CC BY
25© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 _ , • .
Л.М.Сомова1, Ф.Н.Шубин1, ЕИ-Дро/бот1, Н.Г.Паехова1-2, И.Н.Ляпун1 > у я,-
ПЛАЗМИД-АССОЦИИРОВАННАЯ ВИРУЛЕНТНОСТЬ YERSINIA PStiUDO-TUBERCULOSIS И ИНФЕКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС
'НИИ эпидемиологии и микробиологии, ^Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток ,
Обобщены данные литературы, касающиеся генетически детерминированньк факторов патогенности Y. pseudotuberculosis и ассоциированных с нймй Проявлений этой' инфекции. вызываемой разными плазмидными типами возбудителя. Основное внимание обращено на особенности клеточно-тканевых изменений, опосредованных плазмидой вирулентности pYV, а также эффекты патогенности мало изученной плазмиды pVM82, имеющейся только в штаммах Y. pseudotuberculosis, вызывающих клинико-эпидемическое проявление инфекции в виде дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (ДСЛ). Полученные данные о способности дальневосточных штаммов продуцировать суперантиген YPMa, Y. pseudotuberculosis-производный митоген А, вероятно, свидетельствуют о том, что он играет ключевую роль в патогенезе ДСЛ. Вариабельность повреждений клеток врожденного иммунитета и органов-мишеней, вызываемых различными по вирулентности плазмидными типами Y. pseudotuberculosis, может обусловливать полиморфизм клинико-морфологических проявлений этой инфекции. Углубленное понимание зависимости механизмов иммунопатогенеза болезни от молекулярной характеристики возбудителя раскрывает перспективы усовершенствования диагностики и прогнозирования тяжести течения псевдотуберкулеза и в целом иерсиниозов у человека.
Журн. микробиол., 2016, № 6, С. 74—85
Ключевые слова: дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (ДСЛ), Y. pseudotuberculosis, плазмидные типы, плазмид-ассоциированная вирулентность, нейтрофилы, макрофаги
L.M.Somova1, F.N.Shubin1, EJ.Drobot1, N.G.Plekhova'-2,I.N.Lyapun1
PLASMID-ASSOCIATED VIRULENCE OF YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS AND INFECTIOUS PROCESS
'Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 2Pacific State Medical University, Vladivostok, Russia
Literature data regarding genetically determined pathogenicity factors of Y. pseudotuberculosis and associated manifestations of this infection caused by various plasmid types of the causative agent are generalized. Principal attention is given to features of cell-tissue alterations mediated by virulence plasmid pYV, as well as effects of pathogenicity of an understudied pVM82 plasmid present only in Y. pseudotuberculosis strains causing clinical-epidemic manifestation of the infections as Far East scarlet-like fever (FESLF). The data obtained on the ability of far-eastern strains to produce YPMasuper-antigen, Y.pseudotuberculosis-denvatwe mitogen A, probably give evidence on its key role in FESLF pathogenesis, friability of damage of innate immunity cells and target-oigans caused by various plasmid types of Y. pseudotuberculosis by virulence could determine polymorphism of clinical-morphological manifestations of this infection. In-depth understanding of dependency of immune pathogenesis mechanisms of the disease on molecular characteristics of the causative agent opens up perspectives of enhancement of diagnostics and prognosis of the severity of the course of pseudotuberculosis and yersiniosis in human in general.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 6, P. 74—85
Key words: Far East scarlet-like fever (FESLF), Y. pseudotuberculosis, plasmid types, plasmid-associated virulence, neutrophils, macrophages
Актуальность изучения инфекций, вызываемых бактериями рода Yersinia (иерсиниозов), обусловлена их принадлежностью к эмерджентным болезням, возбудители которых вызывают генерализованные формы заболевания человека, в определенных условиях принимающие вспышечный и групповой характер. Пристальное внимание исследователей к проблеме иерсиниозов с начала XXI века связано с возросшей угрозой биотерроризма во всем мире, а также с потенциальной способностью гетерогенных популяций патогенных микроорганизмов к реверсии их вирулентных свойств, ассоциированных с изменениями на геномном уровне. Для понимания потенциала патогенности бактерий рода Yersinia важное значение имеет факт, что возбудитель псевдотуберкулеза, Y. pseudotuberculosis, является эволюционным предшественником этиологического агента чумы, Y. pestis [17].
Освещая новые данные о комплексе Yersinia pseudotuberculosis, авторы [37, 42] сообщают о мономорфном кладе (clade), вызвавшем дальневосточную скарлатиноподобную лихорадку (Far East scarlet-like fever, FESLF) в СССР в 1960 году, который, по мнению авторов, часто претерпевает рекомбинацию, возможно, из-за конъюгативной плазмиды pVM82 и содержит белок вирулентности TcpYI. Этот ранее неизвестный белок вирулентности, ответственный за уникальный клинический синдром FESLF, имеет значительную гомологию последовательности к членам семейства Toll/IL-1 рецептора (TIR). Бактериальный TIR домен содержит белки (Tcps), действующие на иммунную систему по TIR-TIR взаимодействиям, и подрывает защитные реакции организма с помощью многогранных механизмов. Белок TcpYI увеличивает внутриклеточное выживание штаммов in vitro и в селезенки мышей на модели перитонита, участвует в торможении фагоцитоза даже тех штаммов Y. pseudotuberculosis группы FESLF, где плазмида вирулентности pYV отсутствует.
