CC BY
213
Статья
Исследования проведены на 60 крысах-самцах линии Вис-тар в шести группах (по 10 животных в каждой). Первую группу составили интактные крысы (фон), во вторую группу включены крысы, получавшие 6% водную взвесь ирлита-1 в количестве 2,5% массы тела через зонд в желудок через день в течение 2-х месяцев, третью группу составляли крысы с ежедневным энтеральным введением в течение двух месяцев хлорида ртути в дозе 0,5 мг/кг в день (в расчете на металл); в четвертую группу вошли крысы, получавшие энтеросорбент ирлит-1 одновременно с хлоридом ртути в тех же дозировках, пятую группу составляли животные с интрагастральным ежедневным введением хлорида кобальта в дозе 0,2мг/кг (в расчете на металл), животным шестой группы вводили водную взвесь ирлита-7 в количестве 2,5% массы тела через зонд в желудок через день в течение 2-х месяцев одновременно с ежедневным введением хлорида кобальта в дозе 0,2 мг/кг. У контрольных и опытных животных по истечении 2 мес. опыта содержание ртути в биоматериале (почки, кал, моча) определялось методом «холодного пара» (беспламенным вариантом атомно-абсорбционной спектрометрии) на установке «Квант-2», содержание кобальта в тканях (печень и почки), в плазме крови, моче и кале определяли с помощью масс-спектрометра ІСР-М8 НР 4500 «Хьюлетт-Паккард» в лаборатории ФГУ «Центр изучения, использования и охраны водных ресурсов РСО-А».
0.22-|
нЬ
0.12'
0.02-1-
0.0110.0060.001 - -0.0010-Г
0.0005-
0.0000-
I
■
фон ■ фон+ирлит з2мес(Нд02)
8 2мес(HgCl2+ирлит)
-1.25-1
3.20^
3.15^
5.10-1-
0.10-Г
0.07J
0.04J
0.01 -I-
L
5.04
0.01
0.010
0.005
0.000
«Si
Ш
Рис. 1. Изменения экскреции ртути с мочой и ее концентрации в кале у крыс через 2 месяца интрагастрального введения 0,5 мг/кг хлорида ртути и применения ирлита
Проведенные исследования показали, что применение взвеси ирлита-1 практически не меняет концентрацию ртути в ткани почек, моче и кале у контрольных животных по сравнению с фоном. Вместе с тем, у животных спустя 2 месяца введения хлорида ртути в ткани почек происходит накопление огромных количеств ртути (фон - 0,072±0,01; опыт - 21,58±3,456 мкг/кг; р <0,001), что подтверждает существующий взгляд о преимущественном накоплении ртути в ткани почек. Резко повышается и содержание ртути в моче и кале (рис.1). Применение ирлита одновременно с введением хлорида ртути в 3 раза снизило накопление ртути в ткани почек, повысив ее концентрацию в моче более, чем в 10 раз (по сравнению с крысами, получавшими только хлорид ртути), и в кале почти в 5 раз.
Анализ содержания кобальта при дозировке введения 0,2 мг/кг также выявили выраженное накопление металла в тканях печени и почек и повышение его концентрации в кале и моче. Применение ирлита вместе с введением хлорида кобальта существенно понизило накопление металла в ткани печени (с 0,162±0,022 до 0,061±0,005 мкг/г; р<0,001) и почек (с 0,214±0,02 до 0,090±0,01; р<0,001). При этом содержание кобальта в кале резко возрастало (рис.2), а в моче снижалось, что говорит о явном влиянии ирлита на экскрецию кобальта с калом.
Снижение экскреции кобальта с мочой, видимо, было связано с уменьшением его концентрации в плазме крови под влиянием ирлита-7 (1,7±0,22 в фоне; 12,0±3,4 через 2 мес. введения, р<0,01; 3,37±0,52 мкг/л при использовании ирлита-7, р <0,05).
