CC BY
16
DOI https://doi.org/10.18551/rjoas.2017-11.72
ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЮ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНЗООТИЧЕСКОЙ ПНЕВМОНИИ
СВИНЕЙ
APPROACHES TO THE DEVELOPMENT AND IMPROVEMENT OF METHODS FOR MOLECULAR GENETIC DIAGNOSIS OF PIGS ENZOOTIC PNEUMONIA
Куликова Н.Ю., Гребенникова Т.В., Южаков А.Г., Алипер Т.И., Полякова И.В., Исаев Ю.Г., Лахтюхов С.В., Гулюкина И.А.*, научные сотрудники Kulikova N.Y., Grebennikova T.V., Yuzhakov A.G., Aliper T.I., Polyakova I.V., Isaev Y.G., Lakhtyukhov S.V., Gulyukina I.A., Researchers Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко, Москва, Россия All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Y.R. Kovalenko, Moscow, Russia *E-mail: viev@mail.ru
АННОТАЦИЯ
В статье представлены подходы к разработке и усовершенствованию методов молекулярно-генетической диагностики энзоотической пневмонии свиней. Проведен филогенетический анализ генотипов M.hyopneumoniae с использованием фрагмента генома, кодирующего 16S рибосомную РНК. Результаты анализа показали, что M.hyopneumoniae, циркулирующая в Томской области, генетически близка к патогенам, циркулирующим в Канаде и США. M.hyopneumoniae, циркулирующая в Белгородской области, генетически близка к патогенам, циркулирующим в США и Бразилии.
ABSTRACT
Improved approaches towards diagnostics of swine enzootic pneumonia are addressed in this study. A phylogenetic analysis of different genotypes of M.hyopneumoniae was carried out based on genome fragment coding for 16S RNA. The results demonstrated that M.hyopneumoniae isolated in Tomsk Region of Russia was genetically close to the strains circulating in Canada and USA. At the same time, M.hyopneumoniae isolated in Belgorod Region of Russia was genetically close to the strains circulating in USA and Brasil.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Энзоотическая пневмония свиней, Mycoplasma hyopneumoniae, полимеразная цепная реакция.
KEY WORDS
swine enzootic pneumonia, Mycoplasma hyopneumoniae, Polymerase chain reaction
Энзоотическая (микоплазменная) пневмония свиней (лат. - Pneumonia enzootica suum, EPS; грипп поросят, энзоотическая бронхопневмония, вирусная пневмония, микоплазменная пневмония, респираторный микоплазмоз свиней) - инфекционная хроническая энзоотическая болезнь свиней всех возрастов, проявляющаяся ремиттирующей лихорадкой, катаральной бронхопневмонией, сухим кашлем. Болезнь вызывает значительные экономические потери вследствие замедления роста и развития поросят из-за плохой усвояемости корма (зараженные животные расходуют на единицу прироста живой массы на 18-20% кормов больше, чем здоровые). Показатели смертности составляют от 2 до 15%, заболеваемость 38-100% [10].
Этиологическим агентом энзоотической пневмонии свиней является Mycoplasma hyopneumoniae (М. hyo). По морфологическим и ферментативным свойствам возбудитель имеет сходство с некоторыми другими видами микоплазм (микоплазмы являются самыми мелкими клетками, способными размножаться в бесклеточной
питательной среде, и обладают крайне короткими геномами, ограничивающими биосинтетические возможности), однако отличается от них высокой требовательностью к питательным средам и медленной репликацией (до 30 дней). Возбудитель распространен повсеместно, особенно в регионах интенсивного свиноводства, и играет важную роль в развитии респираторного симптомокомплекса свиней (РСКС) — многокомпонентного заболевания, одной из актуальных проблем современного свиноводства. Кроме того, возбудитель открывает «ворота инфекции» для условно-патогенной микрофлоры, а также увеличивает тяжесть и продолжительность респираторных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии (прежде всего таких, как цирковирусные болезни и репродуктивно-респираторный синдром свиней, а также стрептококкоз, гемофилез и пастереллез) [1, 2, 6, 10].
