CC BY
80
обзоры литературы
УДК 616-006.6-07
с.в. бойчук12, o. джоерап2
1Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49 2Раковый центр Университета Питтсбурга, 15213, г. Питтсбург, США
PML-зависимые механизмы репарации повреждений ДНК — перспективы создания нового метода лабораторной диагностики для оценки химио- и радиочувствительности злокачественных новообразований
Бойчук Сергей Басильевич — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патофизиологии, тел. (843) 236-75-31, e-mail: boichuksergei@mail.ru12
Джоерап оле — доктор биологических наук, заведующий лабораторией вирусной онкологии, тел. (412) 623-77-07, e-mail: ogv27@pitt.edu2
Было выявлено, что в условиях нокдауна белка PML на фоне повреждений ДНК, вызываемых химиопрепаратами (доксо-рубицин, этопозид и др.) и ионизирующим излучением, происходит нарушение фокального распределения белков, участвующих в репарации повреждений ДНК по механизму гомологичной рекомбинации. Данный факт позволяет рассматривать злокачественные новообразования со сниженной экспрессией белка PML как потенциально восприимчивые к проведению химио- и радиотерапии. Разработка метода лабораторной диагностики химио- и радиочувствительности злокачественных новообразований, основанная на оценке способности опухолевых клеток репарировать повреждения ДНК, вызываемых химиопрепаратами и ионизирующим излучением, представляется перспективной и позволит обеспечить правильный выбор тактики при проведении персонифицированной терапии онкологических больных, а также проведения последующего мониторинга ее эффективности.
Ключевые слова: репарация повреждений ДНК, гомологичная рекомбинация, белок PML, химио- и радиочувствительность опухоли, лабораторная диагностика.
S.V. BOYCHUK12, o. GJOERUP2
1Kazan State Medical University, 49 Butlerov St., Kazan, Russian Federation 420012
2University of Pittsburgh Cancer Institute, Hillman Cancer, Research Pavilion, Suite 1.4 5117 Centre Ave,
Pittsburgh, PA, 15213 USA
PML-dependent mechanisms of DNA-damage repair — opportunities for a new laboratory diagnostic method for evaluating the chemo- and radiosensitivity of malignant neoplasms
Boychuk S.V. — D. Med. Sc., Professor, Head of Department of Pathophysiology, tel. (843) 236-75-31, e-mail: boichuksergei@mail.ru12 Gjoerup Ole — D. Biol. Sc., Head of laboratory of virus oncology, tel.: (412) 623-77-07, e-mail: ogv27@pitt.edu2
It was found that in terms of PML protein knockdown against the background of DNA damage, caused by chemotherapeutic agents (doxorubicin, etoposide and etc.) and radiation, happens abnormality of focal distribution of proteins which participate in DNA damages reparation by a mechanism of homologous recombination. This allows us to consider malignant neoplasms with reduced PML protein expression as potentially susceptible to chemotherapy and radiotherapy. Development of laboratory diagnostic method of chemo-and radiosensitivity of malignant tumors, based on an assessment of the ability of tumor cells to repair DNA damage, caused by chemotherapy and ionizing radiation, seems promising and will provide the right choice of tactics in the process of the patient-specific therapy of oncologic patients, as well as follow-up monitoring of its effectiveness.
Key words: DNA-damage repair, homologous recombination, PML protein, chemo- and radiosensitivity of a tumor, laboratory diagnostics.
ременные вопросы диагностики
Введение
Получение адекватного ответа у больных онкологическими заболеваниями на проводимую им химиотерапию является одной из актуальных проблем современной клинической онкологии. Несмотря на наличие общепринятых схем проведения химиотерапии больным со злокачественными новообразованиями и значительный прогресс в области разработки и внедрения препаратов нового поколения, эффективность нехирургических методов лечения онкологических больных продолжает оставаться недостаточно высокой, а плохая «отвечаемость» онкологических больных на проводимую химиотерапию наряду с высокой частотой побочных эффектов является актуальной проблемой современной онкологии.
