CC BY
65
УДК 597-154. 31: 577.15
ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ ГЛИКОЗИДАЗЫ РЫБ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕНИЯ
ТЕМПЕРАТУРЫ СРЕДЫ (ОБЗОР)
И. Л. Голованова, В. К. Голованов
Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузскийр-н, e-mail: golovanova5353@mail.ru
Проанализировано влияние повышения температуры окружающей среды на характеристики гликози-даз (ферментов, гидролизующих углеводы) у рыб разных экологических групп. Показано влияние скорости повышения температуры водной среды на активность и температурные характеристики пищеварительных гликозидаз, а также их чувствительность к действию тяжелых металлов. При низких скоростях нагрева воды 0.04°С/ч (около 1°С/сут) рыбы в течение 2-4 недель могут акклимироваться к постепенному повышению температуры, и активность гликозидаз (амилолитическая активность, а-амилаза) увеличивается во все сезоны года. Более высокие скорости нагрева 4—50°С/ч повышают активность гликозидаз летом и, как правило, снижают ее в 2-7.5 раз в другие сезоны года. Резкое повышение температуры окружающей среды в осенне-зимний период, противоречащее сезонному ходу событий, не позволяет организму приспособиться к быстро меняющимся условиям и снижает эффективность начальных этапов ассимиляции пищи у рыб. Несмотря на рост активности гликозидаз с увеличением скорости нагрева воды в летний период снижение термостабильности ферментов и их устойчивости к действию тяжелых металлов может негативно влиять на интенсивность пищеварения в условиях теплового загрязнения. Поскольку температурные и трофические условия в значительной мере определяют эффективность питания рыб, изменения пищеварительной функции при постепенном или резком изменении температуры позволяют прогнозировать последствия глобального потепления климата, термального загрязнения водной среды, изоляции мелководных водоемов, а также рыбоводных работ, связанных с изменением температуры воды.
Ключевые слова: рыбы, пищеварение, гликозидазы, увеличение температуры среды.
Принято считать, что температурные и трофические условия среды в наибольшей степени определяют условия роста, накопления биомассы и, в конечном счете, продуктивность популяций рыб, обитающих в пресноводных водоемах (Бретт, 1983). В последние десятилетия наблюдается процесс глобального потепления климата, вызванный как естественными, так и антропогенными факторами (Изменения ...., 2002; Кляшторин, Любушин, 2005). В северной части умеренной климатической зоны зимы стали более теплыми, а в летнее время наблюдаются периоды экстремально высоких значений температуры, нередко достигающих в прибрежной части водоемов 30-32°С (Попова, 2003).
Температура является одним из важнейших абиотических факторов среды, определяющих основные параметры жизнедеятельности рыб. Некоторые виды рыб выдерживают колебания в несколько десятков градусов (эвритермные виды), другие приспособлены жить в более узком температурном диапазоне (стенотермные). Для видов, обитающих в умеренных широтах России, этот диапазон составляет приблизительно от 0 до 38°С (Шмидт-Ниельсен, 1982). Изменение температуры приводит к значительным изменениям скорости метаболических процессов, темпа роста, интенсивности питания и скорости переваривания пищи (Alabaster, Lloyd, 1982). В то же время, даже кратковременные изменения температуры до значений, лежащих за границами метаболического оптимума, могут привести к нарушению равновесия обмена веществ, инактивации и денатурации ферментов, и, как следствие, к гибели организма (Константинов, 1979). Изучение температурной толерантности рыб становится все более актуальным в связи с проблемой антропогенного термического загрязнения водной среды сбросными подогретыми водами промышленных предприятий (Голованов, 2013а). Резкие нехарактерные для сезона изменения температуры воды в естественных водоемах наблюдаются в зонах сброса вод атомных и тепловых электростанций, часто используемых для рыборазведения. Наложение глобального потепления климата на локальное термическое загрязнение может привести к гибели гидробионтов даже при нормативном сбросе подогретой воды в естественные водоемы. Поэтому крайне важным становится не только выявление термоустойчивости разных видов рыб, но и оценка действия критических значений температуры на функционирование различных систем организма, в том числе и пищеварительной системы.
Известно, что ферменты пищеварительного тракта рыб хорошо адаптированы к температурным условиям среды обитания (Уголев и Кузьмина, 1993). В экспериментах in vitro установлено, что в зоне физиологической температуры наблюдается прямая зависимость между ростом температуры инкубационной среды и активностью пищеварительных гидролаз, обусловленная прямым влиянием температуры на ферменты. Значения температурного оптимума гликозидаз у пресноводных костистых рыб лежат в пределах 30—65°С, протеиназ, гидролизующих белки — в пределах 50—60°С (Уго-
лев, Кузьмина, 1993). Дальнейшее повышение температуры инкубационной среды, выходящее за пределы температурного оптимума ферментов, приводит к резкому снижению их активности.