В настоящее время Y. pseudotuberculosis как представитель патогенных иерсиний привлекает внимание исследователей всего мира в качестве модели для раскрытия молекулярных механизмов взаимодействия в системе микроорганизм-клетка хозяина. Недавно доказано, что клинико-эпиде-мическое проявление псевдотуберкулеза, первоначально названного дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой (ДСЛ) [8, 15], связано с конкретной клональной линией Y. pseudotuberculosis, характеризующейся определенным плазмидным профилем (pVM82, pYV48), сиквенстипом (2ST) и аллелем гена yadA (1 аллель) [Тимченко Н.Ф. и др., 2011].
Большой интерес мировой науки и здравоохранения к проблеме псевдотуберкулеза, протекающего в виде дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки, демонстрирует недавно опубликованный обзор A. Amphlett (2015). Этот эпидемический вариант болезни, наблюдаемый прежде всего в России и Японии, протекает с серьезными системными воспалительными симптомами. В России Y. pseudotuberculosis инфекция признана как национальная проблема здоровья и дополнена к национальной системе нотификации (уведомления) в 1988 году [47j. В Японии эпидемии Y. pseudotuberculosis инфекции, именуемой как Izumi лихорадка и синдром Кавасаки, стали регистрироваться с 1977 г. [41,48].
Патогенные для человека Y. pseudotuberculosis обладают широким набором факторов патогенности, детерминируемых хромосомными и плазмидными генами [6]. У различных штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружено 11 типов внехромосомных генетических элементов — плазмид, имеющих молекулярную массу (м.м.) от 2 до 82 МДа. Наиболее постоянными являются плазмиды pYV м.м. 42 — 48 МДа и pVM82 м.м. МДа, что позволило отнести их к категории основных, а остальные—к дополнительным.
Заболеваемость в виде эпидемических вспышек могут обусловливать доминирующие плазмидные типы — pYV 48 и pYV48: pVM 82, содержащиеся в геноме основного этиологического агента псевдотуберкулеза у людей в Сибири и на Дальнем Востоке — Y. pseudotuberculosis 1 серовара [9]. При этом для одноплазмидного варианта Y. pseudotuberculosis, содержащего плазмиду вирулентности pYV м.м. 45 — 48 МДа, характерны вспышки с более благоприятным течением, преобладанием легких и стертых форм заболевания. Присутствие дополнительной плазмиды pVM 82 в штаммах Y. pseudotuberculosis (pYV48: pVM82) обусловливает более тяжелое клиническое течение заболевания с полиорганной патологией.
Присутствие плазмиды вирулентности PYV является необходимым условием для патогенности видов Yersinia. По наличию или отсутствию этой плазмиды штаммы разделены на патогенные (G1-G3, G5-G6) и непатогенные подгруппы (G4) [AmphlettA., 2015]. Подгруппы G2h G3 составляют большинство клинических изолятов, а подгруппы G1, G2 и G6 включают меньшинство штаммов. Наиболее частым клиническим генотипом в России и Японии является G3, обладающий PYV и продуцирующий суперантигенный токсин YPMa, но не имеющий острова высокой патогенности HPI [28]. ;
Патологическое значение суперантигена YPMa обусловливается его способностью связываться непосредственно с молекулами МНС класса II, активируя Т-клетки так быстро, как обычные антигены активируют врожденные иммунные клетки [29], а также взаимодействуя с множеством Т-клеток, содержащих элементы Vp3, V09, VP13.1 и VP13.2, и активируя от 5 до 20% от всей популяции Т-клеток [50].
Механизм, посредством которого YPMa вызывает развитие заболевание ДСЛ, вероятно, будет многофакторный [Amphlett А., 2015]. Исследования, в которых вводили очищенный YPMa подкожно мышам, показали, что токсический шок не происходит, когда были использованы моноклональные антитела против TNF-y, IFN-y или CD4, поскольку эти цитокины и Т-клеточный подтип вовлекаются в патогенез синдрома YPMa —индуцированного токсического шока [35]. Кроме того, было показано, что суперантигены потенцируют токсичность эндотоксинов, таких как липополисахарид, и это синергетическое действие может дополнительно способствовать развитию заболевания [20].
Большинство дальневосточных штаммов Y. pseudotuberculosis продуцируют YPMa, но не все случаи Y. pseudotuberculosis инфекции сопровождаются развитием картины ДСЛ, предполагая взаимодействие мезкдусуперантигеном и другими факторами вирулентности. Секвенирование генома штамма, вызывающего ДСЛ, показало, помимо pYV, дополнительные факторы вирулентности, которые могут быть вовлечены в патогенез заболевания [25]. Эти геномные элементы включают в себя следующее: плазмида pVM82, Yersinia адгезии остров патогенности (YAPI), который кодирует пили типа IV. •
Нами впервые изучен плазмидный профиль 791 штаммов Y. pseudotuberculosis серовара 1, изолированных в 1977 — 1985 гг. от больных людей, диких
животных, из смывов с продуктов и оборудования овощехранилищ в различных регионах страны [ 14]. Плазмиды выявлены у 784 (99,1 %) штаммов, и они имели молекулярные массы (в MDa): 82; 45; 57; 5,5; 4,4; 3,5; 2,7; 2,4; 2,3 (по уточненным данным плазмида р45 имеет массу 48 MDa). Среди этих плазмид наиболее часто выявляемыми были элементы массой 48 и 82 MDa, изучение которых показало, что плазмида массой 48 MDa является плазмидой вирулентности Y. pseudotuberculosis (pYV), а плазмида 82 MDa является специфичной для штаммов Y. pseudotuberculosis и была обозначена как pVM82. В соответствии с плазмидными характеристиками штаммы Y. pseudotuberculosis были дифференцированы на 15 плазмидных типов. Наиболее часто выявляемыми были штаммы 82:48 MDa, а также штаммы, содержащие обе указанные плазмиды в комбинации с низкомолекулярными элементами (677 штаммов, 86,4%). Вторыми по частоте встречаемости были штаммы плазмидного типа 48:4,4 MDa (9,3%).