Патогенез M. hyo представляет собой сложный процесс: в течение длительного времени в эпителиальном слое дыхательных путей образуются колонии, возникает продолжительная воспалительная реакция, иммуносупрессия, а также играет роль взаимодействие с другими инфекционными агентами вирусного и бактериального происхождения.
Источником инфекции являются больные и переболевшие животные, в организме которых M. hyo может сохраняться до 15 месяцев. Возбудитель выделяется с частицами слизи при кашле и чихании, а также с молоком и влагалищным секретом, заражение происходит преимущественно воздушно-капельным путем и при прямом контакте. Содержание зараженных и незараженных животных в одном стаде приводит к раннему и часто повторному заражению. К болезни восприимчивы свиньи всех возрастов, но особенно чувствителен молодняк. Инфицирование поросят происходит свиноматками-носителями во время опороса и при прямом контакте, при этом клинические признаки у поросят-сосунов могут отсутствовать, проявляясь только к 2-3-м месяцам. В этом возрасте происходит отъем поросят и объединение их для доращивания, что в свою очередь может вызывать энзоотические вспышки заболевания. Зараженность стада может сохраняться годами, вызывая значительный экономический ущерб.
Проникнув в легкие аэрогенным путем, микоплазмы в течение первых 2 недель после заражения активно размножаются на слизистой оболочке трахеи, бронхов и бронхиол, вызывая образование очажков серозно-катаральной бронхопневмонии. Затем они постепенно проникают в более глубокие части дыхательных путей и в альвеолы, вызывая воспалительные процессы, препятствующие нормальному дыханию. Вследствие этого, а также угнетения возбудителем иммунной системы, представители условно-патогенной микрофлоры (Р. multocida, S. suis, Н. parasuis, А. Pleuropneumoniae и другие) начинают неконтролируемо размножаться в альвеолах, становясь вторичными патогенами. Такая бронхопневмония, представляющая собой коинфицирование Mycoplasma hyopneumoniae и вторичными патогенами, называется энзоотической пневмонией. Патологоанатомически заболевание характеризуется серозно-катаральным воспалением легких с локализацией патологического очага в основном верхушечных и сердечных долях, воспалением плевры и перикарда, увеличением бронхиальных лимфоузлов. Трупы истощены и анемичны.
Штаммы M.hyo различаются по генетическим и антигенным свойствам. Геном M.hyo впервые был секвенирован в 2004 году для штамма 232 и затем в 2005 году для штаммов J и 7448 [11]. Роль генетического и антигенного разнообразия от штамма к штамму до конца не выяснена ни для вирулентности, ни для возможности перекрестных реакций между изолятами [15]. Заражение одним из низковирулентных изолятов M. hyo не обеспечивало защиту при последующем заражении высоковирулентным изолятом [12].
Диагностику заболевания проводят с учетом эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных [6,11,17]. В лаборатории направляют фрагменты пораженных легких, средостенные и бронхиальные лимфатические узлы, сыворотку крови больных поросят.