Наряду с широко известными механизмами, обусловливающими развитие лекарственной резистентности злокачественных новообразований (усиление «выброса» препарата из опухолевой клетки, процессов катаболизма химиопрепаратов и др.), одним из ключевых факторов, определяющих резистентность злокачественных новообразований к химиотерапии, следует считать способность опухолевых клеток «справляться» с последствиями генотоксического стресса, вызываемого химио-препаратами. Это достигается за счет активации в опухолевых клетках спасательных механизмов восстановления поврежденных участков ДНК. Результатом этого является повышение выживаемости опухолевых клеток, подвергающихся воздействию химиопрепарата(ов), что клинически проявляется неуклонным ростом опухоли и прогрессированием заболевания, несмотря на проводимую химиотерапию. В сложившейся ситуации ее продолжение не только не способствует улучшению состояния больных злокачественными новообразованиями, но и приводит к развитию побочных эффектов, обусловленных выраженными цитотоксическими свойствами большинства современных химиопрепаратов.
Принимая во внимание большое количество белков, участвующих в репарации повреждений ДНК (только в одном из 6 имеющихся в клетках репа-ративных путей — гомологичной рекомбинации ДНК, количество «участников» превышает 50), проведение процедуры генотипирования опухолей на предмет выявления в опухолевых клетках каких-либо отдельных мутаций в системе репарации повреждений ДНК, обуславливающих ответ опухолевых клеток на химиотерапию, не будет адекватным образом отражать ситуацию in vivo, возникающую в опухолевой ткани после воздействия на нее химиопрепарата(ов). Безусловно, проведение процедуры генотипирования позволяет выявить определенные группы риска по развитию злокачественных новообразований некоторых локализаций (например, наследственные формы рака молочной железы (РМЖ) и яичника, сопровождающиеся мутациями генов, в первую очередь BRCA1 и BRCA2, а также TP53, PTEN, LKB1, ATM, BRIP1, CHEK2, PALB2 и др.) [1-4]. Тем не менее выявление отдельных мутаций вышеупомянутых и других генов будет недостаточным для адекватной оценки химиочувстви-тельности опухоли и мониторинга эффективности проводимой химиотерапии. Например, было показано, что BRCA1-опосредованные дефекты в системе гомологичной рекомбинации встречаются гораздо чаще, чем предполагалось ранее, и не связаны непосредственно с мутациями гена BRCA1 и др. Подобные дефекты обнаруживаются у больных РМЖ,
не имеющих наследственной предрасположенности к этому заболеванию. Становится очевидным, что проведение генотипирования опухоли на предмет выявления в опухолевых клетках всех возможных мутаций (как прямых, так и обратных), «ответственных» за развитие резистентности опухоли к химиотерапии, является трудновыполнимой задачей как с технической, так и с экономической точек зрения. В то же время оценка способности опухолевых клеток к гомологичной рекомбинации in vitro после воздействия различных генотоксических факторов (в частности химиопрепаратов) может быть предложена в качестве одного из критериев оценки эффективности действия химиопрепаратов, обладающих максимальной терапевтической эффективностью. Следовательно, разработка и внедрение в практическую онкологию метода клинической лабораторной диагностики, основанного на способности клеток репарировать повреждения ДНК, вызываемые химиопрепаратами, может рассматриваться в качестве альтернативного и информативного метода оценки химиочувствительности злокачественных новообразований. Кроме того, исследования последних лет свидетельствуют о том, что нарушения процессов гомологичной рекомбинации в опухолевых клетках обуславливают их чувствительность к ингибиторам поли(АДФ-рибоза)-полимераз (ПАРП), что позволяет их рассматривать в качестве перспективных противоопухолевых препаратов нового поколения, используемых как в качестве моно-, так и комбинированной терапии онкологических больных с нарушениями процессов репарации повреждений ДНК. Данная концепция получила название «синтетической летальности» [5-7]. Следовательно, изучение молекулярных механизмов репарации повреждений ДНК и разработка метода лабораторной диагностики данных нарушений является актуальной задачей.
Учитывая важную роль белка PML в регуляции процессов онкогенеза, апоптоза, старения и пр.
Рисунок 1.
