CC BY
18
Том 12, №5-6, 2008 piK
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МЕДИЦИНА
© ШумейкоА.Г.1, Полторак В.В.2, Овсянникова Т.Н.3, Забелина И.А.3, Гладких А.И.2 УДК 612.43:577.1
ПОДАВЛЕНИЕ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ С ПОМОЩЬЮ ЭКСТРАКТА ИЗ МИДИЙ*
Шумейко А.Г.1, Полторак В.В.2, Овсянникова Т.Н.3, Забелина И.А.3,
Гладких А.И.2
1 2
Украинская медицинская стоматологическая академия, г. Полтава; Государственное учреждение «Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я. Данилевского АМН Украины», г. Харьков; 3Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, г. Харьков
У po6omi вивчався антид{абетичний ефект екстракту з Midii чорноморсъког (Mytilus gallo-provincialis Lam.) на mлi високодозового стрептозотоцинового дiабеmу у w^ypie-caMvie лтп Bic-тар. Визначали piвенъ глюкози у сироватц кpoвi, дихалъну активтстъ та показники про/антиоксидантного балансу мimoхoндpiй печтки wypiв (вмкт гiдpoпеpекиciв та активтстъ глутатюнпероксидази). Введення (внympiшнъoшлyнкoвo, 0,4 г/кг маси тта) екcmpaкmy з мiдiй дiaбеmичним wУPaм впродовж 10 дiб тсля формування aбcoлюmнoi iнcyлiнoвoi недостат-нocmi знижувало piвенъ глюкози у кpoвi, гiдpoпеpекиciв у мimoхoндpiях, нopмaлiзyвaлo активтстъ глутатюнпероксидази та дихання фосфорилюючих мтохондрш. Мехатзми позитивних ефекmiв екстракту з мiдiй, можливо, пов'язат з присуттстю у його cклaдi амтокислот та полтенасичених жирних кислот, як можутъ бути субстратами для вiднoвлення антиоксида-нтних систем та регенераци пiдшлyнкoвoi залози при дiaбеmi.
Ключов1 слова: цукровий д1абет, екстракт, мщп, оксидативний стрес, антиоксиданти, м1тохондр1я
Важным звеном патогенеза сахарного диабета линотерапия - направлена в первую очередь на сни-
(СД) 1 типа и его осложнений является оксидативный жение гипергликемии, следствием чего является, в
стресс, при развитии которого разрушение функцио- том числе, уменьшение глюкотоксичности и некото-
нально значимых структур р-клеток происходит по рое ослабление образования за этот счет АМК. Вме-
механизму перекисного окисления липидов (ПОЛ) [9], сте с тем, в современной практической диабетологии
независимо от первичной причины, вызвавшей уси- воспроизведение физиологического паттерна обес-
ленное образование активных метаболитов кислоро- печения больных инсулином затруднено в силу мате-
да (АМК). В реализации свободнорадикальных меха- риально-технических причин. Поэтому необходим
низмов, повреждающих клетки при СД 1 типа, прини- поиск дополнительных средств, которые могут повы-
мают участие внутриклеточные структуры, способные сить эффективность рутинной инсулинотерапии и
к выработке активных форм кислорода, прежде всего снизить выраженность повреждений островковых
- митохондрии [10,11]. Одной из причин активации клеток. В наших предыдущих работах и в исследова-
работы митохондрий при СД является избыточное ниях других авторов был показан защитный антиок-
поступление в клетки на фоне гипергликемии суб- сидантный эффект экстракта из мидии черноморской
страта для энергетических процессов - глюкозы. Яв- (Mytilus galloprovincialis Lam.) при аллоксановом СД у
ляясь глюкостатом организма, печень, наряду с по- крыс [6,9]. При аллоксановой модели СД абсолютная
джелудочной железой подверженная действию окси- инсулиновая недостаточность, характерная для СД 1
дативного стресса при СД, может служить индикато- типа у человека, формируется за счет неспецифиче-
ром как процессов свободнорадикальной деструкции, ского цитотоксического эффекта аллоксана, реали-
так и их целенаправленного подавления. зуемого не только для поджелудочной железы, но и
Традиционный способ лечения СД 1 типа - инсу- для других органов, в частности, печени. Вместе с
* Данная публикация выполнена в рамках плановой научно-исследовательской работы, N госрегистрации 0107U000424.
