CC BY
146
Известия Саратовского университета. 2011. Т. 11. Сер. Физика, вып. 2
УДК 576.3
ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНЫЕ ЗОЛОТЫЕ ЧАСТИЦЫ КАК НОСИТЕЛИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ И ОПТИЧЕСКИЕ МЕТКИ В ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
О. А. Бибикова*, С. А. Староверов**, О. И. Соколов,
Л. А. Дыкман, В. А. Богатырев
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
E-mail: [email protected]
*Саратовский государственный университет
E-mail: [email protected]
**Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция РАСХН E-mail: [email protected]
В работе проведено исследование влияния золотых плазмон-но-резонансных частиц (зПРЧ) и комплекса зПРЧ с противораковым препаратом проспидином на некоторые физиологические функции (эндоцитоз, дыхательную активность, жизнеспособность) опухолевых клеток линий HeLa и SPEV-2. Для визуализации клеток и ПРЧ использовали комбинирование нескольких микроскопических режимов регистрации светорассеяния и флюоресценции. В качестве плазмонно-резонансных меток было использовано цитратное коллоидное золото диаметром ~50 нм. Использование зПРЧ с последующей окраской катионным флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым позволило надежно визуализировать метки методами световой микроскопии и определить их локализацию внутри клеток с помощью конфокальной микроскопии. Показано усиление цитостатического действия проспидина в комплексе с коллоидным золотом. Ключевые слова: плазмонно-резонансные частицы, флуоресцентные красители, конфокальная микроскопия, дифференциально-интерференционный контраст, темнопольная микроскопия, жизнеспособность клетки, эндоцитоз.
Plasmon-Resonance Gold Nanoparticles as Drug Carriers and Optical Labels for Cytological Investigations
O. A. Bibikova, S. A. Staroverov, O. I. Sokolov,
L. A. Dikman, V. A. Bogatyrev
In this paper we report on the investigation of the influence of plasmon resonant gold nanoparticles (PRGNPs) and their complex with anticancer drug prospidin to the physiological functions (endocytosis, respiratory activity, viability) of tumor cell lines HeLa and SPEV-2. We used the combination of several microscopic regimes to register the light scattering and fluorescence for visualization the cells and PRGNPs. The citrate-stabilized colloidal gold with average particle diameter 50 nm was used as plasmon resonant labels. The use of PRGNPs with subsequent staining by cationic fluorescent dye acridine orange enabled to visualize the labels by light microscopy and estimate their localization inside the cells by the confocal microscopy. We showed the enhancement of cytostatic activity of prospidin in the complex with the colloidal gold.
Key words: plasmon-resonance gold nanoparticles, fluorescent labels, confocal microscopy, differential interference contrast microscopy, dark-field microscopy, viability, endocytosis.
Введение
Применение плазмонно-резонансных наночастиц (ПРЧ) является принципиально новым и перспективным методом диагностики и терапии онкозаболеваний, позволяющим выявить патологию на ранних стадиях и сделать лечение более щадящим за счет снижения токсического эффекта препаратов. Для проведения успешной диагностики и терапии онкологических заболеваний необходимо определить, проникает ли коллоидное золото в клетку или локализуется на ее поверхности. Не менее важно изучение жизнеспособности клеток, конъюгированных с золотом, как для фундаментальных исследований цитотоксичности ПРЧ, так и для определения эффективности противоопухолевой терапии.
В настоящее время предложено достаточное количество способов определения локализации золотых наночастиц методами электронной микроскопии [1, 2], дифференциально-интерференционно контрастной (ДИК) микроскопии [3, 4] и конфокальной микроскопии. В режиме конфокальной микроскопии визуализация внутриклеточных процессов с использованием плаз-монно-резонансных частиц в основном проводится в режиме мультифотонной флуоресценции [5-7]. Стандартная конфокальная микроскопия требует флуоресцентных зондов, в то время как золотые частицы обладают лишь очень слабой флуоресценцией. В работах Ч. Миркина с соавторами [8] конструкции, состоящие из коллоидного золота в комбинации с флуоресцентными зондами, называют нанофакелами (папоАаге8). Физический смысл нанофакелов заключается в обратимом тушении флуоресценции вблизи или на поверхности плазмонно-резонансных частиц.
© Бибикова О. А., Староверов С. А., Соколов О. И., Дыкман Л. А., Богатырев В. А., 2011
Аналогичные конструкции использованы в работах Х. Ли, Л. Розберга [9] для анализа ДНК-последовательностей в клинической диагностике, в том числе в ПЦР-продуктах.
Целью данной работы была разработка методов использования золотых плазменно-резонансных частиц (зПРЧ) для доставки проспидина в клетки и визуализации этого процесса методами традиционной и конфокальной световой микроскопии.
Материалы и методы
Используемые приборы. Световой микроскоп Leica DM 2500 с дополнительным галогеновым осветителем Leica CLS 150, позволяющим освещать объект с двух сторон сбоку, для реализации режима темного поля. Захват и анализ изображений проводили с помощью цифровой видеокамеры Leica DFC 420 C и программного обеспечения Leica Application Suite V 3.1.