Для анализа механизмов температурных адаптаций рыб к постоянно меняющимся условиям окружающей среды широко используют определение верхней летальной и сублетальной температуры при различных скоростях нагрева воды (от 0.01 до 60°С/ч). При этом установлены как видовые различия, так и зависимость этих показателей от возраста рыб, сезона года, температуры предварительной акклимации и скорости изменения температуры окружающей среды (Beitinger et al., 2000; Голованов, 20136). Многие авторы отмечают значительное уменьшение уровня верхней летальной температуры зимой по сравнению с летом, что может являться вероятной причиной массовой гибели рыб при сбросах теплой воды в водоемы в зимний период. В опытах in vivo было установлено влияние повышения температуры акклимации на активность пищеварительных ферментов рыб (Hofer, 1979; Кузьмина, Поддубная, 1986). В последние годы появился ряд работ по изучению активности пищеварительных гидролаз (преимущественно гликозидаз) кишечника рыб (Голованова, 2004, 2006; Голованова и др., 2002, 2005, 2009; Golovanova et al., 2013) и активности ацетилхолинэстеразы мозга (Голованов и др., 2015) в области верхних сублетальных значений температуры при различных скоростях нагрева воды.
Скорость повышения температуры окружающей среды может оказывать разное влияние на уровень активности гликозидаз в зависимости от вида рыб и сезона года (Golovanova et al., 2013). В экспериментах на молоди четырех видов рыб (карп Cyprinus carpió (L.), карась серебряный Carassius auratus (L.), плотва Rutilus rutilus (L.) и окунь Perca fluviatilis L.) температуру воды в аквариумах повышали со скоростью 0 (контрольная группа), 0.04, 4, 10, 17, 32 и 50°С/ч до нарушения локомоторной функции рыб (поворот на бок). Значения температуры в этой точке соответствуют верхней сублетальной температуре, так называемый критический термический максимум (КТМ). Значения КТМ, полученные в этих экспериментах не превышали 40°С, а прекращение дальнейшего нагрева воды сохраняло жизнеспособность рыб. Уровень амилолитической активности (отражающей суммарную активность ферментов, гидролизующих полисахарид крахмал: а-амилазы, глюкоамилазы и мальтазы) во все сезоны, исключая зиму, у молоди карася и карпа контрольной группы в 2-3 раза выше, чем у плотвы, и в 30-50 раз выше, чем у окуня (рис. 1), что хорошо согласуется с полученными ранее данными (Уголев, Кузьмина, 1993; Голованова, 2010). При медленном повышении температуры воды со скоростью 0.04°С/ч ферментативная активность у исследованных видов увеличивается во все сезоны года, причем зимой у карася на 50%, у карпа и плотвы лишь на 23-25% от контроля. Летом у всех исследованных видов отмечено последовательное возрастание уровня ферментативной активности с увеличением скорости нагрева воды. При этом максимальная ферментативная активность, отмеченная при скорости 50°С/ч, превышает минимальную у карася в 1.6, у карпа в 1.8, у плотвы в 2.2 раза, в то время как у окуня лишь в 1.2 раза. Осенью наибольшая активность ферментов у всех видов рыб отмечена при скорости нагрева 0.04°С/ч. Максимальное снижение амилолитической активности на 50-60% от контроля выявлено у карпа и карася при скорости нагрева 17°С/ч, у плотвы — на 87% при скорости 4°С/ч, у окуня достоверные изменения отсутствуют. В весенне-зимний период характер изменения ферментативной активности при увеличении скорости нагрева воды у карпа и карася несколько различается. Так, если у карася достоверное снижение амилолитической активности на 3040% от контроля наблюдается лишь при скоростях нагрева воды 32-50°С/ч, то у карпа — на 25-51% от контроля во всем диапазоне исследованных скоростей нагрева воды (исключая 50°С/ч весной). В то же время у плотвы наибольшее снижение ферментативной активности в зимний и весенний период отмечено при скорости нагрева воды 4°С/ч. Большая устойчивость гликозидаз молоди окуня к действию температуры по сравнению с рыбами сем. Cyprinidae согласуется с данными о меньшем влиянии температуры на гликозидазы хищных рыб, питающихся в течение всего годового цикла, по сравнению с всеядными видами, питание которых прекращается при температуре, ниже 7°С. Так активность а-амилазы у рыб, не питающихся в зимний период при температуре 0°С составляет 10-15%, у питающихся — 50-70% от максимальной активности (Уголев, Кузьмина, 1993).
Амилолитическая активность слизистой оболочки кишечника головешки-ротана Perccottus glenii (Dyb) — вида, обладающего повышенной устойчивостью к действию неблагоприятных факторов (Бознак, 2004), также снижается с ростом температуры воды в зимний период. Однако, гликози-дазы ротана более устойчивы к высоким скоростям нагрева воды (17 и 44°С/ч) зимой по сравнению с одноименными ферментами рыб сем. Cyprinidae (Голованова и др., 2009).
s
? 105 ■
u
<3 70 s
i35
0
□ Осень ПЗима □ Весна ПЛето
b c c
b
ffl
cd
a i
ED
0.04
10
17
32
50
140 -|
S 105 ■ • u
§ 70-
1 35-< <
0 ■
v
cf
b
■I
f a
0.04
10
17
32
50
60
s
s 45
30 15 H 0
<C
<c
a a
a ad
c
c
£
b
П
d± b
d
c
£
bc
Г
0.04
10
17
32
50
и s
s •
i- 4 .