3 Mycoplasma vuItunL ягя!п Cb V33 i&S ntoswnal RK A gw», para-al seqtieiK«
^Mycoplasma netimlytiaiiri strain ATCC JG9SS rilwioiiidl RNA gene, partial sequence
tMyciijiiasirui neumlylicuni strain NRRC ШМ 16S ribnwninl RNA gnu:, partial sequence HMycoplasma ctlcftull strain CH l&S nbosomal RNAgene. partial sequence Ы Mycoplasma cols strain 5SB liSritesomal RNAgene. partial iequence
Mycoplasma collls Sirain 5SB ifiSriljusumaJ RNAgene. complete sequence ^MywplasmamclaK strain И542 liSribosamal RNA gi-гш. romplel? sequence — 0 J Mycoplasma lagogenitallum slraln 12MSl&S fitosomal RNA gene, partial sequence 0 Mycoplasma molar« suain HS42IGSribosoinalRNA gene, paiial sajiiHice
□ ♦Mycoplasma mobile strain 1SJK16S ntosooial RNA jcur. partial sequence ^Mycoplasma mobile strain 1MK ICS ribosomal RNA gene, complete sequence ..♦Mycoplasma indiase suain 3T16S ritosomal RNA gene, paitial sequence 0Mvcoplasmi«ale strain NBRC 14477 16S nbccomal RfíAgaie. partial sequence -9 ^Mycoplasma órale strain NC1ÜJ12 IES ribosomal RNA gene, complete sequence
-♦Mycetoma Iwixale strain CH2Q24716S ribifiumal RNAgene, partial sequence
Mycoplasma buctah strain NBRC 14&51 !6S rilwsomoi SNA gene. paitial sequence j ^Mycoplasma acserls strain 121916S rlbosomal RNA gene, partial sequent*
"♦Mycoplasma doacale suain 383ISS rihcstimal RNA gene, partial sequence ф >1 Mycoplasma phtxidw Ягап I0ó 16S ribworaal RNA gene, partial seqncitw
^Mycoplasma equlrliuiis sirain M4Í&7Í15$ ribosomal RNA gene, partial sequence ♦Mycoplasma gypisstrain В1Я1 lSSiibuunal RNA get*, partial sequence
^Mycoplasma galiiiiwum .strain MBSÍC 1485916S rihosomal RNA gwc. partial sequen« & Mycoplasma gallinanun strain PG16165 flbosomal RNA gene, complete sequence
_-♦Mycoplasma ooliimbintim strain MMP-1ICS tibasoiBai RNAgene, panial sequence
-, Mycoplasma inert strain N'BRC 1IR5316S ri luminal RNA ¡¿mil' partial seque net ♦Mvcoplasma urn strain FG3016S ribosomal RNA gate, partial sequence ■¿Mycoplasma inele^iidis strain XB3C148S2 ISS í Amamal RNA ¡¡¡ле, partial sequence vj ^Mycoplasma meleagralis strain I T52& l&S ribosamal RNA geni, partial sequence
^Mycoplasma columbJnawle «rain Й416S ribosomal F.NA gem, partial sequence
. Mycoplasma alligatoris suain A21JP216S libosomai RNA gene, partial sequeíi» j -Mvmpliwnaalligatoris strain A2IJP2 l&Sriiwsranal RNAgene, partial .iit|in:ni:i: Й Mycoplasma crocodyll sualn №14516$ ribosomal RNA gene, complete seqúense WMycoplasmairocodyll strain MP 145 IBS ribosomal RNA gene, partial sequence
Q^Mycaplaraaanatis »train MERC 5ÉS nlxweiviil RNA рте, partial sequence
•^Mycoplasma anatls strain 134016$ rlbosomsJ RNA gene, partial sequen»
_л-~—"♦Mycoplasma btiteunis sirain BbTZg I6'S ribosomal RNA gene, pslial sequence
»MycnplaBniapillft|iavui]is slniiii WR] TÉSribúSairlíd RMAgucifi, pilial sequence »Myrapliima glycophilurn strain 4Í616S ribwomal RNA gene, partol sequenrc
1 q ♦Mycoplasma mustelae suain KiX516S ribosomal RNA gene, partial sequence
Q "JM)H;oplasina felis suain ATCC 2339116S rlbflsnmal RNA ¡¡ene, ptial ski[iihiií
^Mytjoplisma cotogypsl strain BVl i 6S rlbosotnal RNA gene, partial seqiteiKi ♦Mycoplasúiaeikardii strain ATCC 234G2IGS ribasomal RNA gene, periial sequence ЙМумрЬвта cym»Cll2 sirain CI42 iftS гПюйяпа! RNA, raraplelesaqueiice ■Í ^ И Melasma суши strain HÍ31 ifóflJrosental RNA geno, [lartisl sequence
Q.MvLcplaiia cajiis strain PGI4 ISSilbosomal RNAgene. pardal sequence fl -SMycaplasnia canis strain NBRC H848 liSribasinnal RNAgene, |tariial sequence
j J \{y<-i5pinsnM ImvirhinK Mriin NI3RC1485716S ribosomal RNA gcnr. purtial scquwicf ^Mycoplasma bovlihinB strain PG4316S ribosomal RNA gate, partial sequent? ^IliiMCKini b'.rüíii DD16$ lilwwniiil RNA депе, paitial sequence
iplasma synovi» 53 strain 5316S ribnjnmai UNA, cnmplota seqwenc? e^coplasma synovia? sirain WVU1353 l&S ribosomal RNA gene, complete sequence
8Mycoplasma bovis suain PG45 IBS ribosomal RNA Reuf, complete sequetice Mycoplasma hmis strain PG4S l&S rflwsmal RNA gene, partial sequence J?Mycoplasma bovjs strain Dnwtta l&S ribosomal RNA gene, complete sequent?