Конфокальный микроскоп Leica LSM SP-5 (Leica Microsistems, Германия) в режиме регистрации светорассеяния (при совмещении полосы возбуждения и приема в красной области спектра) и флюоресценции (со спектральным сдвигом соответствующим используемым флюорофорам).
Планшетный ридер Multiscan Ascent Thermo (Scientific), оптическую плотность измеряли на длине волны 492 нм.
Используемые материалы. В качестве плазмонно-резонансных меток использовали цитратное коллоидное золото, полученное по методу Г. Френса [10], диаметр частиц 50 нм. В качестве лекарственного препарата использовали противоопухолевый цитостатический препарат проспидин. В комбинации с проспидином золотые наночастицы были дополнительно покрыты тиолированным полиэтиленгликолем и меркапто-ундекановой кислотой. Были использованы культуры клеток почек эмбрионов свиньи (SPEV-2) и человеческих раковых клеток HeLa, полученные из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии (Саратов) научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН. Культивирование клеточных культур проводили в пластиковых флаконах в полной RPMI среде (10%-ная эмбриональная сыворотка, гентамицин, ампициллин, амфотерицин).
Используемые реактивы. 0.1-ный % раствор Acridine Orange Stain (акридиновый оранжевый краситель); 0.1%-ный раствор Propidium iodide (краситель йодистый пропидий); 0.1%-ный раствор Eozin B (краситель эозин); 0.1%-ный раствор Fluorescein-Na (Uranin) (краситель уранин);
3%-ный раствор glutaric dialdehyde (глутаровый альдегид); 10 мМ солевой фосфатный буфер (PBS); 5%-ный раствор тетра нитросинего тетра-золия бромида (МТТ) в растворе Хенкса; 10%-ный раствор диметилсульфоксида (ДМСО).
Культивирование клеток с золотыми наночастицами. Клетки линии HeLa инкубировали золотыми наночастицами (2.7109 мл-1) в течение 72 ч, после этого ресуспендировали в чистой питательной среде. Подсчет клеток осуществлялся в камере Горяева. Определение дыхательной активности проводилось колорометрическим тестом (МТТ-тест) по методике, описанной М. Никс и М. Отто [11] с небольшими модификациями. Показания оптической плотности считывали на планшетном ридере Multiscan Ascent Thermo (Scientific).
Определение жизнеспособности клеток. Концентрацию клеток доводили до 106 мл-1. Клетки окрашивали: а) раствором уранина (конечная концентрация красителя 2 пг/мл) и йодистого пропидия (конечная концентрация 0.6 пг/мл), инкубировали 10 мин, ресуспендировали в воде (mQ), изготовляли препараты; б) раствором бербе-рина (конечная концентрация 1 мкг/мл) и эозина (0.1 мкг/мл), инкубировали 15 мин, ресуспендиро-вали в воде (mQ), изготовляли препараты. В обоих случаях мертвыми считали ярко-красные клетки, остальные - живыми.
Изучение возможностей использования золотых сферических наночастиц для доставки проспидина. Концентрацию клеток доводили до 106 мл-1. Проводили проверку цитостатической активности чистого проспидина и комплекса про-спидин - коллоидное золото на клетках SPEV-2 с помощью МТТ-теста. Проводили титрование раствора золота в среде, содержащей проспидин (концентрация проспидина 12.5 мг/мл) методом двойных разведений с изменением концентрации от 10000 частиц на одну клетку до 100 частицы на одну клетку. Проводили титрование раствора проспидина в среде, содержащей золотые частицы (концентрация частиц примерно 100000 на 1 клетку) с изменением концентрации проспидина от 12.5 до 1.5 мг/мл. Клеточную суспензию инкубировали с полученными растворами в течение 72 ч при 37о С. В качестве контроля использовали чистую питательную среду и среду с коллоидным золотом (100000 частиц на 1 клетку). Проверка цитостатической активности комплекса проспи-дин - коллоидное золото с использованием клеток HeLa проводилась для концентраций проспидина, равных 2. 3 и 4 мг/мл.
Известия Саратовского университета. 2G11. Т. 11. Сер. Физика, вып. 2
Результаты и их обсуждение
Усиление светимости золотых наночастиц в результате их взаимодействия с катионными флуоресцентными красителями происходит благодаря увеличению сечения рассеяния ПРЧ за счет адсорбции флуорофора на поверхности частиц, что, в свою очередь, может приводить к агрегации частиц. Комбинирование золотых наночастиц с флуоресцентными метками позволяет визуализировать ПРЧ внутри клеток с помощью конфокального микроскопа путем создания оптических срезов в режиме регистрации светорассеяния и флуоресценции.
На рис. 1 представлен срединный оптический срез клетки. Наличие золотых частиц на срезе доказывает их локализацию внутри клетки.