Содержание кобальта в кале при введении 0,2 мг/кг
X
I I фон
I 11 месяц СоОІ2
ЦЩ 1 мес. CoCІ2+Ирлит-7
^■2 мес. Cod2
1=12 мес. CoC2 + Ирлит-7
Экскреция кобальта с мочой при введении 0,2 мг/кг
І Іфон
I 11 месяц Со^
■ 1 мес. CoCІ2+Ирлит-7 2 мес. Cod2 1=12 мес. CoC^ + Ирлит-7
Рис.2. Влияние применения ирлита-7 на экскрецию кобальта с мочой и его содержание в кале при дозировке 0,2 мг/кг
Полученные нами результаты подтверждают сведения о сорбционных свойствах природных глинистых минералов ирли-тов [1, 4]. Очевидно, часть ионов металлов связывается энтеросорбентом и экскретируется с калом. Об этом говорят данные, что в сорбентах на «выходе» через ЖКТ, содержится больше ионов, чем до попадания в организм [5]. Результаты позволяют считать целесообразным использование природных минералов ирлитов для поддержания гомеостаза, профилактики накопления металлов в тканях и снижения вызываемой ими интоксикации.
Литература
1. Тезиев Т.К. и др. // Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф.: Экологически безопасные технологии в сельскохозяйственном производстве XXI века.- Владикавказ, 2000.- С.478.
2. Брин В.Б., Кокаев Р.И. // Владикавказский медикобиологический вестник.- 2003.- Т. III, вып. IV.- С. 178-180.
3. Цогоев В.Б., Бекузарова С.А. Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф. «Экологически безопасные технологии в сельскохозяйственном производстве ХХ!века».- Владикавказ: Иристон, 2000.- С.378.
4. Brin V.B. et al. Abstracts of Sixth International Nickel Conference.- Murmansk, 2002.- P.79.
5. Бирагова Н. Ф. // ЭкиП: Экология и промышленность России.- 2004.- №2.- С. 15-16
УДК 616.153.96-001.16-07-08
БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА: ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ, МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
О.В. ЧИРКОВА*
Живая клетка, как и организм, способна защищаться от перегрева, гипоксии, аноксии и др. повреждающих факторов путем включения молекулярных систем защиты. Одно из общих свойств клеток живых организмов состоит в том, что в ответ на рост температуры, как повреждающего агента, они включают синтез специфического набора белков, которые помогают клетке выжить в условиях температурного стресса и вернуться после его прекращения к нормальной жизни. Сходство аминокислотной последовательности (гомология) ряда из них у разных организмов говорит об их консервативности в эволюции, характерной для жизненно важных белков. Именно с этим типом белков, с т. н. белками теплового шока (Heat Shock Proteins, HSP), или белками
20-
10-
о
* Гомельский государственный медуниверситет
Статья
стресса, связывают развитие феномена адаптационной стабилизации структур при экстремальных состояниях.
Своим названием HSP обязаны случайному обстоятельству, а именно тому, что впервые они были обнаружены в клетках, подвергнутых тепловому воздействию. Это произошло в лаборатории генетики и биофизики в Неаполе в 1962 г., когда Ritossa F. обнаружил, что кратковременный подъем температуры вызывает образование пуфов на хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster. Позже было установлено, что образование пуфов сопровождается ростом синтеза HSP. Проведенный в 1974 г. электрофоретический анализ продуктов генов, локализованных в пуфах, показал, что существует несколько групп HSP, каждая из которых соответствует определенному семейству генов.
Для понимания значения HSP в развитии представлений о природе клеточного ответа на изменение внешних условий среды важным представляется определение нескольких моментов: HSP были обнаружены во всех клетках и организмах, изученных к настоящему времени, т.е. экспрессия этих консервативных белков является общим признаком реакции живых систем на неблагоприятные факторы внешней среды [1]; установлено, что стрес-сорные факторы: тепло; гипоксия, аноксия, ишемия; магнитное поле, радиоактивное излучение, ультрафиолетовый свет; гипер- и гипоосмолярность; окислительный стресс; инфекции, некоторые вирусы; лихорадка, воспаление; гемодинамический стресс; мутагены, канцерогены, тератогены; алкоголь, никотин, металлы (Cd2+; Cu2+; Zn2+; Pb2+), фенол; инсектициды, пестициды и др.)