Близкие результаты получены при изучении плазмидной характеристики 212 штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных из различных источников в 2000 — 2010 гг. [47]. При этом на территориях Сибири и Дальнего Востока выявлена циркуляция шести плазмидных типов: 82:47 MDa (62,1%), 47 MDa (31,1%) и только 6,8% остальных типов: 82:47:17 MDa (5,3%), 110:82:47:17 MDa (0,5%), 82:47:17:2.7 MDa (0,5%); 82:47:2.7 MDa (0,5%). В дополнение к наличию плазмиды вирулентности pYVn плазмиды pVM82 штаммы Y. pseudotuberculosis, изолированные от пациентов, содержали суперантиген YPMa независимо от тяжести заболевания. В период с 2000 по 2010 гг. общее среднее число вновь зарегистрированных случаев было 6024 в год, а средняя частота составила 4,2 на 100 000 населения.
Детально охарактеризованы факторы патогенности, детерминированные хромосомными генами [13]. Они включают: 1) инвазин — белок молекулярной массой 103 kDa, обеспечивающий температура-зависимое проникновение бактерий в клетки хозяина; 2) белок Ail молекулярной массой 17 kDa, действующий как вторичный фактор адгезии и инвазии уже после адаптации бактерий к температуре тела хозяина; 3) антиген рН6, экспрессирующийся при температуре 37°С и низком значении рН; 4) белок молекулярной массой 21 kDa, экспрессирующий образование фимбрий. Хромосомные гены играют критическую, хотя еще не совсем определенную роль в патогенезе иерсини-озной инфекции [19].
Считают, что развитие инфекционного процесса, связанное с активным размножением Yersinia внутри тканей, возможно только при наличии у них гомологичной плазмиды вирулентности, называемой PCD1 у Y. pestis, и pYV(plasmid for Yersinia virulence) у Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica молекулярной массой 42 — 48 MDa, которая придает содержащим ее штаммам устойчивость к действию иммунной системы человека или животных [ 13,21,22,39].
Плазмида вирулентности PYV кодирует белок наружной MeM6paHbiYad А, являющийся ведущим адгезином иерсиний, а также 7 разновидностей эффек-торных белков наружной мембраны Yops, которые представляют собой комплекс факторов, предназначенных для нейтрализации иммунокомпетентных клеток и осуществляющих запуск апоптоза макрофагов [21, 23, 36, 39,43, 46, 51], а также запускающих систему секреции III типа (type III secretion system, T3SS) [23]. T3SS является общей для всех патогенных Yersinia и позволяет бактериям вводить синтезируемые ими эффекторные белки в цитоплазму клетки хозяина без проникновения в нее, что играет существенную роль в развитии иерсиниозных инфекций.
Эффекторный белок YopE является ОТРазным активирующим белком, а YopH — протеин тирозинфосфатазой, оба являются антифагоцитарными. YopO/YpkA является серин треонин киназой. YopM может переходить к ядру клетки-хозяина. YopJ/P ингибирует продукцию провоспалительного цитоки-на TNF-a и индуцирует апоптоз макрофагов. YopT является цитотоксином, который вызывает нарушение актиновых филаментов. Было показано, что все Yops дополнительно разрывают внутриклеточную передачу сигнала или приводят к изменениям цитоскелета, что препятствует фагоцитозу [24]. PYVтакже кодирует белки, участвующие в контроле и транслокации эффекторных Yops к клетке-мишени: YopN, YopB, YopD, ТуеА, lcrG и lcrV. Патогенные виды Yersinia преимущественно нацелены на клетки врожденной иммунной системы (нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки) для инъекции Yops, ослабляя врожденный иммунный ответ [32].
Большой интерес представляет гораздо менее изученная плазмида с молекулярной массой 82 МДа (pVM82), обнаруживаемая только у штаммов Y. pseudotuberculosis I серовара, который является наиболее частым этиологическим агентом ДСЛ у человека в России и не встречается у других представителей рода Yersinia. Наличие у этих бактерий двух плазмид молекулярной массой 82 и 45 — 48 МДа детерминируют особую вирулентность штаммов и вызывают более тяжелое течение заболевания [14]. Авторами установлено, что наличие только плазмиды PYV определяет спорадическую заболеваемость псевдотуберкулеза. Кроме того, ими показано, что среди природных штаммов Y. pseudotuberculosis встречается плазмида р57 молекулярной массой 57 MDa, которая не коррелирует с эпидемичностью штаммов и является фрагментом плазмиды pVM82 вместе с фрагментом ДНК в 25 MDa. Было установлено [1], что в присутствии плазмиды pVM82 подавляется образование антител к ряду основных антигенов Y. pseudotuberculosis, в то же время, штаммы, содержащие плазмиду р57, такого эффекта не оказывают. Поэтому был сделан вывод, что фрагмент ДНК в 25 MDa детерминирует синтез дополнительного фактора патогенности возбудителя псевдотуберкулеза.