Индукция двунитевых разрывов ДНК (доксо-рубицин, гидроксимочевина, ионизирующее излучение) в условиях нокдауна белка PML (киРНК к РМL). В качестве маркеров двунитевых разрывов ДНК использовали уровень экспрессии фосфорилированных форм гисто-на 2А и АТМ-киназы (pH2AX Ser139 и pAТМ Ser1981, соответственно).
Рисунок 2.
Влияние нокдауна белка PML на фокальное распределение белков, участвующих в репарации повреждений ДНК. По оси ординат — количество клеток (в %) с фокальным распределением белков, являющихся маркерами дву-нитевых разрывов (рН2AXSer139) а также участвующих в репарации повреждений ДНК: Rad51 (Б), 53BP1(B) и Mre11 (Г) после воздействия химиопрепаратов и ионизирующего излучения.
[8, 9], а также принимая во внимание полученные нами ранее данные о координирующей роли данного белка в процессах гомологичной рекомбинации ДНК [10], было проведено исследование эффективности процессов гомологичной рекомбинации повреждений ДНК, вызываемых различными химио-препаратами, а также ионизирующим излучением in vitro.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта для исследования были выбраны фибробласты человека линии BJ tert, им-мортилизированные за счет активации гена тело-меразы. Клетки культивировали в полной культу-ральной среде DMEM с добавлением антибиотиков (пенициллин-стрептомицин), L-глутамина (все реагенты ПанЭКО) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone). Снижения уровня экспрессии белка PML достигали в результате трансфекции коротких интерферирующих рибонуклеиновых кислот (киРНК) против PML (SMARTPool, Dharmacon). Транcфекцию киРНК против PML или контрольной РНК осуществляли с помощью реагента RNAiMAX (Invitrogen). Нокдаун белка PML подтверждали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител (клон PG-M3 и H-92, Santa Cruz). Спустя 24 ч. вызывали повреждения ДНК с помощью химиопрепаратов — доксорубицина (0,25 мкг/ мл, Sigma), гидроксимочевины или этопозида (Cal-biochem), или воздействия ионизирующего излучения (10 Гр). Клетки инкубировали с вышеуказанными препаратами в течение 72 часов. Для выявления
двунитевых разрывов ДНК и активации репарации возникших повреждений ДНК оценивали уровень экспрессии фосфорилированных форм гистона 2А (H2AX Ser139) и АТМ-киназы (pATM Ser1981) (Cell Signaling/Santa Cruz и Epitomics соответственно). В качестве контроля уровня экспрессии белков использовали моноклональные антитела (мАТ) к общим формам вышеназванных белков (Cell Signaling и Epitomics, соответственно) и актину (Sigma). Активацию репаративных процессов также оценивали методом иммунофлюоресцентной микроскопии (Olympus AX-70 и BX-63) с использованием мАТ к фосфорилированным формам гистона 2А (H2AX Ser139, Millipore), АТМ-киназы (pATM Ser1981, Rockland), RPA (pRPASer4/8, Bethyl) белков 53BP1 (Ab-1, Calbiochem), Nbs1 и Mre11 (Novus), а также BrdU (BD Biosciences). В качестве вторичных антител использовали антитела, меченные Alexa-Fluor-488 (Invitrogen) и Cy3 (Jackson ImmunoRe-search). Результаты исследований обрабатывали с помощью программы «Statistica 6.0» (StatSoft Inc., США), для оценки достоверности различий изучаемых выборок использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
Для изучения роли белка PML в процессах репарации повреждений ДНК был использован метод РНК-интерференции, позволяющий транзиторно «выключать» в клетках интересующие белки. Было обнаружено, что трансфекция киРНК к PML в фибробласты приводит к значительному (более 95%) снижению уровня экспрессии данного белка. Было также показано, что химиопрепараты и ионизирующее излучение вызывают повреждения ДНК, что подтверждалось значительным повышением уровня экспрессии фосфорилированной формы гистона 2А, являющегося, как известно, суррогатным маркером двунитивых разрывов ДНК [11]. Кроме того, отмечалось значительное повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы АТМ-киназы (pATM Ser 1981), фосфорилирующей вышеназванную форму гистона и являющейся одной из ключевых киназ, регулирующей дальнейший каскад реакций, заключающийся в привлечении к месту повреждения ДНК белков-репарантов и их фосфорилирования/акти-вации [12]. Уровень повреждения дНк в контроле и в условиях нокдауна белка PML был сопоставим друг с другом во всех исследуемых образцах (рис. 1).