тем, представлялось целесообразным исследовать действие экстракта при высокодозовом стрептозото-циновом СД, характеризующемся направленной р-цитотоксичностью именно на уровне поджелудочной железы. При этом изучались митохондрии печени, ответственные за индукцию оксидативного стресса при СД, их функциональная активность и активность их антиоксидантных ферментных систем.
Материалы и методы исследований
В работе были использованы 21 крыса-самец линии Вистар, половозрелые, массой 200-220 г. Животных разбили на 3 группы: 1 - контрольные крысы (К); 2 - крысы с моделью стрептозотоцинового диабета (СД); 3 - крысы с моделью стрептозотоцинового диабета, получавшие экстракт из мидий (СДЭ) ежедневно в дозе 0,4 г/кг массы в течение 10 дней с 7 дня опыта, т.е. со дня манифестации абсолютной инсули-новой недостаточности. Препарат из мидий в виде водного раствора и воду (плацебо) вводили внутри-желудочным зондированием. Стрептозотоциновый диабет моделировали, как описано в [3]. Животных за сутки до начала опыта лишали корма при свободном доступе к воде. Затем крысам внутрибрюшинно вводили раствор стрептозотоцина в цитратном буфере в дозе 70 мг на кг массы тела. Через 17 дней после начала опыта (10 дней после введения экстракта) крыс декапитировали, кровь собирали в гепаринизи-рованную пробирку, получали плазму. Из печени методом дифференциального центрифугирования выделяли митохондрии [7]. Для определения активности антиоксидантных ферментов готовили гомогенаты печени в 10 мМ трис-НС! буфере, рН 7,4.
Содержание глюкозы в сыворотке крови определяли глюкозооксидазным методом с использованием ферментативного анализатора «Эксан - Г» (Литва).
Дыхание митохондрий печени регистрировали с помощью электрода Кларка в среде следующего состава: 10 мМ трис-НС! буфер, 100 мМ сахароза, 75 мМ КС!, 10 мМ КН2РО, 2 мМ МдЭ04, рН 7,4. 5 мМ глу-тамат и 5 мМ малат. Белок митохондрий в ячейке 1,0 - 1,5 мг/мл. Конечная концентрация субстрата (ма-лат+глутамат) - 8 мМ, АДФ - 200 мкМ. Все измерения проводили при 37 °С. По кривым потребления кислорода рассчитывали скорость дыхания в метаболических состояниях 4 (У4) и 3 ^3) по Чансу [7] и выражали ее в наномолях кислорода на 1 мг белка.
Содержание гидроперекисей липидов в сыворотке крови и митохондриях определяли по методу Asakawa [8]. Метод основан на превращении липидов
Влияние применения экстракта из мидий
в малоновый диальдегид (МДА) и окрашивании последнего в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. Спектр поглощения окрашенного продукта реакции записывали на двухлучевом спектрофотометре "Spekord UV VIS", измеряя затем разность экстинкции при А=535 и А=520 нм. Концентрацию гидроперекисей липидов выражали в эквивалентах количества МДА принимая коэффициент экстинкции равным 1,56 х 10 см"1*М"1.
Глутатионпероксидазную активность (ГПО) гомо-генатов определяли спектрофотометрически при А=340 нм [2] в 50 мМ KNa-фосфэтном буфере (pH 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА, 0,15 мМ NADPH, 0,5 ед. глутатионредуктазы из дрожжей, 3 мМ азида Na. Перекись водорода добавляли в концентрации 0,8 мМ, гомогенат добавляли до концентрации 0,06 мг белка на 1 мл.
Содержание белка в гомогенатах определяли методом Бредфорда [7].
Результаты исследований были статистически обработаны с помощью стандартного пакета программ Excel (версия 7). Сравнение двух групп с нормальным распределением производили с использованием классического t-критерия Стьюдента для независимых выборок, при сравнении двух групп с распределением значений, отличным от нормального, использовали критерий Уилкоксона (Манна-Уитни) [5].
