CC BY
32
Статья
Несмотря на многочисленные исследования, роль белков теплового шока в этиологии и патогенезе ревматоидного артрита по-прежнему остается неизвестной. Данные, полученные при экспериментальном моделировании ревматоидного артрита (РА) у животных, позволяют предположить ведущую роль белков теплового шока семейства 60 кДа как триггера в развитии аутоиммунных процессов при РА [20]. При РА в лимфоцитах синтез индуцибельных и конститутивных (65, 70, 95, 120 кДа) HSP in vitro угнетается, степень угнетения зависит от тяжести и продолжительности заболевания. У больных РА уровень синтеза белков in vitro в лимфоцитах крови в состоянии покоя значительно снижен, в среднем на 60%. В результате теплового шока синтез конститутивных белков подавляется еще сильнее (уровень синтеза составляет около 30% от нормы), но увеличивается синтез индуцибельных HSP 65, 70, 90 кДа, хотя уровень их индукции достоверно ниже, чем в норме [21].
В настоящем обзоре представлены новейшие результаты исследования функций и механизмов протекторного действия HSP, характеризующих молекулярный уровень патогенеза заболеваний внутренних органов и оказывающих влияние на характер течения и прогноз. Отражены перспективные в плане создания новых методов лечения и профилактики заболеваний предпосылки терапевтических методов коррекции, основанные на активации эндогенных систем защиты стресс-белков.
Литература
1. Schlesinger M. et al Heat Shock from Bacteria to Man.-New York, 1982.
2. Остерман Л.А. 1983. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами.- М.: Наука.- 304 с.
3. Задорожная О.О. Стресс-белки при инфаркте миокарда: Дис... канд. мед. наук.- М.: 1999.
4. КарпищенкоА. // Клин.лаб.диагн.- 2000.- №3.- С. 10-12.
5. Feige U. et а!. Stress-inducible cellular responses.- Basel: Birkhauser., 1996.- 512 p.
6. Малышева Е.В. и др.// Бюл. экпер. биол.- 1994.- Т. 118, №8.- С. 126-129.
7. Афанасьев С.А. и др. // Биохимия.- 1996.- Т. 61, Вып.
10.- С. 1779-1784.
8. Beckmann R.P. et а1 // Science.- 1990.- Vol. 248.- P. 850.
9. R.J., Arnold J.. et al. // Biochem. Biorhys. Acta.- 1991.-Vol 1089, №13.- P. 141-157.
10. Sarge K., et ál // Molec. Cell. Biol.- 1993.- Vol. 13.-P. 1392-1407.
11. Delogu G. et al. // J. Crit. Care.- 1997.- № 12.- Р. 188-192.
12. Малышев И.Ю., Малышева Е.В. // Бюл. эксперим. биол. мед.- 1998.- Т.126.- С. 604-611.
13. Ивашкин В.Т., Задорожная О.О. // Клин. мед.- 2001.-№2.- С.33-37.
14. Craig E.A. et а1 // Cell.- 1994- Vol. 78.- P. 365-372.
15. Guzhova I.V. et al // Cell. Stress Chap.- 1997.- Vol. 2, № 2.- P. 132-139.
16. Демидов О.Н. Система белков теплового шока 70 кДа у кардиохирургических больных: Автореф. дис. канд. мед. наук.-СПб, 1999.
17. SanchezE.R. et а1 // Biochem.- 1990.- Vol. 29.- P. 5145.
18. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. // Вест. Рос. АМН.-2005.- №7.- С. 40-46.
19. ThomasX. et al. // Hematol.- 2005.- №10(3).- P. 225-235.
20. Holoshitz J. et аl. //J. Clin. Invest.- 1994.- Vol. 73.-P. 211-215.
21. Исламов Б.И. и др. // Бюлл. экспер. биол. и мед.- 1999.-Т. 128, №1.- С. 525-528.
HEAT SHOCK PROTEINS: PHYSIOLOGICAL ROLE, DETECTION TECHNIQUE AND CLINICAL VALUE
O.V. CHIRKOVA Summary
The article represents the role of heat shock proteins (HSP) in the number of biological processes (both under normal conditions and stress): proteins synthesis and their transport through intracellular membranes; in the renaturation of the denaturated and aggregated protein. Also, it describes the protective action of inducible HSP in stressful conditions - cell protection from ischemia, influence on the
apoptosis process, restoration of mitochondrial functions after ischemic affection.
