CC BY
28Вестник медицинского института «РЕАВИЗ», № 6, 2018 г. УДК 616-089.819.843
ПОИСК МОДИФИЦИРОВАННОЙ РЕЦЕПТУРЫ РАСТВОРА ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ ПЕЧЕНИ ПЕРЕД ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ
© 2018 К.А. Ворновских1, У.В. Масликова2, А.А. Супильников1, Б.И. Яремин3
1Частное учреждение образовательная организация высшего образования «Медицинский университет «Реавиз», Самара Межрегиональная общественная организация «Общество трансплантологов»,
Самарское региональное отделение, Самара 3Московский городской научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н. В. Склифосовского, Москва
В работе приводится экспериментальное обоснование использования модифицированного консервирующего раствора при сохранении печеночного трансплантата. В серии из 33 животных моделируется перфузия различными растворами, изучается морфология сохраненной печени.
Работа выполнена в рамках реализации проекта, финансируемого по программе «Умник» Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.
Ключевые слова: донорство органов, раствор Висконсинского университета, перфузионная консервация.
Введение. В клинической трансплантологии ключевой задачей является борьба с ише-мически-реперфузионным повреждением. От консервации современная парадигма перемещается к реабилитации донорского органа. Арсенал средств для решения этой важнейшей проблемы весьма скуден. В последние десятилетия были опробованы и внедрены различные растворы для холодовой фармакоконсервации. Раствор Висконсинского университета (UW) и гистидин-триптофан-кетоглутарат (HTK) являются наиболее распространенными в клинической практике. Они содержат ряд веществ для предотвращения цитолиза, стабилизации мембран, выравнивания межклеточного электролитного баланса, и цитопротекции.
Указанные эффекты в UW достигаются за счет введения в состав раствора аденозина (как источника АТФ), гидрофосфата-этилового крахмала (ингибитора межклеточного отека), глутатиона, фосфора для стабилизации рН и аллопуринола (как антиоксиданта и средства сохранения клеточной структуры). Раствор HTK использует маннитол, гистидин (антиокси-дант и осмотический стабилизатор), триптофан (мембранозащитный агент), кетоглутарат (метаболит цикла Кребса) и маннитол.
Указанные растворы обладают высокой ценой и рядом недостатков. UW при отличных цитопротективных качествах имеет повышенную вязкость, а HTK имеет неоправданно высокую цену, при длительном нахождении в сосудистом русле усугубляет отек эндотелия и вызывает его повреждение. Из-за сложного состава указанные растворы имеют короткие сроки годности. В этой связи возникает высокая потребность в модификации указанной рецептуры.
Перспективной представляется доработка существующих растворов для консервации донорских органов в плане улучшения их качественных характеристик - срока годности, вязкости, цитопротективных и метаболических свойств.
Выбор компонентов для оптимизации состава раствора для сохранения печени перед трансплантацией. В качестве базового раствора для консервации донорской печени вы-42
бран раствор Висконсинского университета, остающийся золотым стандартом в трансплантации и демонстрирующий лучшие по сравнению с НТК результаты. Однако в его состав предложен ряд изменений (табл. 1).
Таблица 1
Предлагаемые изменения в состав раствора UW
Исходный состав раствора UW Модифицированный раствор
Калия лактобионат: 105 ммоль/л КН2Р04: 25 ммоль/л MgSO4: 5 ммоль/л Раффиноза: 30 ммоль/л Аденозин: 5 ммоль/л Глютатион: 3 ммоль/л Аллопуринол: 1 ммоль/л Гидроксиэтилкрахмал: 50 г/л Калия гидроксид: 100 ммоль/л Натрия гидроксид/Соляная кислота: до достижения рН 7,4 Калия лактобионат: 105 ммоль/л КН2Р04: 25 ммоль/л MgSO4: 5 ммоль/л Аденозин: 5 ммоль/л Глютатион: 3 ммоль/л Аллопуринол: 1 ммоль/л Калия гидроксид: 100 ммоль/л Натрия гидроксид/Соляная кислота: до достижения рН 7,4 Морфолиний-метил-триазолил-тиоацетат 25 мг/л 1-[(2,3,4-Триметоксифенил)метил]пиперазин 2 мг/л 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат1 мг/л Глюкоза 10% - 10 мл
Удалены вязкие компоненты, затрудняющие перфузию микроциркуляторного русла. Они соответствовали первоначальной идее авторов раствора UW использовать его также и для машинной перфузии донорских органов.
Тиотриазолин (морфолиний-метил-триазолил-тиоацетат) обладает противоишемически-ми, антиоксидантными, мембраностабилизирующими и иммуномодулирующими свойствами. Предупреждает гибель гепатоцитов, снижает степень их жировой инфильтрации и распространение центролобулярных некрозов печени, способствует процессам регенерации ге-патоцитов, нормализует белковый, углеводный, липидный и пигментный обмены. Увеличивает количество синтеза и выделения желчи, нормализует ее химический состав.