ч о
<C <C
□ Осень
□ Лето b
0.04 4 10 17 32
Скорость повышения температуры воды, °С/ч
50
Рис. 1. Амилолитическая активность (АА) в кишечнике молоди рыб при разных скоростях нагрева воды (0, 0.04, 4, 10, 17, 32 и 50°С/ч) в разные сезоны (осень, зима, весна, лето) у карася (а), карпа (б), плотвы (в), окуня (г). Данные представлены в виде средних значений и их ошибки (n=6) в микромолях продуктов реакции, образующихся в 1 мин инкубации на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/(г-мин)). Разные латинские буквы указывают на статистически значимые различия показателей при разной скорости нагрева воды в течение каждого сезона (ANOVA, LSD-test). (По: Golovanova et al., 2013).
а
a
a
d
c
b
b
b
a
b
b
b
b
b
b
a
c
b
a
0
4
б
b
e
d
e
a
c
b
c
a
d
a
e
b
b
b
a
d
c
c
0
4
в
d
d
b
c
b
b
a
b
a
a
c
c
0
4
г
6
b
a
a
a
a
a
a
a
a
2
0
0
Кроме того, продемонстрировано разное влияние повышения температуры окружающей среды на активность панкреатических (а-амилаза) и собственно мембранных (сахараза) гликозидаз (Голованова и др., 2005, 2009). Так, у карася в зимний период при низких скоростях нагрева воды (0.04°С/ч) амилолитическая активность повышается на 151%, активность а-амилазы — на 382%, в то время как активность сахаразы уменьшается на 89% от контроля (рис. 2). Аналогичная направленность изменений активности гликозидаз выявлена и у карпа.
<
M
03 &
оЗ 4
« <
10 16 32 50
0,1
0,1
180
б
90
8
в
90
45
0
0
0
0
4
10 16
32
50
0
4
10
16
32
50
0 0,1
4
Скорость повышения температуры воды, °С/ч
Рис. 2. Амилолитическая активность, АА (а), активность а-амилазы (б) и активность сахаразы (в) в кишечнике молоди карпа (1) и карася (2) при разных скоростях нагрева воды (0, 0.01, 4, 10, 16, 32 и 50°С/ч) в зимний сезон. Данные представлены в виде средних значений и их ошибки, (n=6).
В то же время у ротана повышение температуры воды в зимний период со скоростью 4 и 10°С/ч снижает амилолитическую активность и активность сахаразы в 1.5 раза, однако при самой высокой скорости нагрева воды (44°С/ч) активность сахаразы растет (табл. 1). Различия в величине и направленности эффекта, по всей вероятности, могут быть обусловлены большей адаптационной пластичностью панкреатической а-амилазы, стоящей в начале ферментативной цепи, по сравнению с собственно кишечными ферментами (глюкоамилазой, мальтазой, сахаразой), локализованными в мембране энтероцитов и осуществляющими промежуточные и заключительные этапы гидролиза углеводов. В то же время, наблюдаемые различия при действии разной скорости повышения температуры воды могут быть обусловлены не только изменением свойств ферментов, гидролизующих крахмал, но и изменением их соотношения.
Таблица 1. Влияние скорости нагрева воды в зимний период на амилолитическую активность и активность сахаразы (мкмоль/(г-мин)) в слизистой оболочке кишечника ротана
Показатели Скорость нагрева воды, °С/ч
0 4 10 17 44
Амилолитическая активность 10.5 ± 0.29а 7.47 ± 0.13б 8.80 ± 0.15б, с 9.44 ± 1.17а, с 9.75 ± 0.34а, с
Активность сахаразы 2.24 ± 0.02а 1.51 ± 0.06б 1.41 ± 0.08б 2.35 ± 0.05а, с 2.44 ± 0.03с
Примечание: приведены средние значения показателя и его ошибка; разные индексы в строке указывают на достоверные статистические различия между вариантами опыта для каждого показателя (ANOVA, LSD-test, p < 0.05). (По: Голованова и др., 2009).
Поскольку одной из возможных причин снижения уровня активности пищеварительных гидро-лаз, отмеченного в зимний, весенний, и особенно в осенний периоды годового цикла при высоких скоростях нагрева воды, может быть прямое повреждающее действие температуры на ферменты, для анализа механизмов наблюдаемых явлений было проведено изучение влияния температуры на скорость гидролиза углеводов в экспериментах in vitro (Голованова и др., 2005, 2009; Голованова, 2006).
Так как уровень КТМ не превышал 40°С, исследование влияния температуры in vitro на амилолитическую активность кишечника карпа и серебряного карася проводили в температурном диапазоне от 0 до 40°С (Голованова и др., 2005). Уровень амилолитической активности увеличивается с ростом температуры инкубационной среды, однако характер изменения ферментативной активности
существенно различался у рыб контрольной группы и рыб, находившихся в условиях повышения температуры воды (рис. 3).
200 -
-а
Ч о
-а
н о о
и «
S
£ Л
W о
(D
4 §
5
100 -
620 г
310 -
10 20 30
Температура инкубации, °С
Рис. 3. Влияние температуры инкубационной среды (°С) и повышения температуры воды in vivo на амилолити-ческую активность (мкмоль/(гмин)) в кишечнике карпа (а) и карася (б) в осенний период. Скорость повышения температуры воды: 1 — 0, 2 — 0.1, 3 — 4, 4 — 10, 5 —16, 6 — 32, 7 — 50°С/ч. (По: Голованова и др., 2005).