•jMyrapbsna a^abctiae strain PQ2 lf>S гЯхквта! RMA ци», ]йлЫ амщепсе q - i strain PG2 l&S nlxisomal RNA gene, partial sequence
'^Mycoplasma agalacltóe snaln PG2165 ribosomal RNA gene, pardal sequence ^MycopUsiiiaprimanuii snain I1RC292 IliSiibdswiiat RNA (¡ero?, partial sequence aMyrapljstiu míenla»™ strain NBRC1484S16S ribesomal RNA gene, partial wqiiwim О у Mycoplasma maculostim strain PGI5165 ribosomal RNA gene, partial sequence ' ^Mycoplasmaleoplttfyngissiraiii 112 i6S ribusfenal RNA ^.paitial sequtite
Mycoplasinn iitumsicams strain 1 &421 &S ril»snrn;ii К NA gene, mnplrli: sequcriK J Mycoplasma stmbae strain LX155 rlbcsonwJ RNA gefle. partial sequence ■ 9Мусор1шаcaliforiklaiM ¡train SI-6 ItS libúsceiial RNA gene, paitial sequence
^Mjtoplasma limigrnimiiuni strain N'BRC 1-186216S rtarana! RNA geni:, |ailiiil wi¡nracc ^Mycoplasma bovigerutalium strain Kill iSSnlMsomal RNA gene, partial siquwra
-^Mycoplasma pbodrtiinis strain 852 JUS ribosomal RNA gene, partial sequence
- MvrupliaiiB caviac sirain Gi22 ISS ribisumiil RNA gene, partial sequent? —4 ¡jMycopiasma fermentan* JER *tra£n JERI6S ribosomal RNA. complete sequence ( a ^Mycoplasma íermeinans strain PG1S I&S titeswiHl RNA geiw, paitial seqLieix-e
Mycoplasma iennentsns strain NKRC Mfij'l ifiS rilxiKoinal KNApur. partial м(|иегке
- -^Mycoplasma llpofaclensstrain R17116S rilxKomal RNA gene, partial sequence
^Mycoplasma lipoptillum strain NERC14835 1GS ribasomal RNA gene, partial sequence -Мг-пср'ашаli|Kiphiiuni sirainMaBy USritawirnal RNAgene,cúmpleleseipiwire ■♦Mycoplasma Ityojibaryngis strain H34B16S riboscmal RNAgene. partial sequance
-SMycoplasma spbenisci suain UCMJ165 ribosomal RNA gene, complete sequence
Mycoplasma alien sirain С145 16S ribMomal RNA д«1С, |xulial stiiUHicc
♦Mycoplasma felifaudum stiffli PU IBS ribosomal RNAgene. partial sequera* ♦MycoplasmaopalescensstrainMH5408 lGSriksomalBNAgene, partial sequence - ^Mycoplasma elé|iíia¡itis suato F.42 lSSiibúsonial RNA gene, partial sequence ^ Mycoplasma e quigtmitalinm sttai nT37 l&S rittisomal R;N A gena. partial soqsiro ЦMycoplasma pulmonis suüii NBRC 14ЯЗ& IfiSilbosomal RNAgene. partial sequence '^Mycoplasma pibnonú Hcain PG31 IfiS liliovjcnal RNA рчк. partial Sequence
♦Mycoplasma ignanae strain 232716S ribosomal RNA gene, partial sequen«
JMycoplastnaliyotliiniSitrainATCC 17381 lC-Siit»somal RNA gene, partial sequence (»«раиЦВгда!)