Рис. 1. Срединный оптический срез клеток БРЕУ-2, меченных «комплексом краситель акридиновый оранжевый - золотые наночастицы»
Основываясь на сходстве химического строения акридина оранжевого и проспидина, авторами статьи было проведено исследование влияния комплекса проспидин-коллоидное золото на дыхательную активность опухолевых клеток с помощью МТТ-теста. При исследовании взаимодействия лекарственного комплекса с клетками было обнаружено, что чистый проспидин в малых концентрациях не обладает выраженным цитостатическим эффектом (угнетение дыхательной активности на 10%), но при присоединении к золотым наночастицам вызывает угнетение дыхания не менее чем на 60%. Изменение цитостатических свойств препарата мы объясняем проникновением комплекса внутрь клетки путем эндоцитоза за счет транспортной функции золотых наночастиц (рис. 2).
180 й 160 о 140
CQ
S 120
« 100
§ 80 Я
3 во
<D
40
X
3 20
0
Рис 2. Зависимость дыхательной активности клеток HeLa, инкубированных с проспидином и ПРЧ, в зависимости от количества проспидина: ♦ - проспидин + коллоидное золото; ■ - клетки + коллоидное золото
Следует отметить, что коллоидное золото не оказывает существенного влияния на цито-статическую активность концентрированного проспидина.
При проведении серии экспериментов было обнаружено, что золотые сферические наночастицы увеличивают дыхательную активность клеток предположительно за счет влияния на клеточный метаболизм. В дальнейшем необходимо провести более глубокое исследование влияния чистого коллоидного золота на жизнеспособность клеток, а также механизма проникновения частиц через мембрану.
При комбинировании режимов темного поля и флуоресценции смешанные метки позволяют исследовать влияние золотых наночастиц на жизнеспособность и морфологию клеток. Мертвые клетки, окрашенные витальным красителем, имеют ярко красную окраску (рис. 3). Для четкой дифференциации живых и мертвых клеток следует использовать пары красителей, интенсивность свечения которых примерно одинакова. В данной работе были использованы витальные красители берберин и эозин, а также уранин и йодистый пропидий. При этом исследовать жизнеспособность клеток, окрашенных эозином, можно также в режиме светлого поля.
Структура клеток и локализация ПРЧ могут быть выявлены в режиме дифференциально-интерференционного контраста путем настройки призм для получения максимального темного поля с применением дополнительного бокового освещения.
На рис. 4 золотые частицы четко просматриваются в виде множества ярких точек.
Концентрация проспидина, мг/мл
6G
Научный отдел
а б
Рис. 4. Изображения клеток HeLa в режиме дифференциально-интерференционного контраста с боковым освещением, а - инкубированных с золотом, б - контроль
Таким образом, предлагаемый нами подход к использованию ПРЧ в комбинации с лекарственными веществами и флюоресцентными красителями для цитологических исследований позволяет определять колоколезацию ПРЧ с клеточными структурами и их влияние на морфофизиологические параметры клеток, изучать биораспределение ПРЧ на микропопуляционном уровне.
Список литературы
1. Nativo P., Prio, I., Brust A. M. Uptake and intracellular fate of surface-modified gold nanoparticles //Acs Nano. 2008. Vol. 2, № 8. P. 1639-1644.
2. Fuente J. M., Berry C. C. Tat peptide as an efficient molecule to translocate gold nanoparticles into the cell nucleus // Bioconjugate Chem. 2005. Vol. 165, № 5. P. 1176-1180.
3. Wang G., Stender A. S., Sun W., Fang N. Optical imaging of non-fluorescent nanoparticle probes in live cells // Analyst. 2010. Vol. 135, № 2. P. 215-221.
4. Sun W., Wang G., Fang N., Yeung E. S. Wavelength-dependent differential interference contrast microscopy: selectively imaging nanoparticle probes in live cells // Anal. Chem. 2009. Vol. 81. P. 9203-9208.
5. Diagaradjane P., Shetty A., Wang J. C, Elliott A. M., Schwartz J.,
Shentu S., ParkH. C., DeorukhkarA., Stafford R. J., Cho S. H., Tunnell J. W., Hazle J. D., Krishnan S. Modulation of in vivo tumor radiation response via gold nanoshell-mediated vascular-focused hyperthermia : characterizing an integrated anti-hypoxic and localized vascular disrupting targeting strategy // Nano Lett. 2008. Vol. 8, № 3. P. 1492-1500.
6. Durr N. J., Larson T., Smith D. K., Korgel B. A., Sokolov K., Ben-Yakar A. Two-photon luminescence imaging of cancer cells using molecularly targeted gold nanorods // Nano Lett. 2007. Vol. 7, № 4. P. 941-945.
7. Huff T. B., Hansen M. N., Zhao Y., Cheng J. Wei A. Controlling the cellular uptake of gold nanorods // Langmuir. 2007. Vol. 23, № 4. P. 1596-1599.
8. Seferos D. S., Giljohann D. A., Hill H. D, Prigodich A. E, Mirkin C. A. Nano-Flares : Probes for transfection and mRNA detection in living cells // J. Amer. Chem. Soc. 2007. Vol. 129. P. 15477-15479.
9. Li H., Rothberg L. Label-free colorimetric detection of specific sequences in genomic DNA amplified by polymerase chain reaction // JACS. 2004. Vol. 126. P. 10958-10961.
10. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sci. 1973. Vol. 241. P. 20-22.
11. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay // J. Immunol. 1900. Vol. 130, № 1. P. 149-151.