После проникновения в организм патогенных бактерий инициируется сложный каскад событий, в котором ключевая роль отводится клеткам врожденного иммунитета [33,44]. Понимание закономерностей реагирования этих клеток (нейтрофилов, моноцитов/макрофагов) при взаимодействии с гетерогенными популяциями иерсиний может иметь важное значение при разработке основ вакцинальной стратегии населения в группах риска, что особенно необходимо для предотвращения эпидемий чумы. Сведения о закономерностях реагирования клеток врожденного иммунитета как первой линии защиты при инфекционных процессах при их взаимодействии с разными плаз-мидными типами Y. pseudotuberculosis остаются недостаточно изученными и противоречивыми.
Нами впервые детально прослежена ферментативная активность клеток врожденного иммунитета при инфицировании разными плазмидными типами Y. pseudotuberculosis. На моделях in vivo и in vitro установлены качественные и количественные различия реагирования клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и макрофагов), включая кислородзависимые, кислороднезави-симые и нитроксидзависимые механизмы бакгерицидности [3]. В ответ на заражение in vitro слабовирулентным плазмидным типом pVM82 Y.pseudo-tuberculosis более активно реализовался бактерицидный потенциал (показа-
тели фагоцитоза и бактерицидности) и нитроксидобразующая активность фагоцитов, а также защитная реакция миелопероксидазы нейтрофилов, по сравнению с вирулентным плазмидным типом pYV48: pVM 82. При одинаковой бактериальной нагрузке (1:10) фагоцитарная активность нейтрофилов была ниже, чем у макрофагов, при этом активнее поглощался и обезвреживался менее вирулентный плазмидный тип pVM82 Y. pseudotuberculosis, тогда как вирулентный тип pYV48: pVM82 оказывал цитотоксическое действие на клетки. В ранние сроки (1,5 — 2 часа) после заражения плазмидным типом pYV45: pVM82 Y. pseudotuberculosis уровень активности ферментов кислород-зависимой системы (НСТ-тест, СДГ) нейтрофилов превышал таковой после инфицирования плазмидным типом pVM82. Активность миелопероксидазы, принимающей участие в защитной реакции нейтрофилов, и продукция кати-онных белков были выше в отношении менее вирулентного плазмидного типа pVM82 Y. pseudotuberculosis.
Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Ж.А.Коноваловой [5], показавшей, что плазмидсодержащие Y. pseudotuberculosis (pYV48 и pYV48:pVM82) более устойчивы к разрушению макрофагами и нейтрофилами, чем клетки бесплазмидного штамма. Активность ферментов «окислительного взрыва» (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, НАДФ-Н-оксидазы), супероксиддисмутазы, миелопероксидазы и кислой фосфатазы в макрофагах при фагоцитозе бесплазмидных клеток была выше, чем в случае плазмидсодержащих бактерий.
Ткким образом, установленные особенности метаболической активности в макрофагах и нейтрофилах, инфицированных разными плазмидными типами Y. pseudotuberculosis, свидетельствуют об угнетении бактерицидной способности фагоцитов, что имеет существенное значение в иммунопатогенезе данной инфекции.
Ключевая роль в развитии патологического процесса при инфекционных заболеваниях принадлежит повреждению клеток, которое зависит от степени вирулентности инфицирующих агентов. В органопатологии псевдотуберкулеза, вызываемого вирулентными штаммами Y. pseudotuberculosis, содержащими плазмиды pYV: pVM82, значительное место занимают деструктивно-воспалительные изменения с формированием своеобразных «абсцессо-подобных или некротические очажков», а также гранулем (узелков) с так называемым центральным кариорексисом, которые являются отличительным морфологическим признаком псевдотуберкулеза [4,16].
Получены данные о вариабельности клеточных повреждений в гистопатологии псевдотуберкулеза в зависимости от плазмид-ассоциированной вирулентности Y. pseudotuberculosis [3, 10]. Установлено, что при заражении животных как высоко вирулентным двухплазмидным штаммом pYV48: pVM82, так и штаммом Y.pseudotuberculosis со сниженной вирулентностью, имеющим единственную плазмиду pVM82, в органах-мишенях развивались клеточные повреждения как по типу некроза, так и апоптоза. В ответ на заражение плазмидным типом pVM82 наблюдалось преобладание апоптоза в органопатологии инфекции. Вирулентный штамм Y. pseudotuberculosis, содержащий две плазмиды pYV48 : pVM82, преимущественно вызывал некроз фагоцитов. На модели in vitro выявлено его апоптоз-индуцирующее действие на клетки врожденного иммунитета^ причем в большей степени нейтрофилов, чем макрофагов. Максимальное количество апоптотических нейтрофилов наблю-
далось на 7 день после заражения (45±3,3%). Апоптоз макрофагов обнаружен на 2 день после контакта с бактериями (29±3%). Кроме некроза и апоптоза нейтрофилов при воздействии плазмидного типа pYV48 : pVM82 Y. pseudotuberculosis обнаружен 3 тип клеточной гибели — образование внеклеточных ловушек [3]).