Результаты и их обсуждение
В качестве антидиабетического средства для исследования был выбран экстракт из мидий. В его составе идентифицированы 20 аминокислот, в том числе, все незаменимые, эссенциальные жирные кислоты, микроэлементы и витамины А, Е, С, U. Большинство компонентов экстракта могут служить субстратами для синтеза поврежденных клеточных структур и ферментов при диабете. Кроме того, ранее были показаны антиоксидантные свойства данного экстракта [6].
Крысы, использованные в эксперименте по моделированию диабета, были рандомизированы по массе тела, в конце эксперимента она изменилась, как показано в таблице 1. Даже по средним арифметическим величинам этого показателя заметно, что масса тела крыс с диабетом, не получавших экстракт, снизилась к концу опыта, тогда как масса крыс, получавших экстракт на фоне диабета, увеличилась, еще более наглядно индивидуальное изменение массы животных.
Таблица 1
на массу тела крыс со стрептозотоциновым СД, X±Sx, n=5-7
Группа Масса тела, г
Начало опыта Окончание опыта
К (1) 179,0±8,6 199,0±15,0*
СД (2) 174,0±7,3 167,0±10,3*
СДЭ (3) 169,2±8,8 182,5±7,5*
* - достоверно относительно начала опыта, р<0,05 ( Подобное изменение массы экспериментальных животных мы объясняем положительным влиянием применяемого экстракта на пластические процессы в организме за счет его состава, богатого аминокислотами и другими предшественниками биополимеров.
Кроме того, изменение массы животных в процессе опыта прямо связано с гликемическими характери-
асно критерию Манна-Уитни).
стиками организма. Нами был измерен уровень глюкозы в группах крыс с диабетом и у контрольных животных. Как видно из данных таблицы 2, после 10 дней получения экстракта из мидий, уровень глюкозы в сыворотке крови крыс с СД (конечная гликемия) достоверно снижается по сравнению с их показателями до приема вещества (исходная гликемия). Диа-
Том 12, №5-6, 2008 рш
бетические крысы, не получавшие экстракт, не продемонстрировали такой динамики гликемии. Вместе с тем, следует заметить, что гипогликемический эффект экстракта не достаточен, чтобы рекомендовать его в качестве основного лечебного антидиабетичес-
Влияние экстракта из мидий на концентрацию
кого средства, но в комплексной терапии СД 1 типа экстракт из мидий может быть использован вполне успешно, исходя из данных по изменению веса и гли-кемических показателей экспериментальных животных.
Таблица 2
озы в крови крыс со стрептозотоциновым СД, (X±Sx), п=5-7
Этап опыта Концентрация глюкозы ммоль/л
К(1) СД(2) СДЭ (3)
Исходная гликемия 4,00 ± 0,17 15,38 ± 1,58 15,53 +1,10
Конечная гликемия 4,03 ± 0,24 16,06 +1,50 10,72 ± 0,51 ■
* - достоверно относительно исходной гликемии в се р<0,001.
Поскольку свободнорадикальные процессы вносят вклад в патогенез СД 1 типа, причем основным источником АМК при СД, в том числе и 1 типа, являются дыхательные цепи митохондрий [10], представляло интерес изучить про-антиоксидантный баланс и функциональную активность митохондрий в условиях нашего эксперимента, а также влияние на эти показатели экстракта из мидий.
Как показали наши данные, представленные в таблице 3, в митохондриях печени при стрептозото-
группе, р<0,01; **- достоверно относительно К,
циновом СД увеличена концентрация продуктов ПОЛ - гидроперекисей липидов, что может свидетельствовать в пользу оксидативного стресса в органеллах. Прием экстракта животными снижал уровень гидроперекисей в митохондриях, однако, обращает на себя внимание большая вариабельность данных в группах. Плазма крови крыс не отражала изменений оксидант-ного статуса митохондрий, вероятно, в величину гидроперекисей в плазме вносят вклад также другие источники.
Таблица 3
Содержание гидроперекисейлипидов в митохондриях печени и плазме крови крыс с СД, (X±Sx), п=5-7
Объект Содержание гидроперекисей, нмоль на 1 мг белка
К(1) СД(2) СДЭ (3)
Митохондрии 2,74 ± 0,42 3,41 ± 0,15* 1,74 ± 0,25
Плазма 0,91 ± 0,18 1,14 ± 0,25 1,60 ± 0,24
*- достоверно относительно контроля (К), р<0,05
Исследование функциональной активности митохондрий по показателям поглощения кислорода в разных метаболических состояниях - при фосфори-лировании (Уз) и в его отсутствие (N/4) указывает на наличие повреждений электронпереносящих цепей внутренней мембраны митохондрий, что может приводить к усиленной выработке АМК и последующей активации ПОЛ. Как видно из данных таблицы 4, скорость дыхания нефосфорилирующих митохондрий (с субстратами глутамат и малат) одинакова в контрольной и опытных группах, тогда как у фосфорили-рующих митохондрий она снижена при СД на 30 %.