T eMjiOplasina 1 i villi lii lis MOLD strain MCLD 3 BS ribdSomal RNA, túsufJete Sequence (iwlitcd fko j jmrar*'ftrnra mlanama «П Iuk. lincl)
У Mvcíiplísnia hyorliims strain NBRC 14858 ISS ribosomal RNA gene, partial sequence(Chibi iapan) 3Mycoplasma liyorhinisstrainBTS7 l&S tibosomal SNA get», partial sequence (Swtini © My túplasiiia liyorhinis strain RTS71 &S ribosonul RX A ¡¡ene, partial sequence fBcn. Snwrluuj - -í My™insma bywJunis HUB-1 strain HUB*I l&S ribosomni RNA, complete scqncnre (Hctel,Qurul
HMyceotasmabovocull strain M1S5j?9 16S ribosomal RNAgene, complete sequence (^¡миту^ОйдаСиИвйоп I a ^Myeoplasna bovoculi strain M16M916S ribasomal RNA gene, partial sequence íL'pcsila, StnIíbí
^Myn^lasma conjunctivae strain HRG'583 tíSnlasainal RNA gene, nnnjilete sequence {¿.швпе. SaiueiMisi Mycoplasma conjunctivae strain HRG58Í IBS ribosomal RNA gene, partial sequence (1'рря1в. S-vnJc-n) , íMjtoplasaia ovipneumaiiae strain Y-98 3 65 tibmnul RNA gene, partial sequence iUppsala. SwoJcnj
♦Mycifilauna dispar alntin4S2/21ÉS ribssmnnl RNA genii, |KiHial a4[ui:m:r|Si-c.fcil
^Mycoptasraa flocculate strain Ms42 ICS ribosomal RNA gene, complete sequence (Edmuniwi, Canada,) Э в M. hyo. ltó RNA gfBí (píete Í7, Tomsk)
♦Mycoplasma hyopneiimonlae sirain 116$ nboscfliat RNA gen?, complete sequence t^Af " OMvcoplasma hvojMeumoniae 232 suaifl 232 IfiS ribosomal RNA, complete sequence srsin. USA| ^ a M. Iiyo. Ш роге (prcihc 4, Beliwoili
3 Mycoplasma byopneiponlae strain J16$ rilwarool KNA gene, parltal wquence <Swta faiamn. B;ml)
Рисунок 1 - Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании фрагментов генома, кодирующую 16S рибосомную РНК М. hyopneumoniae. Желтым цветом выделены исследуемые
консенсусные последовательности.
Для установления диагноза используют микроскопическое обнаружение возбудителя в легких (методами прямой и непрямой РИФ, окраски по Гимзе); выделение чистых культур на средах Фриза, Гудвина и других с последующей идентификацией по культурально-морфологическим и биохимическим тестам [5,6].; определение антигенных свойств (РА); выявление специфических антител (микроагглютинация, РСК, латексагглютинация, ИФА) [4,6,13], иммуногистохимические исследования [16,18], постановку биопробы на поросятах 2-2,5-месячного возраста из
хозяйств, благополучных по энзоотической пневмонии свиней. Гибридизация in situ позволяет выявлять и определять конкретное расположение ДНК M.hyo в фиксированных препаратах легких инфицированных свиней. Возможность только посмертной диагностики и длительность выполнения методики существенно ограничили ее применение [10,11]. Широко применяемый метод оценки распространенности и тяжести пневмонии - измерение коэффициента поражения легких при обследовании приблизительно 30 животных. Системы измерения поражений легких имеют несколько модификаций и разные единицы измерения, но для любой из них характерен один и тот же недостаток: высокая субъективность визуальной оценки и возникающая в связи с этим необходимость дополнительных методов диагностики [6,7].