Поглощение Yersinia дикого типа, содержащего плазмиду pYV, индуцирует форму гибели нейтрофилов, называемую фагоЦитоз-индуцированной гибелью клеток (PICD), что зависит от продукции активных форм кислорода (АФК) и имеет важное значение для разрешения инфекции и воспаления [40, 46]. Контролируемый уровень апоптоза иммунных клеток требуется для вирулентности Yersinia [21 ]. ;
Исходя из того, что нейтрофилы тесно связаны с острым воспалением, J.L. Spinner et al. [46] исследовали роль белков Yersinia YopJ и YopP, связанных с плазмидой pYV, в определении судьбы человеческих нейтрофилов. При ис-пользовании in vitro штаммов Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и Y. pestis дикого типа и мутантных по плазмиде вирулентности штаммов было установлено, что YopJ / YopP-опосредованная индукция апоптоза не происходит в нейтрофилах в отличие от макрофагов. Надежная продукция нейтрофилами АФК в ответ на дефицитные по плазмиде вирулентности штаммы Yersinia была связана с повышенной клеточной гибелью, предположили, что опосредованное иерсиниями ингибирование продукции АФК нейтрофилами играет роль в уклонении от врожденного иммунитета человека, в частности, за счет ограничения апоптоза нейтрофилов. При этом редукция апоптоза нейтрофилов потенциально задерживала острую воспалительную реакцию и способствовала персистенции Yersinia посредством внутриклеточной и внеклеточной выживаемости в очаге инфекции [38, 45]. Эти данные демонстрируют, что увеличенная цитотоксичность/апоптоз иммунных клеток соответствует атте-нуации вирулентности Yersinia.
Иерсинии способны индуцировать Yop-опосредованный апоптоз клеток лимфоидной ткани [53], в том числе макрофагов [34]. Это может иметь значение в процессе инфекции, когда включение механизма апоптоза у макрофагов хозяина приводит к их инактивации и тем самым к исключению воспалительного ответа, что, в свою очередь, приводит к внеклеточному размножению патогена в лимфоидной ткани. Yersinia, экспрессирующие YopP, оказывают сильное цитотоксическое действие на мышиные макрофаги и дендритные клетки, чем те, которые экспрессируют YopJ, тем не менее, различия аминокислотных последовательностей между YopJ и YopP обусловливают менее эффективное перемещение YopJ в клетки хозяина [21,49]. Кроме того, Yersinia, конструированные для экспрессии YopP (вместо YopJ), являются менее патогенными для мышей при оральной и подкожной инфекции.
Ацетилтрансферазная активность белка YopJ, опосредованная плазмидой вирулентности pYV, способствует разным формам гибели клеток, которая может проявляться в виде апоптоза, пироптоза и некроза [27,31]. Важно отметить, что различные реакции организма хозяина являются следствием доставки соответствующего эффекторного «коктейля»: YopJ (Р) Y. enterocolitica транслоцируется в клетки хозяина более продуктивно и цитотоксично, чем YopJ аллели, экспрессируемые Y. pestis и Y. pseudotuberculosis [49]. Замена YopJ Y. pseudotuberculosis на более цитотоксический YopJ (Р) Y. enterocolitica осла-. бляет течение псевдотуберкулезной инфекции [21]. Таким образом, было по-
казано, что белок YopJ не является важным для патогенеза Yersinia инфекции, хотя это остается спорным.
Воспалительный пироптоз, развивающийся при воздействии на макрофаги полисахарида бактерий рода Yersinia, может протекать как в присутствии, так и в отсутствии АТФ. Пироптоз опосредован адаптерным белком ASC, который вместе с каспазой-1 образует надмолекулярный цитоплазматический комплекс, также известный как пироптосома [26]. Это требует плазмид-кодированных T3SS, но не YopJ или любых других известных эффекторных молекул [18]. Пироптоз является результатом активации каспазы-1, которая функционально отличается от структурно родственных апоптотических каспаз. Каспаза-1 зависимое повреждение ДНК происходит по механизму пироптоза, отличающемуся от каспаза-3 зависимого расщепления ДНК в клетках при апоптозе [18, 19]. Каспаза-1 также стимулирует созревание и секрецию воспалительных цитокинов IL-1 и IL-18, что вызывает образование пор в плазматической мембране, патологических потоков ионов, которые приводят к отеку клетки и, в конечном счете, к лизису и высвобождению воспалительного внутриклеточного содержимого, что служит усилению физиологического воздействия воспалительных цитокинов.
Установлено, что макрофаги, подвергающиеся пироптозу, не только демонстрируют морфологические признаки, типичные для апоптоза, но и обладают некоторыми чертами, ассоциированными с некрозом [30]. Интересно, что Yersinia-инфицированные клетки проявляют особенности апоптоза, пироптоза или некроза в зависимости от состояния и типа вовлеченных клеток [18,52]. Однако остается неясным — содействует ли клеточная гибель защите организма хозяина и можно ли рассматривать ее как стратегию для Yersinia элиминировать фагоциты, или наоборот, способствует ли клеточная гибель иммунитету против иерсиний [20].
Токсины как факторы патогенности бактерий играют важную роль в инициации, развитии и исходе инфекционных болезней. К началу 2000-х годов было сформировано представление о спектре токсинов Y. pseudotuberculosis и раскрыты некоторые механизмы реализации токсического эффекта патогена [12]. Существенное значение в патогенезе псевдотуберкулеза имеют два токсина Y. pseudotuberculosis—термолабильный летальный токсин (ТлТ) и термостабильный летальный токсин (ТсТ).
Термолабильный токсин Y. pseudotuberculosis — видовой белок с м.м. 200 KDa, обладающий иммуногенными и аллергенными свойствами, способен вызывать у лабораторных животных местную дермонекротическую реакцию и смерть при парентеральном введении. ТлТ выделен Н.Ф. Тимченко из штамма 2517III серовара, содержащего плазмиду pYV48 MDa (штамм получен от H.Mollaret, Франция), а также из бесплазмидного штамма. Установлено [7] дозозависимое селективное действие этого токсина на функциональную активность клеток врожденного иммунитета. При его добавлении к нейтрофилам в концентрации 1,52 мкг/мышь (5 LD50) выявлена активация ферментов кислород-зависимой системы (ДДГ и МПО) в ранний период контакта (до 3 часов). В свою очередь, было отмечено увеличение количества апоптотических макрофагов в ранние сроки контакта с ТлТ (5 часов) и его дальнейшее увеличение в течение срока наблюдения с одновременным увеличением активности митохондриального фермента цитохромоксидазы и продукции оксида азота. Патоморфологические исследования показали [11], что этот токсин имеет
6.ЖМЭИ 6 N¡27-2016
81
непосредственное отношение к развитию инфекционно-токсиче'ского шока при псевдотуберкулезе.