Особенно отчетливо эти различия проявились в интервале температуры инкубации 30-40°С. Так, значения коэффициента Q10, позволяющего количественно оценить влияние температуры на скорость реакции, в осенний период у контрольных особей карася составили 2.3, у рыб, содержавшихся при увеличении температуры воды со скоростью 0.1 и 50°С/ч — 1.9 и 1.7 соответственно. Значительное снижение величины этого показателя при увеличении уровня тепловой нагрузки осенью может свидетельствовать о более сильном повреждающем действии высоких скоростей нагрева воды на активность пищеварительных ферментов в этот период. Кроме того, изучение влияния температуры в экспериментах in vitro на амилолитическую активность слизистой оболочки кишечника серебряного карася в летний период позволило выявить смещение температурного оптимума с 60°С у рыб контрольной группы до 30°С у рыб, содержавшихся при скорости нагрева воды 50°С/ч, свидетельствующее об уменьшение термостабильности ферментов при резком повышении температуры среды (рис. 4). При этом также отмечено увеличение относительной активности ферментов в зоне физиологических значений температуры при нагреве воды со скоростью 50°С/ч.
При изучении амилолитической активности кишечника ротана in vitro в диапазоне температуры инкубации от 0 до 70°С (рис. 5) установлено, что температурный оптимум гидролиза крахмала у рыб контрольной группы равен 50°С (Голованова и др., 2009). Температурный оптимум гидролиза крахмала у рыб, содержавшихся при повышении температуры воды со скоростью 44°С/ч, также отмечен при 50°С. Дальнейшее повышение температуры инкубационной среды с 50 до 70°С снижает амилолитическую
активность у опытных рыб в 2.1, у контрольных — лишь в 1.7 раза, свидетельствуя о меньшей устойчивости гликозидаз рыб опытной группы к температурной денатурации белка.
140
0
0
10 20 30 40 50 60 70
Температура инкубации, оС
Рис. 4. Влияние температуры инкубационной среды (°С) на амилолитическую активность, АА (мкмоль/(гмин)) в кишечнике карася в летний период при скорости нагрева воды in vivo 4°С/ч (1) и 50°С/ч (2), (n = 6). (По: Голованова, 2006).
Кроме того, величина температурного коэффициента Qio в интервале физиологических значений температуры 10-20°С снижается от 2.3 у контрольных рыб до 1.7 у опытных (p < 0.05), что согласуется с данными, полученными на молоди карповых видов рыб (Голованова и др., 2005) и свидетельствует о снижении термостабильности ферментов при резком повышении температуры воды в зимний период.
Рис. 5. Влияние температуры инкубационной среды (°С) in vitro на амилолитическую активность, АА (мкмоль/(гмин)) слизистой оболочки кишечника ротана контрольной (1) и опытной (2) групп. (По: Голованова и др., 2009).
Хорошо известно, что при изменении температуры среды обитания адаптации пищеварительной системы животных реализуются главным образом благодаря перестройкам ферментных систем и липидного матрикса мембран (Уголев, Кузьмина, 1993). Активность гликозидаз, локализованных на мембране энтероцитов, в значительной мере зависит от жирнокислотного состава липидного матрикса мембран. Летом преобладают насыщенные жирные кислоты, в то время как зимой увеличивается количество ненасыщенных жирных кислот, позволяющее мембранам поддерживать жидкокристаллическую структуру при низкой температуре (Hochachka, Somero, 1973). Регуляция скорости ферментативных процессов осуществляется преимущественно на клеточном и молекулярном уровне посредством изменения концентрации и свойств ферментов (Hochachka, Somero, 2002). В экспериментах in vivo изменение активности пищеварительных гидролаз с ростом температуры окружающей среды может свидетельствовать как об изменении интенсивности синтеза соответствующих ферментов, так и условий их функционирования. Ранее было показано, что зимой при акклимации сеголетков карпа к высокой температуре (35°С) со скоростью 0.04°С/ч амилолитическая активность и активность щелочной фосфатазы увеличиваются в 2-3 раза, активность сахаразы, напротив, достоверно снижается в
25
0
10
20 30 40 50
Температура инкубации, °С
60
2-4 раза, по сравнению с рыбами, акклимированными к 13°С (Кузьмина, Поддубная, 1986). Аналогичное повышение уровня амилолитической активности у серебряного карася, акклимированного к 3°С в зимний период, выявлено в нашей работе при повышении температуры воды со скоростью 0.04°С /ч (Оо1оуапоуа й а1., 2013). Поскольку для синтеза новых пищеварительных ферментов требуется, по крайней мере, несколько суток, а продолжительность резкого температурного воздействия в наших экспериментах не превышала 8.5 ч, снижение активности гликозидаз при скоростях нагрева воды от 4 до 17°С /ч, по всей вероятности, обусловлено изменением свойств ферментов, а не их количества. Кроме того, поскольку амилолитическая активность отражает суммарную активность ферментов, гидролизующих полисахарид крахмал: а-амилазы, глюкоамилазы и мальтазы, наблюдаемые различия при действии разной скорости повышения температуры воды могут быть обусловлены не только изменением свойств указанных ферментов, но и изменением их соотношения.