.Mycoplasma hyorhinis strain АТСС 17381 16S Hbosomal RNA gene. partial sequence ¡Sao Paulo, Brazil)
, Э Mycoplasma hyorhinis MCLD strain Mi II/ I II S ribosomal RNA, complete sequence ( ¡Sülatíd from a primary human mirlanoma cell I (Mycoplasma hyorhinis Strain NBRC 14858 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (Chiba, Japan I ^ Mycoplasma hyorhinis strain BTS7 IBS ribosomal RNA gene, partial sequence (Sweden)
1 Mycoplasma hyorhinis strain БТ57 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (Bern, Switzerland» ® Mycoplasma hyorhinis HUB-1 strain HUB-l 165 ribosomal RNA, complete sequence (ttubei. China)
§ Mycoplasma hovoculi strain 165/69 16S ribosomal RNA gene, complete sequence (American Type Culture Collection > Mycoplasma hovoculi strain M165/6ÍÍ 16S ribosomal RNA gene, partial sequence icppsala. Sweden) »Mycoplasma conjunctivae strain HRC/583 16.5 rlhosomal RNA gene, complete sequence (Lausanne, Switzerland)
Э Mycoplasma conjunctivae strain HRC/583 16S ribosomal RNA gene, partial sequeitce (Uppsata, Sweden) j ОMycoplasma ov¡pneumoniae strain У-ílíl 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (Uppsala, Sweden)
»Mycoplasma dispar strain 462/2 Ï6S ribosomal RNA gene, partial sequence (Sweden)
Mycoplasma flocnilare strain Ms42 1GS ribosomal RNA gene, complete sequence 1 Edmonton, Canuda) О 9 M. hyo. 16S RNA gene (probe 47. Tomsk)
»Mycoplasma hyopneumoniae J ICS riljosomal RNA gene, complete sequence (ReiMda. USA) »Mycoplasma hyopneumoniae 23? strain 232 16S ribosomal RNA, complete sequeitce (Laboratory strain, USA) •■! »M.hyo. 16S RNAgene (probo4,Belgorod)
■■•Mycoplasma hyopneumoniae strain J l&S ribosomal RNA gene, partial sequence (Santa Catarina. Brazil)
Рисунок 2 - Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании фрагментов генома, кодирующую 16S рибосомную РНК M. hyopneumoniae, (выделенная область). Желтым цветом выделены исследуемые консенсусные последовательности.
Для выявления непосредственно возбудителя энзоотической пневмонии свиней во всем мире широко используется метод полимеразной цепной реакции. Этот метод обладает высокой чувствительностью, специфичностью и достоверностью [3,11,14]. Кроме того, ПЦР позволяет обнаружить M.hyo на более ранней стадии, чем методы, для применения которых должна произойти сероконверсия. Материалом для исследования методом ПЦР являются образцы сыворотки крови, легочной ткани, трахеобронхиальные, носоглоточные смывы и мазки. С помощью этого метода изучается масштаб распространения Mycoplasma hyopneumoniae в свиноводческих хозяйствах России и молекулярно-биологические особенности отечественных изолятов данного патогена [13,14,19].
Геномы различных штаммов M.hyo различаются между собой, поэтому, необходимо проводить молекулярное типирование для оценки филогенетического родства и выявления молекулярных особенностей штаммов, циркулирующих в поголовье. Таким образом, проведение исследований молекулярной структуры возбудителя энзоотической пневмонии свиней, помогает получить новые знания о генетическом разнообразии M.hyo и разработать новые, более эффективные методы диагностики.
Исследовательская работа выполнена в лабораториях эпизоотологии, диагностики и профилактики вирусных болезней свиней, молекулярной биологии и биохимии, в лаборатории эпизоотологии ФГБНУ ВИЭВ в 2016-2017гг в рамках исполнения государственного задания по теме №0578-2014-0027. Были проведены исследования свиноводческих хозяйств Томской, Белгородской, Смоленской, Московской области и Краснодарского края. В результате исследования были получены филогенетические дендрограммы M. hyopneumoniae, циркулирующей в различных областях Российской федерации (рис. 1, рис.2). Результаты анализа показали, что M. hyopneumoniae, циркулирующая в Томской области, по фрагменту генома, кодирующему 16S рибосомную РНК, генетически близка к патогенам,
циркулирующим в Канаде и США. M. hyopneumoniae, циркулирующая в Белгородской
области по фрагменту генома, кодирующему 16S рибосомную РНК, генетически близка
к патогенам, циркулирующим в США и Бразилии.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Жбанова Т.В., Дрыгин В.В., Дудникова Н.С. Микоплазмозы свиней. 2005. 75 стр.