Key words: review, heat shock proteins, stress factors
УДК 546.33+546.32]:541.32:548.56
ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ПАРАМЕТРОВ СПЕКТРА АКТИВНОСТИ ИОНОВ ВОДОРОДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
II. ИНДИКАТОРНЫЙ МЕТОД
И. Г. ГЕРАСИМОВ, А. В. ЧУГАЙ*
Наличие в биологических жидкостях ионов водорода (Н+), различных по величине коэффициента активности - спектра активности Н+ (САИВ) - дает организму возможности осуществлять биорегулирование при его посредстве [1-3]. На формирование САИВ влияют другие, даже близкие по природе, ионы, например, натрия (Ка+) и калия (К+). Они неодинаково изменяют состояние Н+, по-видимому, по причине разной степени гидратации (у Ка+ она больше, чем у К+) [4-7]. Подходы к разработке параметров САИВ только начинают разрабатываться, и в [8] оценены некоторые из них с помощью электрохимического метода. Рассчитаны константы скорости (кі) и эффективные энергии активации (Е ) процесса диффузии Н+ в мембрану измерительного электрода в фосфатных буферах (ФБ) с pH, близким к физиологическому, содержащих только Ка+ или только К+, либо одновременно Ка+ и К+ в концентрациях и при pH, близких к вне-и внутриклеточным. Показано, что в ФБ с Ка+ активность Н+ выше в 1,3 раза, по сравнению с ФБ, содержащим К+, что объясняется разной степенью гидратации ионов, а значение энергии активации процесса диффузии согласуется с энергией активации Ка+-,К+-обмена в эритроцитах. Различия в активностях Н+ в ФБ разной природы подтверждены методом ЯМР. Вместе с тем в растворах, моделирующих вне и внутриклеточный состав, несмотря на различия pH, величины кі и Е близки между собой. Следует заметить, что кі характеризует преимущественно Н+ с относительно низкой активностью. Поэтому для оценки параметров САИВ могут быть полезны другие подходы.
Помимо электрохимического метода и ЯМР, для измерения pH применяют индикаторный метод. Имеется данные, что от метода измерения pH зависит определяемая концентрация Н+ ([Н+]). Значения pH, полученные электрохимически и индикаторным метом отличаются в пределах одного порядка [9]. Величины вне- и внутриклеточного pH различаются между собой на 0,1-0,2 в зависимости от применяемого индикатора [9, 10]. Параметры САИВ оценены помощью индикаторного метода.
Экспериментальная часть. Исследовали такие же, как в [8], ФБ (0,086 М) с pH = 7,2 (І-ІІІ) и 6,8 (IV); ФБ I содержал только №+, ФБ II - только К+, ФБ III и IV - и №+, и К+. Солевой состав и pH ФБ III близок к внеклеточным, а в IV - внутриклеточным. Измеряли оптическую плотность (Э) растворов индикаторов (Ind) фенолового красного, конго красного, фуксина основного, нейтрального красного (0,01 - 1 г/л), приготовленных на основе ФБ, а также водных растворов ^20^07, К2СГ2О7 и КМПО4 (10-4 моль/л, pH = 5,3 ( 0,05) и растворов Ind в ацетонитриле. Электронные спектры снимали при Т = 293° (2 К на СФ-46 в видимой и ближней УФ-области областях в диапазоне длин волн 250-620 нм. Площади спектров рассчитывали методом ступенчатой аппроксимации [11]. Измеряли pH на «pH-150». Среднее и его доверительный интервал рассчитывали с Р = 0,95.
Результаты. Исследование электронных спектров Ind в ФБ в зависимости от сопутствующего катиона может дать информацию о параметрах САИВ. Известно [4], что Ка+ и К+ в разной мере изменяют отношение коэффициентов активности двух форм Ind, и поэтому при определении pH с помощью Ind вводится солевая поправка, учитывающая смещение их кислотноосновного равновесия [4]. Но влияние катионов на Э растворов Ind может быть обусловлено степенью гидратации Ка+ и К+, что соответственно влияет на активность Н+ и параметры САИВ.