Температура и тяжелые металлы являются наиболее распространенными экологическими стрессорами и их значение возрастает вследствие глобального изменения климата и антропогенного загрязнения. Экспозиция к химическим веществам может сделать рыб более чувствительными к температурному стрессу, и наоборот, температурный стресс может сделать организм более чувствительным к действию химических веществ. На примере молоди карпа показано, что резкое повышение температуры воды в зимний период со скоростью 50°С/ч увеличивает чувствительность пищеварительных гликозидаз, особенно панкреатической а-амилазы, к негативному действию ионов кадмия, не являющегося необходимым элементом (Голованова, 2004). В присутствии кадмия в концентрации 5-50 мг/л амилолитическая активность и активность а-амилазы достоверно снижаются у карпов как контрольной, так и опытной групп (табл. 3). Максимальное снижение амилолитической активности не превышает 50% у рыб обеих групп, в то время как активность а-амилазы снижается в большей степени у рыб опытной (на 93%), чем контрольной (на 53%) группы.
Таблица 3. Влияние скорости повышения температуры in vivo на устойчивость пищеварительных гликозидаз карпа (над чертой) и карася (под чертой) к действию кадмия в зимний период
Скорость Концентрация Cd in vitro, мг/л
повышения
температуры, 0 0.5 5 25 50
°С/час
Амилолитическая активность, мкмоль/(г-мин)
0 44.5 ± 1.4 41.7 ± 2.0 30.9 ± 1.2** 27.7 ± 1.4** 22.6 ± 1.6**
15.8 ± 1.1 14.1 ± 0.2 13.7 ± 0.2 13.4 ± 0.3 11.9 ± 0.04*
50 30.3 ± 0.5 28.6 ± 1.0 25.5 ± 1.3** 21.1 ± 0.3** 15.1 ± 0.3**
12.0 ± 0.3 11.4 ± 0.4 11.2 ± 0.4 10.5 ± 0.5** 9.2 ± 0.3***
Активность сахаразы, мкмоль/(г-мин)
0 4.0 ± 0.1 3.9 ± 0.1 3.8 ± 0.1 3.8 ± 0.1 3.7 ± 0.1*
4.8 ± 0.1 4.6 ± 0.1 4.6 ± 0.1 4.6 ± 0.0 4.4 ± 0.0
50 2.7 ± 0.1 2.7 ± 0.1 2.5 ± 0.1 2.4 ± 0.1*** 2.2 ± 01***
3.7 ± 0.2 3.6 ± 0.1 3.5 ± 0.1 3.1 ± 0.2 2.2 ± 0.1*
Активность а-амилазы, мг/(г-мин)
0 39.6 ± 0.4 36.3 ± 0.4 35.1 ± 0.7** 29.4 ± 1.4** 18.8 ± 1.8**
50 31.0 ± 1.4 29.8 ± 0.4 25.3 ± 1.1** 13.1 ± 1.0** 2.0 ± 0.7**
- - - - -
Примечание: приведены средние значения показателя и его ошибка (n = 12); различия показателей в строке достоверны по сравнению с контролем (0 мг Cd/л) при: * — р < 0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.001 (ANOVA, LSD-test). (-) — данные отсутствуют. (По: Голованова, 2004).
Активность сахаразы снижается лишь у рыб опытной группы: у карпа на 12 и 20% при концентрации кадмия 25 и 50 мг/л, у карася — на 40% при 50 мг/л кадмия. Амилолитическая активность в кишечнике карася снижается на 24% при 50 мг/л кадмия у рыб обеих групп, однако у особей опытной группы и более низкая (25 мг/л) концентрация кадмия вызывает достоверное уменьшение ферментативной активности. При этом в большинстве случаев отмечено статистически значимое (р < 0.01) взаимодействие двух факторов — повышения температуры воды и присутствия кадмия (Голованова, 2004).
Кроме того, высокая скорость нагрева воды может усиливать токсическое действие биогенных
металлов на активность гликозидаз кишечника рыб при нагреве воды в летний период (Голованова Голованов, 2014). Повышение чувствительности ферментов, гидролизующих крахмал, у молоди серебряного карася, карпа, плотвы и окуня к действию ионов меди и цинка в концентрации 0.1-25 мг/л происходит за счет снижения ферментативной активности при более низких концентрациях металлов. Тормозящий эффект ионов меди и цинка, как правило, выше при скорости нагрева 50°С/ч, чем при скорости 4°С/ч. Гликозидазы окуня менее чувствительны к повышению температуры и действию ионов меди по сравнению с ферментами карповых видов рыб.
Изучение кинетических характеристик гидролиза крахмала, осуществляемого гликозидазами, функционирующими в составе слизистой оболочки кишечника карася, свидетельствует об отсутствии адаптивных изменений сродства ферментов к субстрату при увеличении тепловой нагрузки (Голованова и др., 2004). Действительно, величины константы Михаэлиса (Km), характеризующей сродство фермента к субстрату, при скоростях нагрева воды 4 и 44°С /ч оказались близки — 1.3 и 1.5 г/л, соответственно. Ранее при изучении кинетики гидролиза крахмала у ряда видов пресноводных рыб также было показано отсутствие адаптивных изменений этого параметра: значения кажущейся Km во все сезоны года при температуре 0°С были выше (сродство фермента к субстрату ниже), чем при 20°С (Уголев, Кузьмина, 1993).