- способны индуцировать синтез HSP, что демонстрирует универсальность этого механизма клеточного ответа на стресс; выяснилось, что HSP могут существовать в клетках в нормальных условиях или их уровень может модулироваться агентами, стимулирующими в клетке нормальные физиологические процессы: дифференцировка, пролиферация и апоптоз. Это свидетельствует об универсальности феномена HSP, что основывается на их высокой консервативности (60-70% гомологии между белками эукариот и 40-60% - между белками прокариот). Еще одним открытием явилось то, что после воздействия теплового шока клетки приобретали устойчивость не только к последующему более сильному тепловому воздействию, но и к др. видам стресса. Этот феномен получил название «кросс-толерантность».
С момента, когда в 1974 г. была доказана индукция HSP в клетках плодовой мушки, обновился арсенал методов, с помощью которых фиксируется резкое увеличение синтеза HSP или накопление этих белков. Впервые синтез HSP был выявлен с помощью анализа вновь синтезированных белков, включивших радиоактивную аминокислоту-предшественник [6]. Метод заключается в том, что клетки или ткань инкубируются с аминокислотами, помеченными изотопами 14С или 35S. Меченые аминокислоты попадают в течение мс в клетки и включаются далее во вновь синтезирующиеся полипептиды. В этом случае метятся только те белки, синтез которых нужен клетке в период инкубации с меткой; именно в число этих белков попадают HSP. Затем обрабатываемый материал подвергают электрофорезу и экспонируют с рентгеновской пленкой. На пленке после экспозиции могут быть видны зоны, которые соответствуют полипептидам, синтезированным в период мечения [2]. Подобную методику с использованием меченых радиоизотопов предлагали и др.е исследователи с вовлечением различных факторов при индукции и синтезе HSP. Кроме методов определения индукции HSP используются технологии определения объемов HSP в клетке, т.к. для функционирования в условиях действия стрессорного фактора клетке, по-видимому, требуются значительные количества HSP. Уровень накопления белка принято оценивать с помощью иммуноблоттинга, ИФА или теста иммунопреципитации. Метод иммуноблоттинга (вестерн-блотт-анализ) [3, 4] включает в себя электрофоретическое разделение клеточных белков, перенос их на нитроцеллюлезную мембрану, инкубацию последней с антителами, узнающими определенный белок, и со вторыми антителами, связанными с ферментативной или радиоактивной меткой и направленными против первых. В зависимости от типа метки блотт далее помещают в раствор, содержащий субстрат фермента и хромоген. С помощью иммуноблоттинга можно выявить пикто-граммовые количества белка и тончайшие изменения в уровне последнего в клетках под воздействием стрессорного фактора.
Самым подходящим для точного количественного анализа уровня HSP является метод ИФА. Существует ряд разновидностей систем ИФА, но предпочтительным ввиду большей чувстви-
тельности считается набор типа «сэндвич», в котором молекулы антигена захватываются антителами, связанными с твердой подложкой, и узнаются другими антителами, направленными к альтернативному эпитопу и конъюгированными с ферментом. Для определения анти-HSP 60 IgG используется метод твердофазного ИФА (Enzyme-linked immynosorbent assay — ELISA). Тест иммунопреципитации можно использовать для определения как мощности синтеза HSP, так и уровня их накопления, но ввиду своей трудоемкости данный метод крайне редко используется для анализа эффективности синтеза или накопления белков. Однако комбинацию иммунопреципитации и иммуноблоттинга часто применяют для выявления белков, связанных с антигеном. Для определения динамики экспрессии HSP на клеточно-тканевом уровне обычно необходимы методы иммуноцито- или гистохимии, а для анализа уровня HSP в клеточной популяции используется проточная флуорометрия. Все эти иммунохимические методы требуют высокоспецифичных антител [8].