Учитывая аминокислотный состав экстракта, в том числе, высокий уровень в нем предшественников синтеза глутатиона, был изучен основной компонент
Влияние экстракта из мидий на функциональные
глутатион-зависимой антиоксидантной системы митохондрий печени - активность глутатионпероксидазы (ГПО) (см. таблицу 4). Она защищает мембраны митохондрий от токсического действия АМК и гидроперекисей липидов [4]. В своей работе этот фермент требует наличия восстановленных форм глутатиона. Показано, что при СД 1 типа активность ГПО в митохондриях значительно повышена, что свидетельствует о высоком уровне субстратов данного фермента (гидропероксида водорода и гидроперекисей липидов) в изучаемых условиях. При отсутствии пополнения пула восстановленного глутатиона это может привести к исчерпанию антиоксидантного потенциала митохондрий печени. Прием животными экстракта из мидий нормализует изучаемый показатель.
Таблица 4
¡атели митохондрий печени крыс с СД 1 типа, (X±Sx), п=5-7
Группа Скорость дыхания (нмоль кислорода на 1 мг белка за 1 мин) ДК (У3/У4) Активность ГПО, нмоль ЫДОРИ на 1 мг белка за 1 мин
/4 У3
К (1) 12,67 ± 1,24 61,07±5,95 4,68 ± 0,45 50,40±6,07
СД (2) 12,40 ± 1,01 42,25±4,13* 3,35 ± 0,11 91,94±5,42*
СДЭ (3) 13,17 ± 0,75 74,54±1,58 5,85 ± 0,31 63,80±4,55
*- достоверно относительно контроля, p<0,05.
Полученные результаты продемонстрировали защитный эффект экстракта из мидий при экспериментальном стрептозотоциновом СД у крыс. Эффект этот выражался как в улучшении физиологических показателей - рост массы тела на фоне диабета, так и в сохранении гликемического гомеостаза на приемле-
мом уровне. Было показано, что превентивный эффект экстракта основан на его способности нормализовать про/антиоксидантный баланс в митохондриях печени: снижать уровень продуктов ПОЛ, восстанавливать энергетические характеристики митохондрий, поддерживать активность глутатион-зависимой сис-
темы митохондрий в стабильном состоянии. Возможно, полученные эффекты обусловлены качественным составом экстракта, т.к. аминокислоты и полиненасыщенные жирные кислоты, которыми он богат, являются субстратами для синтеза de novo биополимеров и устранения повреждений клеточных структур при СД, а также предшественниками и компонентами антиоксидантных систем.
Учитывая множественные аналогии между механизмами развития метаболического дисбаланса при стрептозотоциновом диабете и СД 1 типа у человека, главным образом, это - наличие абсолютной инсули-новой недостаточности и ассоциированного с ней оксидативного стресса, можно рекомендовать применение экстракта в качестве комплексного протекторного средства при терапии СД 1 типа в дополнении к традиционным методам лечения. Кроме того, принимая во внимание необходимость преодоления сво-боднорадикальной составляющей также при развитии СД 2 типа и его осложнений [9-11], перспективным является изучение эффективности экстракта из мидий для терапии и этой формы патологии.
Выводы
1. Экстракт из мидии черноморской (Mytilus galloprovincialis Lam.) обладает защитными антидиабетическими свойствами: снижает развитие гипергликемии, нормализует массу тела животных при высо-кодозовом стрептозотоциновом диабете.
2. Одним из механизмов защитного антидиабетического действия экстракта из мидий является улучшение функциональной активности митохондрий.
3. Экстракт из мидий можно рекомендовать в качестве компонента комплексной гипогликемической терапии СД 1 типа, а также для защиты от активации свободнорадикальных процессов.