В опытах in vitro выявлено снижение термостабильности ферментов и их устойчивости к действию тяжелых металлов при увеличении тепловой нагрузки в летний период (Голованова и др., 2004). Так, в присутствии меди и цинка температурный оптимум амилолитической активности при скорости повышения температуры воды 4°С/ч равен 60°С (рис. 6). Более высокий уровень тепловой нагрузки выявил различия в характере зависимости активности гликозидаз от температуры инкубации в присутствии меди по сравнению с контролем, наиболее ярко проявляющиеся в диапазоне температуры 20-40°С, а также наличие двух равных по величине оптимумов (30 и 60°С) в присутствии цинка. Последнее может быть связано как с разной степенью стабилизации различных ферментов (а-амилазы, глюкоамилазы и ферментов группы мальтаз) в суммарных пробах гомогената, так и наличием разных изоформ указанных ферментов.
Температура инкубации, °С
Рис. 6. Влияние температуры инкубационной среды на амилолитическую активность, АА (мкмоль/(г-мин) в кишечнике карася при скорости нагрева воды 4 (а) и 44°С/час (б). 1 — контроль, 2 — медь (25 мг/л), 3 — цинк (25 мг/л). (По: Голованова и др., 2004).
Таким образом, проведенный анализ продемонстрировал зависимость интенсивности гидролиза углеводов в кишечнике рыб от скорости повышения температуры водной среды. При низких скоростях нагрева около 1°С/сут. рыбы в течение 2-4 недель могут акклимироваться к постепенному повышению температуры, и активность гликозидаз (амилолитическая активность, а-амилаза), а, следовательно, и скорость начальных этапов ассимиляции углеводов, увеличивается во все сезоны года. Более высокие скорости нагрева воды 4-50°С/ч повышают амилолитическую активность летом и, как правило, снижают ее в 2-7.5 раз в другие сезоны года. Резкое повышение температуры окружающей среды в осенне-зимний период, когда рост температуры среды противоречит сезонному ходу событий, не позволяет организму приспособиться к быстро меняющимся условиям и уровень амилолитической активности, активности а-амилазы и сахаразы в кишечнике рыб снижаются, негативно влияя на эффективность переваривания углеводных компонентов пищи. Несмотря на повышение активности пищеварительных гликозидаз при увеличении тепловой нагрузки в летний период снижение термостабильности ферментов и их устойчивости к действию тяжелых металлов, выявленное в опытах in vitro, может негативно сказаться на интенсивности пищеварения. Поскольку углеводы играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене организма, приведенные материалы позволяют прогнозировать последствия
теплового и химического загрязнения водоемов на гидролиз углеводных компонентов корма и углеводный обмен у рыб при разной скорости повышения температуры окружающей среды.
Исследование выполнено при поддержке Программы фундаментальных исследований Отделения биологических наук РАН "Динамика в условиях глобальных климатических и антропогенных воздействий" и Программ Президента РФ "Ведущие научные школы" НШ-719.2012.4 и НШ-2666.2014.4 "Экологические аспекты адаптаций и популяционная организация у рыб".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бретт Дж. Р. Факторы среды и рост // Биоэнергетика и рост рыб. М.: Легкая и пищ. пром-сть, 1983. С. 275-346. Brett Dzh. R. Faktory sredy i rost // Biojenergetika i rost ryb. M.: Legkaja i pistah. prom-st', 1983. S. 275-346. [Brett J.R. Environmental factors and growth // Fish physiology. V. VIII. Bioenergetics and growth / W.S. Hoar, D.J. Randall, J.R. Brett (Eds.). New York: Academic Press, 1979. P. 599-675.] In Russian. Голованов В.К. Температурные критерии жизнедеятельности пресноводных рыб. Москва: Полиграф-Плюс, 2013а. 300 с. Golovanov V. K. Temperaturnye kriterii zhiznedeiatel'nosti presnovodnykh ryb. Moscow, Poligraf-Plius Publ., 2013а. 300 s. [Golovanov V.K. Temperature criteria of the life activity of freshwater fish / Golovanov V.K.; IBIW RAS. Moscow: POLIGRAF-PLUS, 2013а. 300 p.] In Russian Голованов В. К. Эколого-физиологические закономерности распределения и поведения пресноводных рыб в термоградиентных условиях // Вопр. ихтиологии. 2013б. Т. 53, № 3. С. 286-314. Golovanov V. K. Ekologo-fiziologicheskie zakonomernosti raspredeleniya i povedeniya presnovodnykh ryb v termogradientnykh usloviyakh. Voprosy ikhtiologii, 2013b. T. 53. № 3. S. 286-314. [Golovanov V.K. Ecophysiological patterns of distribution and behavior of freshwater fish in thermal gradients // J. Ichthyol. 2013b. Vol. 53. № 4. P. 252-280. DOI: 10.1134/S0032945213030016]. Голованов В.К. Чуйко Г.М., Подгорная В.А. Головкина Е.И., Некрутов Н.С. Динамика активности ацетилхо-линэстеразы и водорастворимых белков в головном мозге рыб при разных скоростях нагрева в летний сезон года // Тр. Карел. НЦ РАН. Сер. Эксперим. биология. 