Дальнейшие исследования показали, что нокдаун белка PML в фибробластах человека приводил к нарушению фокального распределения белков-репарантов после индукции повреждения ДНК хи-миопрепаратами (этопозид, доксорубицин, гидрок-симочевина и др.) и ионизирующим излучением. Например, несмотря на наличие двунитевых разрывов ДНК, оцениваемых по фокальному накоплению фосфорилированной формы гистона 2А (рис. 2а), в условиях нокдауна белка PML не наблюдалось фокального накопления белков, участвующих в репарации повреждений ДНК путем гомологичной рекомбинации: Rad51, 53BP1, Mre11 и др. (рис. 2б, в, г соответственно). Таким образом, было показано, что белок PML, известный своими свойствами онко-супрессора, обладает способностью поддерживать генетическую стабильность за счет регуляции процессов гомологичной рекомбинации повреждений ДНК.
Изучение молекулярных механизмов, «ответственных» за привлечение белков-репарантов к месту повреждений ДНК в условиях нокдауна белка PML, показало, что в этом случае происходит на-
рушение формирования участков однонитевых разрывов ДНК, оцениваемых по фокальному накоплению BrdU, вносимому в культуру клеток за 4 часа до индукции повреждений ДНК в дозе 10мкг/мл (р<0.001). Учитывая тот факт, что формирование подобных участков ДНК может являться следствием активации/фосфорилирования белка RPA, обладающего определенной специфичностью в отношении поврежденной ДНК и участвующего в «надрезе» поврежденных участков ДНК, была также проведена оценка фокального накопления данного белка в условиях генотоксического стресса, происходившего на фоне нокдауна белка PML. Было обнаружено, что в условиях нокдауна белка PML не происходит привлечения белка RPA к местам двунитевых разрывов ДНК, вызываемых химиопрепаратами (это-позид, доксорубицин) и ионизирующим излучением (р<0.001).
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что в клетках со сниженной экспрессией белка PML происходит нарушение процессов гомологичной рекомбинации ДНк, повреждаемой в результате генотоксического действия химиопрепаратов и/или ионизирующего излучения. Этот факт является важным как с точки зрения понимания молекулярных механизмов регуляции генетической стабильности и онкосупрессорного механизма действия белка PML, так и для оценки перспектив проведения оценки химио- и радиочувствительности злокачественных новообразований, сопровождающихся сниженной экспрессией данного белка.
Известно, что процессы гомологичной рекомбинации ДНК играют важную роль в поддержании генетической стабильности, а генетические дефекты в данной системе часто коррелируют с повышенной частотой заболеваемости различными формами злокачественных новообразований и наследственными формами злокачественных новообразований. Одним из примеров, подтверждающих справедливость данной точки зрения, являются наследственные формы рака молочной железы (РМЖ) и яичника, обусловленные генетическими мутациями в системе BRCA1/2.
Именно данные дефекты в системе поддержания генетической стабильности обуславливают повышенную частоту встречаемости вышеупомянутых злокачественных новообразований, но в то же время обеспечивают хорошую «отвечаемость» данной группы пациентов на проводимую им химиотерапию. Это обусловлено тем, что образование двунитевых разрывов ДНК в опухолевых клетках с вышеназванными генетическими дефектами делает невозможным репарацию повреждений ДНК, индуцированных химиопрепаратами, и вызывает их последующую гибель вследствие запуска программы апоптоза. Несостоятельность процессов гомологичной рекомбинации повреждений ДНК в данном случае подтверждается отсутствием фокального накопления белков-репарантов у BRCAl/2-дефицитных первичных опухолевых клеток и клеточных линий, подвергнутых воздействию генотоксических факторов (химиопрепараты и облучение).
Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что нарушения процессов гомологичной рекомбинации могут также происходить в новообразованиях со сниженной экспрессией белка PML. Нами было обнаружено, что в условиях нокдауна белка PML, происходящего на фоне генотоксического воздействия химиопрепаратов, также отсутствовали признаки фокального накопления белков-репаран-
тов, участвующих в процессах гомологичной рекомбинации (в первую очередь белка Rad51). Важно подчеркнуть, что уровень экспрессии маркеров двунитевых разрывов ДНК, а также белков, участвующих в репарации повреждений ДНК, в некоторых случаях не отличался существенным образом между клетками с нокдауном PML и контрольной группой. В то же время между данными группами были выявлены существенные различия в фокальном распределении данных белков, что свидетельствует об относительно невысокой информативности изучения общего уровня экспрессии белков в условиях генотоксического стресса по сравнению с исследованием их фокального распределения.
Таким образом, на основании анализа литературных данных и результатов собственных исследований имеются основания для проведения функциональной гомологии между белками BRCA1/2 и PML. Это в свою очередь позволяет полагать, что у пациентов со злокачественными новообразованиями, сопровождающимися снижением уровня экспрессии белка PML, следует ожидать лучшую «отвечаемость» на проводимую химио- и радиотерапию по сравнению с пациентами с нормальной и/или повышенной экспрессией данного белка-он-косупрессора. Спектр злокачественных новообразований, потенциально дефектных по системе гомологичной рекомбинации вследствие сниженного уровня экспрессии белка PML, достаточно велик. В частности иммуногистохимические исследования злокачественных опухолей различного происхождения показали, что экспрессия белка pMl может быть полностью утрачена или значительно снижена в 17% случаев аденокарцином толстой кишки, 21% опухолей легких, 27% аденокарцином предстательной железы, 31% опухолей молочной железы, 49% опухолей центральной нервной системы (100% ме-дуллобластом и более 90% олигодендроглиальных опухолей) и 68% неходжскинских лимфом [13].
Другим интересным аспектом выявленных нами нарушений процессов гомологичной рекомбинации в клетках в условиях нокдауна белка PML in vitro является повышение их потенциальной чувствительности к ингибиторам поли-(АДФ-рибоза)-полимераз (ПАРП). Известно, что однонитевые разрывы ДНК, образующиеся в результате различных процессов (в том числе метаболических) могут превращаться в двунитевые при поступательном движении клетки по фазам клеточного цикла (а именно вступлении в S-фазу). В физиологических условиях однонитевые разрывы ДНК устраняются различными путями, в том числе благодаря активности ПАРП. Поэтому подавление активности данных полимераз в настоящее время рассматривается в качестве перспективного метода терапии лиц со злокачественными новообразованиями, имеющими дефекты в системе гомологичной рекомбинации. Безусловно, речь в первую очередь идет о группе больных с наследственными формами РМЖ и яичника, имеющих вышеупомянутые генетически-де-терминированные дефекты в системе гомологичной рекомбинации дНк [5]. Кроме того, имеются положительные результаты клинических испытаний по использованию различных ингибиторов ПАРП (олапариб, MK4827, INO-1001, CEP-9722 и др.) в качестве монотерапии или комбинированной терапии больных другими формами злокачественных новообразований (например, тройного негативного РМЖ, меланомы, рака кишечника, глиом и пр.) [6, 7].
Выявленные нами нарушения процессов гомологичной рекомбинации ДНК в условиях нокдауна белка PML, проведенного на фоне генотоксического стресса, позволяют также рассматривать злокачественные новообразования со сниженной экспрессией белка PML в качестве потенциальных кандидатов для проведения терапии ингибиторами ПАРП. Косвенным признаком, свидетельствующим о потенциальной эффективности использования ингибиторов ПАРП для терапии больных со злокачественным новообразованиями, сопровождающимися снижением уровня экспрессии белка PML, является выявленный нами ранее факт повышения активности ПАРП в клетках в условиях нокдауна белка PML как в «физиологических условиях», так и при воздействии химиопрепаратов [14]. Этот фактор, по всей видимости, носит компенсаторный характер, позволяющий клеткам «переживать» генотоксический стресс в условиях нокдауна белка PML.
Заключение
Оценка способности опухолевых клеток репари-ровать повреждения ДНК, вызываемые химиопре-паратами и ионизирующим излучением, может быть использована в качестве диагностического маркера резистентности злокачественных новообразований к проводимой химио- и радиотерапии. Обнаружен-
ЛИТЕРАТУРА
1. Claus E.B., Schildkraut J.M., Thompson W.D., Risch N.J. The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer // Cancer. — 1996. — № 77. — P. 2318-2324.