Триметазидин (1-[(2,3,4-Триметоксифенил)метил]пиперазин) введен как специфический агент, действие которого направлено против реперфузионного повреждения гепатоцитов. В основе запуска каскада ишемически-реперфузионного повреждения печени лежит активация митохондриальных пероксидаз. Последние активируются, так как в условиях гипоксии предпочтение отдается не аэробному гликолизу, а активации 3-кетоацил-КоА-тиолазы. Именно эту липазу и блокирует триметазидин. Избрана небольшая его концентрация из-за гепатоток-сического действия более высоких концентраций.
Этилметилгидроксипиридина сукцинат напрямую стимулирует усвоение глюкозы. Тормозит перекисное окисление липидов, повышает активность антиоксидантной системы, активирует энергосинтезирующие функции митохондрий, улучшает энергетический обмен в клетке. Активизирует процессы цикла Кребса, способствует синтезу и внутриклеточному накоплению АТФ.
Глюкоза добавлена в состав раствора для компенсации высокой осмолярности других компонентов, а так же как энергетический источник.
Полученный таким образом препарат может рассматриваться не только как раствор для отмывания микроциркуляторного русла от форменных элементов крови, но как средство ле-
чения ишемизированных гепатоцитов, вернее, митохондрий ишемизированных гепатоцитов. Условно указанный раствор называли раствором Университета Реавиз (UR).
Материалы и методы. Экспериментальный материал составили 33 белых крыс, разделённых на 3 группы по 11 животных. Группе 1 выполнена перфузия печени раствором HTK, группе 2 раствором Висконсинского университета, группе 3 раствором Университета Реавиз. Под эфирным наркозом выполняли канюляцию брюшной аорты катетером Branula 10G (BD, США) в направлении печени, путем перевязки грудной и супраренальной аорты достигали артериальной изоляции печени. Отток организовывали посредством пересечения нижней полой вены ниже почечных вен. Перфузировали печень консервирующими растворами: в первой группе раствором Custodiol (Dr. Koehler, Германия), во второй группе раствором SPS-1 (Organ Recovery Systems, США), в третьей группе модифицированным раствором UR, приготовленным ex tempore. Температура растворов в момент введения достигала 6 °С. Перфузию проводили через аппарат Perfusor со скоростью 1 мл/мин. Перфузию проводили объёмом 30 мл. В завершении перфузии из полой вены поступал прозрачный раствор. Прекращали перфузию, изымали печень и помещали ее в стерильный флакон с исходным раствором. Время консервации органа составило 0, 6 и 12 часов после резекции печени.
Гистологическое исследование экспериментального материала выполнялось в окраске гематоксилином-эозином при световой микроскопии. Оценивали степень вакуолизации гепа-тоцитов, выраженность стеатоза, перицентральную дегенерацию и синусоидальное расширение, отек. Биохимическое исследование гистологического материала проводили для определения активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и малондиальдегида (МДА). Активность супероксиддисмутазы определяли по восстановлению тетразолиевого нитросинего в условиях генерации супероксидного анион-радикала. Активность каталазы определяли по способу В.Г. Шиманова, Т.Х. Мукимова и С.Ю. Кучинского с соавт. Уровень малондиальдегида по способу Джамалла и Смита (1985). Обработка статистических данных производилась при помощи языка программирования Python в модуле Statistica.
Результаты. В группах сравнения обнаружена существенная разница по показателям повреждения гепатоцитов (p < 0,05) (табл. 2).
Таблица 2
Морфологические признаки повреждения гепатоцитов в группах сравнения
Группа Умеренная Тяжелая Фокальная Гидропическая Гидропическое Синусоидальная
вакуолизация вакуолизация дегенерация дистрофия перерождение дилатация
1 - HTK 7 4 9 8 8 3
2 - UW 4 2 7 6 5 1
3 - UR 3 0 5 5 2 0
При выполнении исследования маркеров ишемически-реперфузионного повреждения гепатоцитов во всех группах сравнения выявлена корреляция повышения АЛТ, СОД, КАТ и снижения МДА.
Профиль динамики МДА отличался в группах наблюдения. Если в группах 1 и 2 он имел волнообразную динамику, в группе 3 он имел четкую тенденцию к снижению (табл. 3).
Таблица 3
Временная динамика малондиальдегида в группах сравнения, нмоль/г
———............... Группа 1. HTK Группа 2. UW Группа 3.ЦЯ
0 час 4,23 ± 0,14 3,21 ± 0,11 2,78 ± 0,08
6 часов 4,11 ± 0,09 3,65 ± 0,12 2,54 ± 0,03
12 часов 3,85 ± 0,11 3,43 ± 0,13 2,11 ± 0,06
Различие в активности каталазы в группах наблюдения также было значимым. Наиболее высоким оно было в третьей группе.
Таблица 4
Временная динамика активности каталазы в группах сравнения, Ед/мг
................. Группа 1. HTK Группа 2. UW Группа 3.ЦЯ
0 час 52,4 ± 6,8 92,7 ± 4,5 112,4 ± 6,7
6 часов 78,4 ± 4,3 101,4 ± 5,4 145,5 ± 6,4
12 часов 49,8 ± 3,4 143,3 ± 6,5 165,6 ± 6,7
Динамика активности супероксиддисмутазы также была достоверно более высокой в третьей группе (табл. 5).