Реакция клетки на какое-либо воздействие или фактор распадается на ряд отдельных молекулярных процессов, одним из которых является индукция HSP. В клетках человека выявлено 11 генов, кодирующих HSP. Все HSP можно разделить на ряд групп в соответствии с молекулярными массами составляющих их белков. В эукариотической клетке тепловой шок или иной вид стресса способен вызвать синтез HSP: HSP 100/110, HSP 90, HSP 70, HSP 60, HSP 40, HSP 25/27 и HSP 10 [5]. Каждое семейство представляет собой продукт группы родственных генов, и степень гомологии между отдельными членами семейства бывает очень высокой. Между членами разных семейств никакой гомологии не прослеживается [12]. Признана важная роль HSP 70 в развитии патологических состояний [6]. Семейство HSP 70 млекопитающих включает 4 белка:
- HSP 72 - основной белок, индуцируемый различными стрессорными факторами (тепловым шоком, тяжелыми металлами и аналогами аминокислот, ишемией). Локализуется в основном в цитоплазме, при определенных условиях обнаруживается в ядре. При стрессе участвует в предотвращении денатурации/агрегации цитоплазматических, ядерных и мембранных белков, а также в разборке агрегатов денатурированных белков в период восстановления после стресса;
- HSP 73 - конститутивный белок цитоплазмы и ядра, участвует в лизосомальной деградации белков, биосинтезе, сборке и транслокации полипептидов, транспорте нуклеофильных белков;
- ГРБ 75 - конститутивный глюкозорегулируемый белок матрикса митохондрий. Он является необходимым элементом транслокационной «машины» и участвует в сборке митохондриальных белков и олигомеров;
- ГРБ 78 (Grp 78, BiP) - конститутивный глюкозорегулируемый белок матрикса эндоплазматического ретикулума. Как и ГРБ 75, участвует в транслокации белков и сборке олигомеров.
Также семейство HSP 70 делится на две группы: конститутивные и индуцибельные. Конститутивные HSP 70 при стрессе слабо индуцируются, имея высокий базальный уровень. Синтез индуцибельных HSP 70 резко увеличивается при стрессе, практически отсутствуя в нормальных условиях66. Особенностью генов индуцибельных HSP является отсутствие интронов - не кодирующих участков гена, требующих сплайсинга после транскрипции мРНК. В связи с этим нарушение сплайсинга, в частности, при тепловом шоке блокирует процессинг большинства генов, но не генов индуцибельных HSP. Индуцибельные HSP 70 при двухмерном электрофорезе располагаются на участке с границами по молекулярной массе от 62 до 78 кДа, а по рН от 6,5 до 5,5 и представлены пятью изоформами [7]. Первые три изоформы являются кислыми, остальные - щелочными.
Белки семейства HSP 70 участвуют во многих клеточных процессах, как в нормальных условиях, так и при стрессе. Наиболее важной функцией HSP 70 является участие в синтезе белков и их последующем транспорте через внутриклеточные мембраны. HSP 72 и HSP 73 ассоциируются с вновь синтезирующимися полипептидами в тех областях, где может произойти нежелательное гидрофобное слипание пептидных цепей друг с другом. Далее, благодаря энергии АТФ они транспортируют белковую цепь к митохондриям, эндоплазматическому ретикулуму, комплексу Гольджи, где передают белковую цепь на другой HSP через мембрану. Далее HSP органелл регулируют формирование окончательной структуры белка [8]. Функции, которые HSP выполняют в регуляции правильного свертывания вновь синтези-
Статья
рованных белков и в дезагрегации аномальных белковых агрегатов, обозначают как шаперонные функции, а сами HSP часто называют шаперонами (фр. chaperon - пожилая дама, сопровождающая молодую девушку на балы). HSP 70 принимают участие не только в синтезе, но и в деградации внутриклеточных белков, так как после дезагрегации не все белки обретают нативную структуру. Существует ряд способов утилизации необратимо поврежденных протеинов. HSP 73 участвуют в лизосомальной деградации клеточных «шлаков», обеспечивая транспорт денатурированного белка к лизосомам. HSP 72 способствуют доставке комплекса протеолитических ферментов к поврежденным протеинам, участвуя в убиквинтин-зависимом протеолизе [9].