2. Орлянкин Б.Г. Инфекционные респираторные болезни свиней: этиология, диагностика и профилактика // Свиноводство. 2010. №3. С .67 - 69.
3. Artushin S. Development of polymerase chain reaction primes to detect Mycoplasma hyopneumoniae // Mollecular and Cellular Probes. 1993. №7. P. 381- 385.
4. Erlandson K. Evaluation of three serum antibody ELISA tests for Mycoplasma hyopneumoniae // J. Swine Health and Production. 2005. №13(4). P. 198 - 203.
5. Friis N.F. Some recommendations concerning primary isolation of Mycoplasma suipneumoniae and Mycoplasma flocculare a survey // Nord. Vet. Med. 1975. №27. P. 337 - 339.
6. Maes D., Segales J., Meyns T. et al. Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs // Vet. Microbiol. 2008. №126(4). P. 297 - 309.
7. Sibila M., Nofrarias M., Lopez-Soria S. et al.. Chronological study of Mycoplasma hyopneumoniae infection, seroconversion and associated lung lesions in vaccinated and non-vaccinated pigs // Vet. Microbiol. 2007. №122. P. 97 - 107.
8. Thacker E.L. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae // Anim. Health Res. Rev. 2004. №(2). P. 317 - 320.
9. Thacker E.L. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae / E.L. Thacker // Anim. Health Res. Rev. - 2004. - N5(2) - P. 317-320.
10. Villarreal I, Maes D, Meyns T, Gebruers F, Calus D, Pasmans F, Haesebrouck F.// Vaccine. 2009 Mar 13;27(12):1875-1879
11. Алексеева С.В. Типирование dichelobacter nodosus по гену fima/ Алексеева С.В., Сидорчук А.А., Панасюк С.Д., Забережный А.Д., Соколов М.Н., Соколова Н.А.// Ветеринария. 2011. №5. С. 27-29.
12. Алипер Т.И. ПЦР в реальном времени для диагностики туберкулеза // Ветеринарная жизнь. 2006. №7-8. С. 13.
13. Гребенникова Т. В. Молекулярные методы исследования в диагностике туберкулеза/Гребенникова Т.В., Кальнов С.Л., Забережный А.Д., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А.// Ветеринарная патология. 2004. №1-2. С. 92-93.
14. Егорова И.Ю. Генодиагностика сибирской язвы/ Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О., Колбасов Д.В., Жигалева О.Н., Цыбанов С.Ж., Потапова Н.И., Гребенникова Т. В., Забережный А.Д.// Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. 2006.№4. С. 26-28.
15. Zaberezhny A.D. Differentiation between vaccine strain and field isolates of classical swine fever virus using polymerase chain reaction and restriction test/ Zaberezhny A.D., Grebennikova T.V., Aliper T.I., Nepoklonov E.A., Kurinnov V.V., Tsybanov S.G., Vishnyakov I.F., Biketov S.F.// DTW. Deutsche tierarztliche Wochenschrift. 1999. Т. 106. №9. С. 394-397.
16. Стаффорд В.В. Иммуногистохимическая диагностика репродуктивного и респираторного синдрома свиней // Ветеринария. 2017. №2. С. 26-30
17. Стаффорд В.В. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней и цирковирусом свиней типа 2 // Ветеринария. 2016. №9. С. 24-27
18. Stafford V.V. Application of immunohistochemistry in diagnostics/ Stafford V.V.//Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2016. Т. 56. №8. С. 18-21
19. Svotina M.A., Absatirov G.G., Shalmenov M.Sh., Sidorchuk A.A., Gulyukin A.M. Epizootiological characteristics of animal rabies in the West Kazakhstan region // Biology and Medicine. 2015. Т. 7. №5. С. BM-152-15.