4. Защитный эффект экстракта из мидий может быть обусловлен его химическим составом - наличием высокого содержания и качественного разнообразия аминокислот, а также эссенциальных полинена-
сыщенных жирных кислот, которые являются субстратами для регенеративных процессов в поджелудочной железе.
Литература
1. Возможные молекулярные механизмы действия препарата из мидий в организме крыс с аллоксановым диабетом / Овсяныкова Т.Н., Забелина И.А., Дягелева Е.А., Битютская О.Е. // Укр. 6ioxiM. журн. - 2002. - Т. 74, №4а(додаток 1). - С. 66.
2. Возрастные изменения глутатион-Б-трансферазной и глутатинпероксидазной активности цитозоля печени крыс / Ланкин В.З., Тихазе А.Н., Ковалевская А.Л., и др. // Доклады АН СССР. - 1981. - Т. 261, № 3. - С. 1824.
3. Експериментальне вивчення нових ппоглкемнних 3aco6iB / В.В. Полторак, H.I. Горбенко // ДокпЫнж до-слщження лкарських засобш Методичы рекомендацп. За. ред. О.В. Стефанова. - Кшв. - 2001. - С. 396-408.
4. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Обмен глутатиона // Успехи биол. химии. - 1990 - Т. 31. - С. 157-179.
5. 15.Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. -352 с.
6. Пат. 60504 A UA, Ф (13), (51)7А61К35/56. BiononiMep з тканин молюшв, cnoci6 його видтення та бюлопчы властивосл / О.С. Бпготська, T.M. Овсяныкова, А.Г. Губанова, H.I. Салатова, Б.1. Гудима, Л.П. Борисова (UA); ГПвденний НД1 морського рибного господарства та океанографп (UA). - №2002108573; заяв. 29.10.02; опубл. 15.10.03, Бюл. № 10. - 18 с.
7. Северин С.Е.,Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. /М.:Изд-во МГУ, 1989.-509 с.
8. Asakawa T.,Matsushita S. Coloring conditions of thiobar-bituric acid test for detecting lipid hydroperoxides // Lipids. - 1980. - V. 15, № 3. - P. 137-140.
9. Dave G.S. Hyperglycemia induced oxidative stress in type-1 and type-2 diabetic patients with and without nephropathy / G.S. Dave, K. Kalia // Cell. Mol. Biol. - 2007. -Vol. 53, N 5. - P. 68-78.
10. Green K., Brand M.D., Murphy M.P. Prevention of mito-chondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes // Diabetes. - 2004. - № 2, Vol. 53, Suppl. 1. - P. 110-118.
11. Pirot P. Mediators and mechanisms of pancreatic beta-cell death in type 1 diabetes / P. Pirot, A.K. Cardozo, D.L. Eiziric // Arq. Bras. Endocrinol. Metabol. - 2008. - Vol. 52, N 2. - P.156-165.
Summary
OXIDATIVE STRESS DECREASE IN STREPTOZOTOCIN-INDUCED RAT'S LIVER MITOCHONDRIA BY MEANS OF EXTRACT FROM MUSSELS
Shumeyko A.G.1, Poltorack V.V.2, Ovsyannikova T.N.3, Zabelina I.A.3, Gladkih A.I.2 Key words: diabetes mellitus, extract, mussels, oxidative stress, antioxidants, mitochondria.
The aim of this study was to investigate the antidiabetic effect of extract from mussels (Mytilus galloprovincialis Lam.) under streptozotocin diabetes in male Wistar rats. The levels of serum glucose and liver mitochondries pro/antioxidant balance (hydroperoxides concentration and glutathione peroxidase activity) as well as oxidative phosphorylation were studied. Oral administration of the extract to diabetic rats within 10 days after insulin deficiency generation reduced the blood glucose and mitochondria hydroperoxides levels and normalized the glutathione peroxidase activity of mitochondries in liver. Possible molecular mechanisms of action of the extract may be due to chemical compounds: amino acids and unsaturated fatty acids which may act as substrates for protection of antioxidant systems and pancreas regeneration in the diabetes.
Ukraine medical stomatological academy, Poltava1; Institute of Endocrine Pathology Problem, Kharkiv2; Karazin Kharkiv National University, Kharkiv3.
Mamepian Hadiumoe do pedaKU,i'i 26.11.08.