В норме часть внутриклеточного пула HSP 70 находится в комплексе с фактором теплового шока (ФТШ). Стрессорное повреждение клетки приводит к частичной денатурации ряда внутриклеточных белков. Происходит обнажение гидрофобных областей, благодаря которым поврежденные протеины слипаются с образованием нерастворимых агрегатов, с которыми связываются HSP 70, высвобождаясь из комплекса ФТШ, предотвращая дальнейшую денатурацию белков и образование агрегатов. Далее с участием HSP 40, белков хип/хоп и АТФ происходит реактивация денатурированного белка. Отмечено протективное действие HSP даже в отсутствие АТФ-связывающего домена. Этот эффект обусловлен тем, что связывание и гидролиз АТФ HSP не влияют на взаимодействие с денатурированными протеинами и предотвращение агрегации, а гидролиз АТФ нужен для диссоциации комплекса «HSP 70 - субстрат». Свободный ФТШ тримеризуется, фосфорилируется и накапливается в ядре, где взаимодействует со специфической нуклеотидной последовательностью элементов теплового шока, что ведет к активации генов HSP 70 [10]. Объем информации о структуре, функциях, механизмах синтеза и накопления HSP в норме и при стрессе привлекают внимание специалистов из разных областей медицины, экологии, ветеринарии и фармакологии. Применение HSP в медицине основывается на трех положениях. Во-первых, гены HSP экспрессируются в клетках, претерпевающих стресс, и поэтому возросшее количество этих белков может служить показателем ответа организма на повреждающие факторы. Во-вторых, HSP 27, HSP 60 и HSP 70 обладают защитной функцией, и, вызывая рост уровня этих белков, мы можем защитить клетки от патогенов и токсических воздействий. В-третьих, HSP 70 обладают высокой шаперонной активностью, и их можно применять для создания комплексов с другими белками, например в качестве ко-вакцин [8].
Характер возможных трансформаций количества HSP изучается очень интенсивно, можно найти работы по анализу его концентрации при широком спектре заболеваний - от септического шока до нейротравмы [11, 12]. При хронической ишемической болезни сердца в миокарде человека накапливаются кислые изоформы индуцибельных HSP 70, описано появление индуци-бельных HSP 70 в лимфоцитах периферической крови у больных острым инфарктом миокарда [13]. Многочисленные экспериментальные исследования показали, что рост количества HSP может защитить сердце от последующей ишемии. Защитная роль HSP 70 была выявлена в исследованиях как на культурах клеток, так и in vivo. Крысиные клетки, экспрессирующие высокий уровень человеческого HSP 70, лучше защищены от тяжелого метаболического стресса. Подобно этому культура миогенных клеток, трансфецированная плазмидой с геном HSP 70 (трансфекция -метод переноса генов в клетку), обладает лучшей выживаемостью к индуцируемой ишемии. Одно из предположений состоит в том, что HSP 70 играет основную роль в ренатурации денатурированного, неправильно свернутого или агрегированного белка, восстанавливая тем самым активность макромолекулы [14]. Другая возможность состоит в том, что HSP 72, как и HSP 73, могут облегчать перенос митохондриальных энзимов от места трансляции в митохондрии. Возросшая способность к «импорту» заново синтезированных протеинов в митохондрии может вносить вклад в восстановление митохондриальных функций после ишемического повреждения. Повышение концентрации HSP защищает клетку и от апоптоза. Предполагается, что в основе этого явления может лежать как неспецифическая шаперонная функция HSP по предотвращению денатурации белков, так и непосредственное участие HSP в специфических сигнальных каскадах программируемой клеточной гибели [15]. Исследования по оценке жизнеспособности пораженного при инфаркте миокарда с использованием определения HSP определили, что система
синтеза Н8Р 72 является составной частью многокомпонентного ответа у больных постинфарктным кардиосклерозом с признаками хронической сердечной недостаточности, который включает как снижение, так и увеличение способности организма к продукции Н8Р 721 лимфоцитами периферической крови и целесообразности использования данного показателя для дополнительной характеристики особенностей течения постинфарктного кардиосклероза, и его прогностической оценки. Проводилась оценка Н8Р 70 у кардиохирургических больных, оперированных с использованием искусственного кровообращения, в результате получены данные о целесообразности разработки средств, направленных на увеличение содержания Н8Р 72 в миокарде, о и применении их в период предоперационной подготовки кардиохирургических больных в связи со значительным снижением степени повреждения миокарда, вызванного неблагоприятными воздействиями искусственного кровообращения, при более высоком исходном уровне содержания И8Р 72 [16].