Термостабильный летальный токсин — белок м.м. 45 кБа, который продуцируют 82,6% штаммов Y. pseudotuberculosis I — VI сероваров, выделенных .от больных людей и из внешней среды [12]. Продукция токсина наблюдается у бактерий, несущих как плазмиду вирулентности pYV, так и в сочетании с плазмидой pVM82, а также у бесплазмидных бактерий, что предполагает хромосомную детерминированность ТсТ у возбудителя псевдотуберкулеза. Этот токсин оказывал концентрационно-зависимое действие на активность анти-оксидантных ферментов (каталазы, глутатионредуктазы), апоптоз и жизнеспособность нейтрофилов крови крыс, причем развитие апоптоза происходило на фоне повышения активности указанных ферментов [2].
Таким образом, начиная с 2000 годов, значительно повысился интерес к дальневосточной скарлатиноподобной лихорадке, регистрирующейся в основном в России и Японии. Это своеобразное клиническо-эпидемическое проявление псевдотуберкулезной инфекции человека, известное с 1959 г., является генерализованным воспалительным заболеванием с полиорганной патологией, отличающимся от спорадической Y. pseudotuberculosis инфекции в Европе, протекающей в форме гастроэнтерита. Лишь в течение последних 10 лет были идентифицированы ДСЛ-ассоциированные геномные элементы Y. pseudotuberculosis, включающие плазмиды pYV и pVM82, кодирующие спектр факторов патогенности возбудителя. Установлена способность дальневосточных штаммов, одновременно несущих обе плазмиды, продуцировать суперантиген YPMa, Y. pseudotuberculosis-производный митоген А, играющий, вероятно, ключевую роль в патогенезе ДСЛ. Однако эффекты этого токсина и его взаимодействие с другими факторами вирулентности и иммунологической защитой организма хозяина еще недостаточно раскрыты. Вариабельность реагирования клеток врожденного иммунитета и форм повреждения клеток органов-мишеней, вызываемых различными по вирулентности плазмидными типами Y. pseudotuberculosis, может лежать в основе полиморфизма клинико-морфологических проявлений вызываемой ими инфекции, что требует дальнейших исследований на основе современных методических подходов. В конечном итоге, углубленное понимание зависимости механизмов иммуно-патогенеза болезни от молекулярной характеристики возбудителя раскрывает перспективы усовершенствования диагностики и прогнозирования тяжести течения псевдотуберкулеза и в целом иерсиниозов у человека.
ЛИТЕРАТУРА
1. ГинцбургАЛ., Шубин Ф.Н., Шовадаева Г.А. Новый признакпатогенносги, кодируемый плазмидой pVM82 Yersinia pseudotuberculosis. Генетика. 1988, 24(9): 1562-1571.
2. Долматова JI.С., Заика OA., Недашковская Е.П., Тимченко Н.Ф. Исследование механизмов апоптоз-модулирующего влияния термостабильного токсина Yersinia pseudotuberculosis и корригирующего действия экстракта из дальневосточных видов голотурий на нейтрофилы крыс in vitro. Тихоокеанский медицинский журнал. 2010,3:76-80.
3. Дробот Е.И. Реактивность клеток врожденного иммунитета при инфекции, вызванной разными плазмидными вариантами Y. pseudotuberculosis: Автореф. дис. канд. бисш. наук. Владивосток, 2015.
4. Исачкова JI.M., Жаворонков А.А., Антоненко Ф.Ф. Патология псевдотуберкулеза. Владивосток, Дальнаука, 1994.
5. Коновалова Ж.А. Бактерицццные механизмы фагоцитозаY pseudotuberculosis с разным набором плазмид: Автореф. дис. канд. биол. наук. Иркутск, 2002. ; ,
6. ЛитвиноваЛ.В.,ЦеневаПЯ.,ИвашиненкоА.П.идр.Генетическиеособенноста Yersinia pseudotuberculosis и эпидемиологические черты групповых заболеваний псевдотуберкулезом в организованных коллективах. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009, 3: 31-34.
7. Плехова Н.Г., Дробот Е.И., Тимченко Н.Ф. и др. Влияние термолабильного токсина Yersinia pseudotuberculosis на функции клеток врожденного иммунитета. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014,157 (4): 483-487.
8. Сомов Г.П. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. М., Медицина, 1979.
9. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. М., Медицина, 2001.
10. Сомова JI.M., Плехова Н.Г., Дробот Е.И. Новые аспекты патологии псевдотуберкулеза. Архив патологии. 2012, 74 (3): 60-64.
11. Сомова JI.M., Плехова Н.Г., Дробот Е.И. и др. Патоморфологические изменения при экспериментальнойтоксинемии,вызваннойтермолабильным токсином Yersinia pseudotuberculosis. Тихоокеанский медицинский журнал. 2010, 3: 65-67.
12. Тимченко Н.Ф., НедашковскаяЕ.П., ДолматоваЛ.С., Сомова-ИсачковаЛ.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток, Приморский полиграфкомбинат, 2004.
13. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002,3:248-266.
14. Шубин Ф.Н., Гинцбург А.Д.,-Китаев В.М. и др.. Анализ плазмидного состава штаммов Yersinia pseudotuberculosis и его применение для типирования возбудителя псевдотуберкулеза. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 1989,6: 20-25.
15. Шубин Ф.Н., Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Плазмиды Yersinia pseudotuberculosis и их значение в реализации эпидемического процесса при псевдотуберкулезе. Журн. микро-биод. 1985, 12: 53-56.
16. Шурыгина И.А., Чеснокова М.В., Климов В.Т. и др. Псевдотуберкулез. Новосибирск, Наука, 2003.
17. Achtman М., Zurth К., Morelli С. et al. Yersinia pestis, a cause of plaque, is a recently emerged clone ofYerswinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999,96:14043-14048.
18. BeigsbakenT., Cookson B.T. Macrophage activation redirects Yersinia-infected host cell death from apoptosis to caspase-1-dependent pyroptosis. PLoS Pathog. 2007, 33: el61.
19.Bergsbaken Т., Cookson В. T. Innate immune response during Yersinia infection: critical modulation of cell death mechanisms through phagocyte activation. J. Leukoc. Biol. 2009,86 (5): 1153-1158.
20. Blank C., Luz A., Bending S. et al. Superantigen and endotoxin synergize in the induction of lethal shock. Eur. J. Immunol. 1997,27: 825-833.
21. Brodsky I.E., R. Medzhitov R. Reduced secretion of YopJ by Yersinia limits in vivo cell death but enhances bacterial virulence. PLoS Pathog. 2008.4: el000067.
22. Brodsky I.E., Palm N.W., Sadanand S. et al. Yersinia effector protein promotes virulence by preventing inflammasome recognition of the type III secretion system. Cell. Host. Microbe. 2010,7 (5): 376-387.
23.Comelis G. The type III secretion injectisome, a complex nanomachine for intracellular 'toxin' delivery. Biol. Chem. 2010, 391 (7): 745-751.
24. Dube P. Interaction ofYersinia with the gut: mechanisms of pathogenesis and immune evasion. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2009, 337:61-91.
25.Eppinger M., Rosovitz M.J., Fricke W.E et al. The complete genome sequence ofYersinia
• pseudotuberculosis IP31758, the causative agent of Far Easr scarlet-like fever. PLos Genet.
2007, 3:e 142.
26. Fernandes-Alnemri Т., Wu J., Yu J.W. et al. The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation. Cell Death Differ. 2007,14:1590-1604.
27. Fink S.L., Cookson B.T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect. Immun. 2005, 73:1907-1916.
28.FukushimaH., MatsudaY., SekiR. Geographical heterogenicity between Far East and Vfestern countries in prevalence of the virulence plasmid, the superantigen Yersinia pseudotuberculosis derived mitogen and the high-pathogenicity island among Yersinia pseudotuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 2001,39: 3541-3547.
29. Jardetzky T.S., Brown J.H., Gorda J.C. et al. Three-dimensional structure of human class II histocompatibility molecule complexed with superantigen. Nature. 1994,368: 711-718.
30. Labbe K., Mclntire C.R., Doiron K. et al. Cellular inhibitors of apoptosis proteins cIAP2 are required for efficient caspase-1 activation by the inflammasome. Immunity. 2011,35 (6): 897-907.
31.Lilo S., Zheng Y., Bliska J.B. Caspase-1 activation in macrophages infected with Yersinia pestis KIM requires the type III secretion system effector YopJ. Infect. Immun. 2008, 76: 3911-3923.
32. Marketon M.M., DePaolo R.W., DeBord R.W. et al. Plaque bacteria target immune cells during infection. Science. 2005, 309:1739-1741.
33. Medzhitov R., Schneider D.S., Soares M.P. Disease tolerance as a defense strategy. Science. 2012, 335 (6071): 936-941.
34. Meinzer U., Barreau F., Esmiol-Welterlin S. et al. Yersinia pseudotuberculosis effector YopJ subverts the Nod2 rick Takl pathway and activates caspase-1 to induce intestinal barrier dysfunction. Cell. Host. Microbe. 2012,11 (4): 337-351.
35. Miyoshi-Akiyama T., Fujimaki W., Yan X. J. et al. Identification of murine T cells reactive with the bacterial superantigen Y. pseudotuberculosis—derived mitogen (YPM) and factors involved in YPM-induced toxicity in mice. Microbiol. Immunol. 1997,41: 345-352.
36. Moreau K., Lacas-Gervis S., Fujita N. et al. Autophagosomes can support Yersinia pseudotuberculosis replication in macrophages. Cell. Microbiol. 2010,12 (8): 108-123.
37. Norenberg D., Wieser A., Magistro G. et al. Molecular analysis ofa novel Toll/interleukin-1 receptor (TIR)-doman containing virulence protein of Y. pseudotuberculosis among Far East scarlet-like fever serotype I strains. Intern. J. Med. Microbiol. 2013, 303: 583-594.
38.0'Loughlin J.L., Spinner J.L., Minnich S.A., Kobayashi S.D. Yersinia pestis two-component gene regulatory systems promote survival in human neutrophils. Infect. Immun. 2010, 78 (2): 773-782.
39. Peters K.N., Dhariwala M.O., Hughes-Hanks J.M. Early apoptosis of macrophages modulated by injection of Yersinia pestis YopK promotes progression of primary pneumonic plague. PLoS Pathog. 2013,9 (4): el003324.