2015. № 12. С. 116-123. Golovanov V.K. Chuiko G.M., Podgornaya V.A. Golovkina E.I., Nekrutov N.S. Dinamika aktivnosti atsetilkholinesterazy i vodorastvorimykh belkov v golovnom mozge ryb pri raznykh skorostyakh nagreva v letnii sezon goda // Trudy Karel. NC RAN. Ser. Eksperim. biologiya. 2015. № 12. S. 116-123. [Golovanov V.K., Chuiko G.M., Podgornaya V.A., Golovkina E.I., Nekrutov N.S. Dynamics of acetylcholinesterase activity and water-soluble proteins in the brain fish at different speeds heating in the summer season of the year // Proceedings Karel. SC RAS. Ser. Experimental biology. 2015. No. 12. P. 116-123. DOI: 10.17076/eb255] In Russian. Голованова И.Л. Влияние различных факторов на устойчивость пищеварительных карбогидраз рыб к действию кадмия // Биология внутр. вод. 2004. № 2. C. 76-83. Golovanova I.L. Vliyanie razlichnykh faktorov na ustoichivost' pishchevaritel'nykh karbogidraz ryb k deistviyu kadmiya // Biologiya vnutr. vod. 2004. № 2. S. 76-83. [Golovanova I.L. Influence of various factors on the stability of digestive carbohydrases fish to the action of cadmium // Inland Water Biology. 2004. No. 2. P. 76-83.] In Russian. Голованова И.Л. Влияние природных и антропогенных факторов на гидролиз углеводов у рыб и объектов их питания // Дисс. ...докт. биол. наук. СПб, 2006. 256 с. Golovanova I.L. Vliyanie prirodnykh i antropogennykh faktorov na gidroliz uglevodov u ryb i ob'ektov ikh pitaniya // Diss. ...dokt. biol. nauk. SPb. 2006. 256 s. [Golovanova I.L. Influence of natural and anthropogenic factors on the hydrolysis of carbohydrates in fish and their food objects // Diss. ... doctor. biol. sciences. St. Petersburg, 2006. 256 p.] In Russian. Голованова И.Л. Влияние биогенных металлов (Cu, Zn) на активность карбогидраз молоди рыб // Биология внутр. вод. 2010. № 1. С. 98-103. [Golovanova I.L. Influence of biogenic metals (Cu, Zn) on the activity of carbohydrases in juvenile fish in vitro // Inland Water Biology. 2010. Vol. 3. No. 1. P. 90-95. DOI: 10.1134/S1995082910010128]. In Russian. Голованова И.Л., Голованов В.К. Влияние скорости повышения температуры воды на чувствительность пищеварительных гликозидаз рыб к действию меди и цинка // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2014. Т. 50. № 1. С. 25-30. [Golovanova I. L., Golovanov V. K. Effect of rate of increase of water temperature on sensitivity of fish digestive glycosidases to action of copper and zinc // J. Evol. Biochem. Physiol. 2014. Vol. 50. No. 1. P. 2733. DOI: 10.1134/S0022093014010046]. In Russian. Голованова И.Л., Кузьмина В.В., Голованов В.К. Воздействие высоких температур на пищеварительные гидролазы серебряного карася Carassius carassius L. // Вопр. ихтиологии. 2002. Т. 42. № 1. С. 121-128. [Golovanova I.L., Kuzmina V.V., Golovanov V.K. Influence of high temperatures on the digestive hydrolases of goldfish Carassius auratus // J. Ichthyol. 2002. Vol. 42. № 1. P. 116-123. DOI: 10.13140/RG.2.1.4080.4966]. In Russian. Голованова И.Л., Смирнов А.К., Голованов В.К. Влияние повышения температур воды в осенне-зимний период на активность карбогидраз молоди карповых рыб (сем. Cyprinidae) // Биология внутр. вод. 2005. № 3. С. 87-90. [Golovanova I.L., Smirnov A.K., Golovanov V.K. Influence of the rise in water temperatures in autumn and winter on carbohydrase activity in young fish of the family Cyprinidae // Inland Water Biology. 2005. Vol. 2. P. 87-90.] In Russian. Голованова И.Л., Смирнов А.К., Шляпкин И.В. Влияние температуры на активность пищеварительных карбогидраз ротана Perccottus glenii Dyb. в зимний период // Биология внутр. вод. 2009. № 2. С. 106-108. [Golovanova I.L., Smirnov A.K., Shlyapkin I.V. The influence of temperature on the activities of digestive carbohydrases in Amur sleeper (Perccottus glenii Dyb.) during the winter // Inland Water Biology. 2009. Vol. 2. No. 2. P. 187189. DOI: 10.1134/S1995082909020126.] In Russian.
Изменения климата и их последствия. СПб.: Наука, 2002. 269 с. Izmenenija klimata i ih posledstvija. SPb.: Nauka, 2002. 269 s. [Climate change and its consequences. SPb., Science, 2002. 269 p.] In Russian.
Кляшторин Л.Б., Любушин А. А. Циклические изменения климата и рыбопродуктивности. М.: Изд-во ВНИРО, 2005. 235 с. Kljashtorin L.B., Ljubushin A.A. Tsiklicheskie izmeneniya klimata i ryboproduktivnosti. M.: Izd-vo VNIRO, 2005. 235 s. [Klyashtorin L.B., Ljubushin A.A. Cyclic changes of climate and fish productivity. M.: VNIRO Publishing, 2005. 235 p.] In Russian.
Константинов А.С. Общая гидробиология. М.: Высшая школа, 1972. 472 с. Konstantinov A.S. Obshchaya gidrobi-ologiya. M.: Vysshaja shkola, 1972. 472 s. [Konstantinov A.S. General Hydrobiology. Moscow: High School, 1972. 472 p.] In Russian.