Опубликованы данные исследований по оценке степени выраженности атеросклероза в связи с количественной оценкой HSP, где было показано увеличение растворимых форм Ы8Р 60 как основного маркера атеросклеротического поражения сонных артерий. Данные исследований свидетельствуют о связи повышения уровня Н8Р 70 с развитием эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью (ГБ). Индуктором синтеза Н8Р 70 в миокарде и сосудах при ГБ является фактор механического стресса, связанный с циклическим растяжением стенок сердца и сосудов, а также с напряжением сдвига на эндотелии, вызванным движущимся потоком крови. Рост уровня индуци-бельной формы Н8Р 70 в сыворотке крови является маркером патологической гипертрофии левого желудочка при ГБ и может быть отражением поражения органов-мишеней. Н8Р 70 входят в состав глюкокортикоидного [17] и прогестеронового рецепторов, тем самым, участвуя в стабилизации последних.
Большой интерес представляет определение возможной взаимосвязи синтеза белков теплового шока и началом, прогрессированием и течение болезни Альцгеймера. При болезни Альцгеймера стресс-белки оказывают, прежде всего, нейропротектор-ное влияние. Известны следующие механизмы их защитного эффекта. Это: 1) ограничение апоптоза; 2) ограничение гиперпродукции N0; 3) дезагрегация внеклеточных ^-амилоидных агрегатов; 4) усиление выведения р-амилоида из межклеточного пространства; 5) ограничение гиперфосфорилирования тау-белка; 6) защита нейронов от токсических эффектов глутамата; 7) ограничение внутриклеточной цитотоксичности ^-амилоида. Стресс-белки Н8Р 70 представляют собой важную эндогенную систему защиты нейронов при болезни Альцгеймера, которая реализует свое защитное действие на нескольких уровнях молекулярного механизма этого заболевания [18].
Важным и перспективным представляется вопрос использования Н8Р в онкологии на современном этапе развития. С точки зрения создания противоопухолевых вакцин, ценно свойство Н8Р связываться с пептидами опухолевой клетки и фактически нести антигенный репертуар той клетки, из которой они получены. На экспериментальных моделях установлено, что иммунизация Н8Р 70, Н8Р 90 и ОР96, выделенными из опухолевых клеток, вызывает образование специфических цитолитиче-ских Т-лимфоцитов. Этого не наблюдалось при введении аналогичных белков, полученных из других тканей. Другие белки этого семейства: Са1гвисиИп, Н8Р 110 и 0ЯР170 - также могут использоваться в иммунотерапии рака. Предварительные данные клинических испытаний показали повышение числа опухолеспецифических цитолитических (СЭ8+) Т-лимфоцитов у большинства больных меланомой (IV стадия), иммунизированных белком ОР96, полученным из аутологичных опухолевых клеток, что коррелировало с клиническим эффектом. Н8Р и антитела к ним могут использоваться как ранние биомаркеры при начальных стадиях канцерогенеза; в качестве прогностического критерия течения определенного вида заболевания: так, экспрессия Н8Р 27 связана с 7неблагоприятным прогнозом рака желудка, простаты и печени, остеогенными саркомами; а экспрессия Н8Р 70 является неблагоприятным фактором в плане прогноза при раке мочевого пузыря, молочной железы и матки. Особенности синтеза и функции HSP, возможные пути терапии активно обсуждаются в сфере гематологии. Полная ремиссия опухолевого процесса у пациентов с острой лейкемией имеет четкую обратную связь с уровнем экспрессии Н8Р [19].