Таблица 5
Временная динамика активности супероксиддисмутазы в группах сравнения, Ед/мг
.................. Группа 1. HTK Группа 2. UW Группа 3.ЦЯ
0 час 1,9 ± 0,1 3,8 ± 0,1 3,2 ± 0,3
6 часов 1,8 ± 0,3 3,2 ± 0,2 4,1 ± 0,1
12 часов 2,1 ± 0,1 3,9 ± 0,1 4,2 ± 0,2
Признаки цитолитической активности как индикатор повреждения печени в группах сравнения имели значимые различия, коррелирующие с динамикой других маркеров (табл. 6).
Таблица 6
Временная динамика активности аланинаминотрансферазы в группах сравнения, Ед/л
.................. Группа 1. HTK Группа 2. UW Группа 3.ЦЯ
0 час 289 ± 3 102 ± 2 84 ± 2
6 часов 1169 ± 4 688 ± 3 361 ± 2
12 часов 1424 ± 4 1033 ± 2 302 ± 2
Таким образом, в группе 3 обнаружены значимые различия показателей ишемически-реперфузионного повреждения с другими группами, выявляемые как морфологически, так и по биохимическим маркерам.
Обсуждение. Концепция реабилитации донорских органов является немаловажным свершением современной трансплантации. Термины «забор» и «заготовка» никаким образом не могут отразить всей той стратегии лечения донорского органа, которая должна быть выстроена с момента первого легального контакта службы органного донорства с пациентом. Современные перфузионные технологии достигают самого высокого уровня, включая тепло-
вую перфузию донорского органа. Однако доступность новых решений в повседневной практике служб донорства органов остается невысокой из-за технологической сложности и высокой стоимости. Поиск новых более совершенных решений для перфузионного сохранения донорских органов является важной задачей. Главной точкой приложения в перфузии печени является борьба с ишемически-реперфузионным повреждением. Помимо использования перфузионных растворов, наиболее оптимальным из которых остается раствор Вискон-синского университета, необходимо применение при перфузии компонентов, устраняющих явления ишемии, предотвращающих липолиз и перекисное окисление липидов. Предложенный нами вариант раствора лишен вязких компонентов, относительно стабилен. Его применение в остром эксперименте показывает, что микроскопическая картина, как и биохимические показатели печени на фоне перфузии предложенным раствором позволяет снизить степень ишемического повреждения печени и улучшает его метаболизм.
Выводы. Попытки усовершенствовать качество перфузионной консервации донорской печени обоснованы и востребованы. Раствор Висконсинского университета остается базовым для сохранения данного органа, «золотым стандартом», однако введение в его состав дополнительных компонентов позволяет уменьшить выраженность ишемически-реперфузионного повреждения. Необходимо дальнейшее экспериментальное исследование результатов трансплантации печени после перфузии с использованием предложенной рецептуры.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Яремин Б.И., Миронов А.А., Гребенников В.В., и др. От консервации к аппаратной перфузионной реабилитации донорских органов // Вестник медицинского института «РЕАВИЗ»: реабилитация, врач и здоровье. -2017. - № 5. - С. 113-117.
2 Котельников Г.П., Колсанов А.В., Яремин Б.И. Принципы управления клиническим исходом в трансплантации - региональная модель // Трансплантология. - 2017. - № 9 (3). - С. 264-267. DOI:10.23873/2074-0506-2017-9-3-264-267
3 Новрузбеков М.С., Олисов О.Д., Гуляев В.А. и др. Морфологическая оценка трансплантата печени: роль экспресс-биопсии // Трансплантология. - 2016. - № 4. - С. 19-26.
4 Wilson CH, Brook NR, Talbot D. Preservation solutions for solid organ transplantation // Mini Rev Med Chem. -2006. - № 6. - Р. 1081-90. PMID: 17073708.
5 D'Alessandro AM, Southard JH, Love RB, Belzer FO. Organ preservation // Surg Clin North Am. - 1994. - № 74. -Р. 1083-1095. PMID: 7940062.
6 Maathuis MH, Leuvenink HG, Ploeg RJ. Perspectives in organ preservation // Transplantation. - 2007. - № 83. -Р. 1289-1298. PMID: 17519776.
7 Evaluation of silybum marinaum efficacy on University of Wisconsin and histidine-tryptophan-ketoglutarate solutions latter the damage of the perfused liver Ozer N et. al. // Acta Cir Bras. - 2017. - № 32(6). - Р. 407-417. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/s0102-865020170060000001
8 Жуков Б.Н., Лысов Н.А., Котова С.П., Кириченко Н.Д., Бунькова Е.Б., Иванова А.М. Практика и перспективы применения инфракрасного лазерного излучения в гепатологии // Лазерная медицина. - 1999. - Т. 3. - № 2. - С. 22.
Рукопись получена: 3 декабря 2018 г. Принята к публикации: 6 декабря 2018 г.
