2006. -V. 7, No 3. - P. 186-192.
14. Zhang J., Liu Z., Wang S., Jiang P. Characterization of a bioflocculant produced by the marine myxobacterium Nannocystic sp. NU-2 // Appl. Microbiol. - 2002. - V. 59, No 4-5. -P. 517-522.
15. Zhu Y.B., Ma F., Ren N.O., Huang J.L., Wang A.J. Bioflocculant producing capability by two strain of Bacillius sp. in diversified carbon sources // Huan Jing Ke Xue. - 2005. -V. 26, No 5. - P. 152-155.
16. Deng S.B., Bai R.B., Hu X.M., Luo Q. Characteristics of a bioflocculant produced by Bacillus mucilaginosus and its use in starch wastewater treatment // Appl. Microbiol. Bio-technol. - 2003. - V. 60, No 5. - P. 588-593.
17. ShihI.L., Van Y.T., Yeh L.C., Lin H.G., Chang Y.N. Production of a biopolymer floccu-lant from Bacillus licheniformis and its flocculation properties // Bioresour. Technol. -2001. -V. 78, No 3. - P. 267-272.
18. Fujita M., Ike M., Tachibana S., Kitada G., Kim S.M., Inoue Z. Characterization of bioflocculant produced by Citrobacter sp. TKFO4 from acetic and propionic acids // J. Bio-sci. Bioeng. - 2000. - V. 89, No 1. - P. 40-46.
19. Fujita M., Ike M., Jang J.H., Kim S.M., Hirao T. Bioflocculation production from lower-molecular fatty acids as a novel strategy for utilization of sludge digestion liquor // Water Sci. Technol. - 2001. - V. 44, No 10. - P. 237-243.
20. Kobayashi T., Takiguchi Y., Yazawa Y., Nakata K., Yamaguchi T., Kurane R. Structural analysis of an extracellular polysaccharide bioflocculant of Klebsiella pneumoniae // Bio-sci. Biotechnol. Biochem. - 2002. - V. 66, No 7. - P. 1524-1530.
21. He N., Li Y., Chen J. Production of a novel polygalacturonic acid bioflocculant REA-11 by Corynebacterium glutamicum // Bioresour. Technol. - 2004. - V. 94, No 1. - P. 99-105.
22. Li Y., He N., Guan H., Du G., Chen J. A novel polygalacturonic acid bioflocculant REA-11 produced by Corynebacterium glutamicum: a proposed biosynthetic pathway and experimental confirmation // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2003. - V. 63, No 2. - P. 200-206.
23. Deng S., Yu G., Ting Y.P. Production of a bioflocculant by Aspergillus parasiticus and its application in dye removal // Colloids Surf. B: Biointerface. - 2005. - V. 44, No 4. -P. 179-186.
24. Qin P.Y., Zhang T., Chen C.X. Flocculating mechanism of microbial flocculant MBFTRJ21 // Huan Jing Ke Xue. - 2004. - V. 25, No 3. - P. 69-72.
25. Zouboulis A.I., Chai X.-L., Katsoyiannis I.A. The application of bioflocculant for the removal of humic acids from stabilized landfill leachates // J. Environ. Manage. - 2004. -V. 70, No 1. - P. 35-41.
26. Zhang J., Wang R., Jiang P., Liu Z. Production of an exopolysaccharide bioflocculant by Sorangium cellulosum // Lett. Appl. Microbiol. - 2002. - V. 34, No 3. - P. 178-181.
27. Khemaikhem W., Ammar E., Bakhrouf A. Effect of environmental condotionson on hy-drophobicity of marine bacteria adapted to textily iffluent treatment // Microbiol. Bio-technol. - 2005. - V. 21, No 8-9. - P. 1623-1631.
28. Dermlin W., Prasertsan P., Doelle H. Screening and characterization of bioflocculant produced by isolated Klebsiella sp. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1999. - V. 52, No 5. -P. 698-703.
29. Kurane P., Matsuyama H. Production of a bioflocculant by mixed culture // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1994. - V. 58, No 9. - P. 1589-1594.
30. Иванов В.К., Силантьева Н.Т. Получение новых видов биофлокулянтов // Химия и безопасность. - 2005. - № 1-2. - С. 569.
31. Денисов А.А., Дамиров И.И., Евдокимова Н.Г., Семижон А.В. Процессы флокули-рование микроорганизмов при биологической очистке сточных вод // Сб. тез. 5-й Всесоюз. конф. «Научные основы технологии промышленного производства биологических препаратов». - Щелково: Изд-во ВГНКИ, 1996. - С. 256-257.
32. Жвакина М.А., Жвакина О.А. К проблеме снижения выноса активного ила из вторичных отстойников // Сб. тез. 15-й науч. конф. «Актуальные проблемы биологии в экологии». - Сыктывкар: Изд-во КГПИ, 2004. - С. 88-89.
33. Брындине Л.В., Коренева О.С., Петров С.И. Применение биофлокулянтов в очистке сточной воды // Сб. тез. Междунар. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М., 2005. - С. 59.
34. Сироткин А.С., Понкратова С.А., ШулаевМ.В. Современные технологические концепции аэробной биологической очистки сточных вод. - Казань: КГТУ, 2000. -163 с.
Поступила в редакцию 25.06.07
Багаева Татьяна Вадимовна - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского государственного университета. E-mail: Tatiana.Bagaeva@ksu.ru
Зинурова Елена Евгеньевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник фирмы «Нейрон», г. Казань.