Статья
Несмотря на многочисленные исследования, роль белков теплового шока в этиологии и патогенезе ревматоидного артрита по-прежнему остается неизвестной. Данные, полученные при экспериментальном моделировании ревматоидного артрита (РА) у животных, позволяют предположить ведущую роль белков теплового шока семейства 60 кДа как триггера в развитии аутоиммунных процессов при РА [20]. При РА в лимфоцитах синтез индуцибельных и конститутивных (65, 70, 95, 120 кДа) HSP in vitro угнетается, степень угнетения зависит от тяжести и продолжительности заболевания. У больных РА уровень синтеза белков in vitro в лимфоцитах крови в состоянии покоя значительно снижен, в среднем на 60%. В результате теплового шока синтез конститутивных белков подавляется еще сильнее (уровень синтеза составляет около 30% от нормы), но увеличивается синтез индуцибельных HSP 65, 70, 90 кДа, хотя уровень их индукции достоверно ниже, чем в норме [21].
В настоящем обзоре представлены новейшие результаты исследования функций и механизмов протекторного действия HSP, характеризующих молекулярный уровень патогенеза заболеваний внутренних органов и оказывающих влияние на характер течения и прогноз. Отражены перспективные в плане создания новых методов лечения и профилактики заболеваний предпосылки терапевтических методов коррекции, основанные на активации эндогенных систем защиты стресс-белков.
Литература
1. Schlesinger M. et а1 Heat Shock from Bacteria to Man.-New York, 1982.
2. Остерман Л.А. 1983. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами.- М.: Наука.- 304 с.
3. Задорожная О.О. Стресс-белки при инфаркте миокарда: Дис... канд. мед. наук.- М.: 1999.
4. КарпищенкоА. // Клин.лаб.диагн.- 2000.- №3.- С. 10-12.
5. Feige U. et аl. Stress-inducible cellular responses.- Basel: Birkhauser., 1996.- 512 p.
6. Малышева Е.В. и др.И Бюл. экпер. биол.- 1994.- Т. 118, №8.- С. 126-129.
7. Афанасьев С.А. и др. // Биохимия.- 1996.- Т. 61, Вып. 10.- С. 1779-1784.
8. Beckmann R.P. et а1 // Science.- 1990.- Vol. 248.- P. 850.
9. R.J., Arnold J.. et al. // Biochem. Biorhys. Acta.- 1991.-Vol 1089, №13.- P. 141-157.
10. Sarge K, et dl // Molec. Cell. Biol.- 1993.- Vol. 13.-P. 1392-1407.
11. Delogu G. et al. // J. Crit. Care.- 1997.- № 12.- Р. 188-192.
12. Малышев И.Ю., Малышева Е.В. // Бюл. эксперим. биол. мед.- 1998.- Т.126.- С. 604-611.
13. Ивашкин В.Т., Задорожная О.О. // Клин. мед.- 2001.-№2.- С.33-37.
14. Craig E.A. et а1 // Cell.- 1994- Vol. 78.- P. 365-372.
15. Guzhova I.V. et аl // Cell. Stress Chap.- 1997.- Vol. 2, № 2.- P. 132-139.
16. Демидов О.Н. Система белков теплового шока 70 кДа у кардиохирургических больных: Автореф. дис. канд. мед. наук.-СПб, 1999.
17. Sanchez E.R. et а1 // Biochem.- 1990.- Vol. 29.- P. 5145.
18. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. // Вест. Рос. АМН.-2005.- №7.- С. 40-46.
19. ThomasX. et al. // Hematol.- 2005.- №10(3).- P. 225-235.
20. Holoshitz J. et а1. //J. Clin. Invest.- 1994.- Vol. 73.-
P. 211-215.
21. Исламов Б.И. и др. // Бюлл. экспер. биол. и мед.- 1999.-Т. 128, №1.- С. 525-528.
HEAT SHOCK PROTEINS: PHYSIOLOGICAL ROLE, DETECTION TECHNIQUE AND CLINICAL VALUE
O.V. CHIRKOVA Summary
The article represents the role of heat shock proteins (HSP) in the number of biological processes (both under normal conditions and stress): proteins synthesis and their transport through intracellular membranes; in the renaturation of the denaturated and aggregated protein. Also, it describes the protective action of inducible HSP in stressful conditions - cell protection from ischemia, influence on the
apoptosis process, restoration of mitochondrial functions after ischemic affection.