Кузьмина В.В., Поддубная Е.А. Уровень активности пищеварительных ферментов карпа при акклимации рыб к высоким температурам // Биология внутр. вод: Информ. бюл. Л., 1986. № 71. С. 35-38. Kuz'mina V.V., Pod-dubnaya E.A. Uroven' aktivnosti pishchevaritel'nykh fermentov karpa pri akklimatsii ryb k vysokim temperaturam // Biologiya vnutr. vod. Inform. byul. L., 1986. № 71. S. 35-38. Kuz'mina V.V., Poddubnaya E.A. The level of activity of digestive enzymes in the carp under acclimation to high temperatures // Inland Water Biology. Inform. Bull. 1986. No. 71. P. 35-38.] In Russian
Попова В.В. Современные исследования климата и их региональные особенности на территории России // Антропогенные воздействия на водные ресурсы России и сопредельных государств в конце ХХ столетия. М.: Наука, 2003. С. 194-218. Popova V.V. Sovremennye issledovaniya klimata i ikh regional'nye osobennosti na territorii Rossii // Antropogennye vozdejstviya na vodnye resursy Rossii i sopredel'nykh gosudarstv v kontse XX stoletiya. M.: Nauka, 2003. S. 194-21 [Popova V.V. Modern studies of climate and its regional peculiarities in Russia // Anthropogenic impact on water resources in Russia and neighboring countries in the late twentieth century. M: Science, 2003. P. 194-218.] In Russian.
Уголев А.М., Кузьмина В.В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. Спб.: Гидрометеоиздат, 1993. 238 с. Ugolev A.M., Kuz'mina V.V. Pishchevaritel'nye protsessy i adaptatsii u ryb. Spb.: Gidrometeoizdat, 1993. 238 s. [Ugolev A.M., Kuz'mina V.V. Digestive processes and adaptations in fish. St. Petersburg: Gidrometeoizdat, 1993. 238 p.] In Russian.
Шмидт-Ниельсен К. Физиология животных. Приспособление и среда. М.: Мир, 1982. Т. I. 416 с. Shmidt-Niel'sen K. 1982. Fiziologija zhivotnyh. Prisposoblenie i sreda. M.: Mir. T. I. 416 s. [Schmidt-Nielsen K. Animal Physiology. Adaptation and Environment. Cambridge (U.K.): Cambridge University, 1979. 416 p.]
Alabaster J.S., Lloyd R. Water quality criteria for freshwater fish. L.: FAO and Butterworth Scientific., 1980. 344 p.
Beitinger T.L., Bennet W.A., McCauley R.W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature // Environ. Biol. Fish. 2000. Vol. 58. No. 3. P. 237-275.
Golovanova I.L., Golovanov V.K., Smirnov A.K., Pavlov D.D. Effect of ambient temperature increase on intestinal mucosa amylolitic activity in freshwater fish // Fish Physiol. Biochem. 2013. Vol. 39. No. 6. P. 1497-1504.
Hochachka P.W., Somero G.N. Strategies of biochemical adaptation. Philadelphia London Toronto: W.B. Saunders Company, 1973. 418 p.
Hochachka P.W., Somero G.N. Biochemical adaptation. Mechanism and process in physiological evolution // Oxford-New York: Oxford University Press, 2002. 466 p.
Hofer R. The adaptation of digestive enzymes to temperature, season and diet in roach, Rutilus rutilus L. and rudd, Scardinius erythrophthalmus L. I. Amylase // J. Fish. Biol. 1979. Vol. 14. No. 6. P. 565-572.
DIGESTIVE GLYCOSIDASE OF FISH UNDER INCREASING WATER TEMPERATURE
(REVIEW)
I. L. Golovanova, V. K. Golovanov
I. D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters Russian Academy of Sciences, 152742 Borok, Yaroslavl, Nekouz, Russia, e-mail: golovanova5353@mail.ru
The effects of the increase of the ambient temperature on the characteristics of glycosidase (enzymes hydro-lyzing of carbohydrates) in fish of different ecological groups were studied. The effects of increase in water heating rate on the activity and temperature characteristics of the digestive glycosidases, as well as their sensitivity to heavy metals is revealed. At the lower water heating rate 0.04°C/h fishes during 2-4 weeks are acclimated to gradually raising the temperature and the activity of glycosidase (amylolytic activity, a-amylase) increased in all seasons of the year. Higher heating rates of 4-50°C/h increase of the activity of glycosidase in summer and reduce its 2-7.5 times in other seasons. Rapid increase of ambient temperature in the autumn-winter period, unnatural for seasonal dynamics, does not allow fishes to adapt to rapidly changing of conditions and reduces the effectiveness of the initial stages of assimilation of food. Despite the increase in activity of glycosidase at the all rates of heating water during the summer decrease in thermal stability of enzymes and their resistance to heavy metals can negatively affect the digestive intensity under thermal pollution. Since the temperature and nutritional conditions largely determine the efficiency of fish feeding, the change in digestive function with a gradual or rapid change of ambient temperature possible to predict the effects of global warming, the thermal pollution of water environment, isolation of shallow ponds and fish work related with changes of water temperature.
Key words: fishes, digestion, glycosidase, increasing ambient temperature.