2. Stratton M.R., Rahman N. The emerging landscape of breast cancer susceptibility // Nat Genet. — 2008. — № 40. — P. 17-22.
3.Wooster R., Bignell G., Lancaster J., Swift S., Seal S., Mangion J. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2 // Nature. — 1995. — № 378. — P. 789-792.
4. Miki Y., Swensen J., Shattuck-Eidens D., Futreal P.A., Harshman K., Tavtigian S. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 // Science. — 1994. — № 266. — P. 66-71.
5. Audeh M.W., Carmichael J., Penson R.T. Oral poly(ADP-ribose)-polymerase inhibitor olaparib in patients with BRCA1 or BRCA2 mutations and recurrent ovarian cancer: a proof-of-concept trial // Lancet. — 2010. — № 376 ( 9737). — P. 245-251.
6. Kummar S., Chen A., Parchment R.E. Advances in using PARP Inhibitors to treat cancer. // BMC Medicine. — 2012. — № 10 (25). — P. 1-5.
7. Penning T.D., Zhu G.D., Gandhi V.B. Discovery of the poly(ADP-ribose)-polymerase (PARP) inhibitor 2-[(R)-2-methyl pyrrolid in-2-yl]-1H-benzimidazole-4-carboxamide (ABt-888) for the treatment of cancer // J. Med. Chem. 2009. — № 52. — P. 514-523.
ные нами нарушения процессов репарации повреждений ДНК на фоне снижения уровня экспрессии белка pMl in vitro дают основание полагать наличие нарушений процессов гомологичной рекомбинации повреждений ДНК у больных со злокачественными новообразованиями со сниженным уровнем экспрессии данного онкосупрессора.
Разработка и внедрение метода лабораторной диагностики химио - и радиочувствительности злокачественных новообразований in vitro позволят обеспечить правильный выбор тактики персонифицированной терапии онкологических больных, а также проведения мониторинга эффективности проводимой химио- и радиотерапии.
Кроме того, разработка и внедрение метода лабораторной диагностики, позволяющих оценить эффективность процессов репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках, могут быть использованы в качестве одного из критериев для оценки эффективности вновь синтезируемых лекарственных препаратов, обладающих потенциальной противоопухолевой активностью.
Работа частично финансировалась грантом Российского фонда фундаментальных исследований
(РФФИ №13-04-00255 А)
8. Bernardi R., Pandolfi P.P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies // Nat Rev Mol Cell Biol. — 2007. — № 8. — P. 1006-1016.
9. Dellaire G., Ching R.W., Ahmed K., Jalali F., Tse K.C. Promyelocytic leukemia nuclear bodies behave as DNA damage sensors whose response to DNA double-strand breaks is regulated by NBS1 and the kinases ATM, Chk2, and ATR // J Cell Biol. — 2006. — № 175. — P. 55-66.
10. Boichuk S.V., Hu L., Makielski K. Functional connection between Rad51 and PML in homology-directed repair // PloS One. — 2011. — № 6 (10). — P. 1-13.
11. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139 // J. Biol. Chem. — 1998. — № 273 (10). — P. 5858-5868.
12. Bakkenist C.J., Kastan M.B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation // Nature. — 2003. — № 421 (6922). — P. 499-506.
13. Gurrieri C., Capodieci P., Bernardi R. et al. Loss of tumor suppressor PML in human cancers of multiple histologic origins // J. Nat. Cancer Inst. — 2004. — № 96. — P. 269-279.
14. Бойчук С.В., Рамазанов Б.Р., Мустафин И.Г., Джоерап О. Повышение активности поли(АДФ-рибоза)-полимераз в условиях нокдауна белка PML — новые перспективы терапии злокачественных новообразований // Казанский медицинский журнал. — 2013. — № 1. — C. 75-79.
подписной индекс журнала «практическая медицина»
в каталоге «роспЕЧАТь» 37140 в республиканском каталоге фпс «татарстан почтасы» 16848
ременные вопросы диагностики