* НИИ медицинских проблем семьи ДГМУ им. М. Горького, 83015, Донецк, ул. Левицкого, 4, Украина
Статья
Рис. Спектры растворов конго красного в ФБ I (1) и II (2) (0,15 г/л) и в ФБ III (3) и IV (4) (0,1 мМ/л)
На рис. на примере конго красного представлены типичные электронные спектры растворов Ind. В исследованной области длин волн наблюдаются два пика, соответствующие связанной с Н+ и несвязанной с ним формам. Как видно из рисунка, в растворах с Na+ максимальная D (Dmax) и ширина на полувысоте больше по сравнению с этими характеристиками спектра в растворах с K+. Отношения площадей спектров поглощения растворов всех исследованных Ind в ФБ, содержащих Na+ и K+, в пределах погрешности равны отношению, полученному в
соответствующих ФБ для ki [8], и между собой (для кислой формы - 1,2±0,13, для основной - 1,3±0,15). Равенство
отношений площадей спектров поглощения в случае разных Ind не может быть обусловлено влиянием ионной силы на константу равновесия между двумя формами Ind или влиянием катиона на хромофорную группу, т.к. различные Ind требуют разной солевой поправки [4]. То же отношение площадей (1,3) получено для спектров поглощения в ФБ I и II перманганата калия и бихроматов независимо от того, Na+ или K+ содержала соль. Т.е., имеется проявление влияния степени гидратации Na+ и К+ на активность H+ в растворе. Поэтому в ФБ с Na+, который гидратирован в большей степени, чем К+, при одинаковом pH, определенном электрохимически, с хромофорными группами Ind может связать больше Н+, активность которых выше, чем в ФБ с К+. Параметры электронных спектров поглощения растворов, как и кь найденная по [8], являются проявлением САИВ и могут быть его интегральными характеристиками.
Обращает на себя внимание, что параметры САИВ, полученные электрохимически [8], и площади спектров Ind для ФБ I и
II примерно равны отношению ионных радиусов К+ и Na+, рассчитанному по данным, приведенным в [12] (1,34±0,0079), и отношению радиусов комплексов ион-растворитель для Na+ и К+, рассчитанных по данным [5], которое составило 1,3. Кроме того, рассчитанное по данным [6], отношение изобарических коэффициентов объемного расширения свободного растворителя для водных растворов NaCl и KCl, характеризующих, по мнению авторов, своеобразный «фазовый переход» при образовании растворов, также равно 1,3. Отношения гидратированных радиусов Na+ и К+ и энтальпий гидратации этих ионов, рассчитанные по [13] и [14] соответственно, равны 1,3. Все эти отношения одинаковы и согласуются с отношениями параметров САИВ, полученными электрохимически и спектрофотометрически. Активность H+ и их спектр определяются степенью гидратации сопутствующих ионов, а исследование электронного поглощения Ind в растворах позволяет оценить параметры этого спектра.
Можно получить равные площади под электронными спектрами ФБ I и II, изменяя их D добавлением одного из компонентов ФБ, но тогда [H+], определенные электрохимически, будут отличаться в 1,3 раза. Перекрывание электронных спектров кислой и щелочной форм Ind происходит в областях, соответствующих более активным H+, параметры которых, как и при электрохимическом подходе [8], оценить затруднительно. Такое положение вынуждает к поиску других Ind, например таких, у которых поглощает только одна (предпочтительно - кислая) форма. Полное удаление из раствора протонов и ионов гидроксила не позволяет решить эту задачу, т. к. в нерастворенном Ind уже содержатся и кислая, и щелочная формы, на что указывает наличие двух пиков поглощения Ind в апротонном растворителе (ацетонитриле). Применение таких окрашенных солей, как би-хроматы или перманганаты, у которых щелочной и кислый пики поглощения сильно накладываются друг на друга, может быть выходом из положения только в случае модельных растворов, т.к. эти соединения имеют значительную окислительную активность.