Key words: review, heat shock proteins, stress factors
УДК 546.33+546.32]:541.32:548.56
ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ПАРАМЕТРОВ СПЕКТРА АКТИВНОСТИ ИОНОВ ВОДОРОДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
II. ИНДИКАТОРНЫЙ МЕТОД
И. Г. ГЕРАСИМОВ, А. В. ЧУГАЙ*
Наличие в биологических жидкостях ионов водорода (Н+), различных по величине коэффициента активности - спектра активности Н+ (САИВ) - дает организму возможности осуществлять биорегулирование при его посредстве [1-3]. На формирование САИВ влияют другие, даже близкие по природе, ионы, например, натрия (Ка+) и калия (К+). Они неодинаково изменяют состояние Н+, по-видимому, по причине разной степени гидратации (у Ка+ она больше, чем у К+) [4-7]. Подходы к разработке параметров САИВ только начинают разрабатываться, и в [8] оценены некоторые из них с помощью электрохимического метода. Рассчитаны константы скорости (к1) и эффективные энергии активации (Е ) процесса диффузии Н+ в мембрану измерительного электрода в фосфатных буферах (ФБ) с pH, близким к физиологическому, содержащих только Ка+ или только К+, либо одновременно Ка+ и К+ в концентрациях и при pH, близких к вне-и внутриклеточным. Показано, что в ФБ с Ка+ активность Н+ выше в 1,3 раза, по сравнению с ФБ, содержащим К+, что объясняется разной степенью гидратации ионов, а значение энергии активации процесса диффузии согласуется с энергией активации Ка+-,К+-обмена в эритроцитах. Различия в активностях Н+ в ФБ разной природы подтверждены методом ЯМР. Вместе с тем в растворах, моделирующих вне и внутриклеточный состав, несмотря на различия pH, величины к1 и Е близки между собой. Следует заметить, что к характеризует преимущественно Н+ с относительно низкой активностью. Поэтому для оценки параметров САИВ могут быть полезны другие подходы.
Помимо электрохимического метода и ЯМР, для измерения pH применяют индикаторный метод. Имеется данные, что от метода измерения pH зависит определяемая концентрация Н+ ([Н+]). Значения pH, полученные электрохимически и индикаторным метом отличаются в пределах одного порядка [9]. Величины вне- и внутриклеточного pH различаются между собой на 0,1-0,2 в зависимости от применяемого индикатора [9, 10]. Параметры САИВ оценены помощью индикаторного метода.
Экспериментальная часть. Исследовали такие же, как в [8], ФБ (0,086 М) с pH = 7,2 (І-ІІІ) и 6,8 (IV); ФБ I содержал только №+, ФБ II - только К+, ФБ III и IV - и №+, и К+. Солевой состав и pH ФБ III близок к внеклеточным, а в IV - внутриклеточным. Измеряли оптическую плотность (Э) растворов индикаторов (Ind) фенолового красного, конго красного, фуксина основного, нейтрального красного (0,01 - 1 г/л), приготовленных на основе ФБ, а также водных растворов ^20^07, К2СГ2О7 и КМПО4 (10-4 моль/л, pH = 5,3 ( 0,05) и растворов Ind в ацетонитриле. Электронные спектры снимали при Т = 293° (2 К на СФ-46 в видимой и ближней УФ-области областях в диапазоне длин волн 250-620 нм. Площади спектров рассчитывали методом ступенчатой аппроксимации [11]. Измеряли pH на «pH-150». Среднее и его доверительный интервал рассчитывали с Р = 0,95.
Результаты. Исследование электронных спектров Ind в ФБ в зависимости от сопутствующего катиона может дать информацию о параметрах САИВ. Известно [4], что Ка+ и К+ в разной мере изменяют отношение коэффициентов активности двух форм Ind, и поэтому при определении pH с помощью Ind вводится солевая поправка, учитывающая смещение их кислотноосновного равновесия [4]. Но влияние катионов на Э растворов Ind может быть обусловлено степенью гидратации Ка+ и К+, что соответственно влияет на активность Н+ и параметры САИВ.
* НИИ медицинских проблем семьи ДГМУ им. М. Горького, 83015, Донецк, ул. Левицкого, 4, Украина