40. Sanmun D., Witasp E., Jitkaew S. et al. Involvment ofa functional NADPH oxidase in neutrophils and macrophages during programmed cell clearance: implications for chronic granulomatous disease. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2009, 3:621-631.
41. Sato K., Ouchi K., Taki M. et al. Yersinia pseudotuberculosis infection in children, resembling Izumi fever and Kawasaki syndrome. Pediatr. Infect. Dis. 1983,2:123-126.
42.Savina C., Martina. L., Bouchierb Ch. et al. The Yersinia pseudotuberculosis complex: Characterization and delineation ofa new species, Yersinia wautersii. Intern. J. Med. Microbiol. 2014, 304:452-463.
43. Shao F. Biochemical functions of Yersinia type III effectors. Curr. Opin. Microbiol. 2008,11: 21-29.
44. Silva M.T. When two is better than one: macrophages and neutrophils work in concert in innate immunity as complementary and cooperative partners of a myeloid phagocyte system. J. Leukoc. Biol. 2010,87(1): 93-106.
45. Spinner J.L., Cundiff J.A., Kobayashi S.D. Yersinia pestis type III secretion system-dependent inhibition of human polymorphonuclear leukocyte function. Infect. Immun. 2008,76:3754-3760.
46. Spinner J.L., Seo K.S., O'Loughlin J.L. et al. Neutrophils are resistant to Yersinia YopJ/P-induced apoptosis and are protected from ROS-mediated cell death by the type III secretion system. PLoS One. 2010,18: e9279.
47. Tseneva G.Y., Chesnokova M.V., Klimov V.T. et al. Pseudotuberculosis in the Russian Federation. Adv. Exp^ Med. Biol. 2012,954:63-68.
48.Tsubokura M., Orsuki K., Sato K. et al. Special features of distribution of Yersinia pseudotuberculosis in Japan. J. Clin. Microbiol. 1989, 27:790-791.
49. Zauberman A., Cohen S., Mamroud E. et al. Interaction of Yersinia pestis with macrophages: limitations in YopJ-dependent apoptosis. Infect. Immun. 2006,74:3239-3250.
50. ZippeliusA., Pittet M J., Batard P. et al. Thymus selection generates a large T cell pool recognizing a self-peptide in humans. J. Exp. Med. 2002,195:485-494. t
51. Zhang Y., Murtha J., Roberts M.A. et al. Type III secretion decreases bacterial and host survival following phagocytosis of Yersinia pseudotuberculosis by macrophages. Infect. Immun. 2008,76 (9): 4299-4310.
52. Zheng Y., LiloS., MenaR, BliskaJ.B. YopJ-inducedcaspase-1 activation in Yersinia-infected macrophages: independent of apoptosis, linked to necrosis, dispensable for innate host defense. PloS One. 2012, 7: e36019.
53. Viboud G.I., Bliska J.B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu. Rev. Microbiol. 2005, 59:69-89.
Поступила 10.05.16
Контактная информация: Сомова Лариса Михайловна, д.м.н., проф., 690087, Владивосток, ул. Сельская, 1, р.т. (8-423)244-14-48
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
В.И.Ефременко', А.АЕфременко2, Д.В. Ефременко1
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЭТИОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЛИХОРДЦКИ ЗАПАДНОГО НИЛА И КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ
'Ставропольский противочумный институт, Ставропольский государственный медицинский университет
Рассматриваются проблемные вопросы создания и практического внедрения специфических иммунобиологических препаратов, отсутствующих до настоящего времени, для* лечения и профилактики природно-очаговых арбовирусных инфекций—лихорадки Западного Нила (ЛЗН) и Крымской геморрагической лихорадки (KTJI). На территориях Южного и Северо-Кавказского федеральных округов России сформировались стойкие природные очаги ЛЗН и КГЛ с эпидемическими проявлениями. В центральных регионах России и в Сибири обнаруживаются маркеры вируса Западного Нила, а среди здорового населения также определяется наличие иммунной прослойки кэтой инфекции. Проведенный анализ литературных источников формирует теоретическую основу для создания новых специфических препаратов для этиотропной терапии и профилактики ЛЗН и КГЛ. В качестве сырья возможно использование крови здоровых доноров с достаточно высокими титрами иммуноглобулинов класса G, проживающих в некоторых субъектах Российской Федерации на территории природных очагов с наиболее интенсивным эпидемическим процессом.
Журн. микробиол., 2016, № 6, С. 85-93
Ключевые слова: лихорадка Западного Нила, Крымская геморрагическая лихорадка, лечение, профилактика, иммунобиологические препараты
VJ.Efremenko1, A.A.Efremenko2, A V.EJremenko1
THEORETICAL ASPECTS OF CREATION OF SPECIFIC PREPARATIONS FOR ETIOTROPIC THERAPY AND PROPHYLAXIS OF WEST NILE FEVER AND CRIMEAN HAEMORRHAGIC FEVER
'Stavropol Institute for Plague Control, 2Stavropol State Medical University, Russia
Problematic issues on creation and practical introduction of specific immune biologic preparations for therapy and prophylaxis of natural-foci arbovirus infections — Wfest Nile fever (WNF) and Crimean hemorrhagic fever (CHF), that are not available until now, are examined. Persistent natural foci of WNF and CHF with epidemic manifestations have formed in Southern and North Caucasian Federal Districts of Russia. Markers of Wfest Nile virus are being detected in central regions of Russia and Siberia, and the presence of fraction of population immune to this infection