Спектры поглощения в видимой и ближней УФ областях растворов Ind в ФБ, с соответствующими вне- и внутриклеточ-
ными концентрациями Na+, К+ и pH, изменяются качественно и количественно по сравнению с ФБ I и II. На рисунке вновь на примере конго красного представлены типичные электронные спектры Ind в ФБ III и IV. Поскольку D всех четырех ФБ близки между собой при одной длине волны и одинаковых концентрациях Ind, то для наглядности на рисунке приведены спектры при разных концентрациях Ind в ФБ I и II и ФБ III и IV. Отношения площадей спектров поглощения в ФБ III и IV для всех исследованных Ind в пределах погрешности расчета равны между собой и составляют 1,04±0,043. Разумеется, численное значение отношения в какой-то мере зависит от концентраций Na+, К+ и Н+. Важно, что интегральные активности Н+, оцененные с помощью Ind, в ФБ III и IV близки между собой, несмотря на значительное различие величин pH, полученных электрохимически. При последнем методе измеряется число Н+, диффундирующих из раствора, а при первом - их количество в среде; результат указывает, что в моделирующем внутриклеточный ФБ IV имеется больше Н+, неспособных к диффузии в этих условиях по сравнению с моделирующим внеклеточный состав ФБ III. Возможно наличие в клетке большего, чем во внеклеточной среде, объема Н+ с низкой активностью. Это перераспределение имеет физиологический смысл в связи с потребностью ограничить активность Н+ внутри клетки для нормального протекания биохимических процессов.
Качественные изменения электронных спектров Ind, в ФБ, содержащих и Na+, и К+ заключаются в том, что в области Dmax поглощения кислой и щелочной форм величины D в случае ФБ
III выше по сравнению с ФБ IV. Помимо известных причин, обуславливающих размытость электронных спектров [15], величина D в области Dmax определяется статистически концентрацией форм Ind, связанных с Н+ средней активности. В областях, соответствующих «хвостам» кислой и щелочной форм, D определяется связыванием с Ind преимущественно высоко- и низкоактивных Н+, которые в случае ФБ III (внеклеточный состав), имеют D выше по сравнению с ФБ IV (внутриклеточный состав). Более высокая во внутриклеточной среде [Н+] (меньший pH, определенный электрохимически) реализуется одновременно с выравниванием Н+ по активности, а во внеклеточной среде распределение Н+ по активности менее равномерно. В ФБ IV меньшая ширина на полувысоте, по сравнению с ФБ III, указывает на меньшую размытость спектров поглощения Ind, т. е. на большую однородность Н+ в моделирующем внутриклеточный состав ФБ.
Заключение. Спектрофотометрический и электрохимический подходы, позволяют оценить параметры САИВ. Результаты указывают на влияние ионов Na+ и К+ на распределение Н+ по активности. Моделирование внутри- и внеклеточного состава Na+, К+ и Н+ подтверждает, что ряд параметров САИВ вне и внутри клетки одинаковы.
Литература
1. ГерасимовИ.Г. //ВНМТ.- 1999.- Т. 6, № 1.С. 143-145.
2. Герасимов И.Г. // ВНМТ.- 1999.- Т. 6, № 3-4.- С. 12-15.
3. Герасимов И.Г. // ВНМТ.- 2000.- Т. 7, N 2.- С. 26-28.
4. Баньяни Е. Кислотно-основные индикаторы / Индикато-ры.Т. 1.- М.: Мир, 1976.- С. 92-246.
5. Кузнецова Е. М. Теоретическое описание температурной зависимости предельных значений эквивалентной электропроводности однозарядных одноатомных ионов в водных растворах // Ж. физ. химии.- 1999.- Т. 73, № 12.- С. 2280-2282.
6. Термодинамические характеристики неводных растворов электролитов: Справочник.- Л.: Химия, 1984.- 304 с.
7. Антомонов Ю. Г. Биокибернетика. Бионика.- Киев, 1970.- С. 150-155.
8. Герасимов, И. Г. // ВНМТ.- 2006.- Т. 12, № 1- С. 136138.
9. Hannan S. F., Wiggins P. M. // Biochim. Biophys. Acta.-1976.- Vol. 428, № 1.- P. 205-222.
10. Wang Z. H. et al. // Cytometry.1990.- Vol. 11, № 5.-P. 617-623.
11. Орнатский П. П. Теоретические основы информационно-измерительной техники.- К.: Вища школа, 1976.- 431 с.
12. Краткий справочник по химии / Под ред. А. Т. Пили-пенко.- Киев: Наук. думка.- 987.- 830 с.
13. Барковский Е. В. и др. Введение в химию биогенных элементов и химический анализ.- Минск: Вышэйша школа, 1997.- С. 23.
14. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам.- М.: Мир, 1980.- 662 с.
15. Драго Р. Физические методы в химии.- в 2-х тт.- Т. 1.-М.: Мир, 1981.- 423 с.
