CC BY
18
УДК 632.2.082.591.15.16
Шаран М. М., доктор сшьськогосподарських наук, шш sharan@yahoo.com Яремчук I. М., кандидат сшьськогосподарських наук 1нститут бюлогп тварин НААН Украгни, м. Львгв Шаловило С. Г., доктор сшьськогосподарських наук, професор, Гримак Х. М. © Льв1вський нацюнальний утверситет ветеринарног медицини та бютехнологт
¡мет С. З. Гжицького
П1ДВИЩЕННЯ ЖИТТОДАТНОСП ЕМБР1ОН1В КОР1В ПРИ НАДШВИДКОМУ ЗАМОРОЖУВАНН1
Наведено данг про крюзахисш властивост1 ¡нсолвту, фосфолШдного препарату «Фтомек», л1нолевог кислоти, холестеролу лтолеату, олеату I стеарату при додаванш гх у середовища для надшвидкого заморожування ембрюшв коргв. Встановлено, що введення вказаних мембраностабшзуючих речовин у середовище для заморожування ембрюшв методом втрифтацп в оптимальних концентращях знижуе ктьтсть морфолог\чно пошкоджених клтин тсля деконсервування, що тдтверджуеться високим показником збереження деконсервованих ембрюшв (понад 80,0 %), а також тдвищуе гх приживлюватсть на 7,2-17,0 %.
Ключовi слова: крюконсервування, ембрюн, лтолеат, олеат, стеарат холестеролу, «Фтомек», надшвидке заморожування, втрифшацшне середовище
Вступ. Новим i перспектившшим методом крюконсервування ембрюшв е 1х надшвидке заморожування у рщкому азот в середовищах з високими концентращями проникаючих крiпротекторiв. При цьому через сильне пщвищення в'язкост розчишв цитоплазма ембрюшв разом з висококонцетрованими розчинами переходить у твердий склоподiбний стан без кристашзацл, тобто вони в^рифжуються [1, 2]. Головним мюцем крюпошкоджень е цитоплазматична мембрана та специфiчнi лшщи в нш. Лшщи при низьких температурах проходять стади вщ рiдкокристалiчноl до фази гелю, в результат чого може порушуватися цшсшсть мембран i настае загибель кл^ин, якщо проходять незворотш процеси. Даний феномен пояснюеться композищею мембран. Мембрани з високим стввщношенням холестерол: фосфолiпiд менш чутливi до ди субфiзiологiчних температур. Цi бiофiзичнi i бiохiмiчнi параметри можуть пояснити вщмшност результатiв крiоконсервування ембрiонiв як i розбiжностi, викликанi сезоном i живленням [3-5]. Тому важливим фактором пщвищення ефективност крiоконсервування ембрiонiв е змша спiввiдношення холестерол: фосфолiпiд в сторону останнього.
Оскшьки лiнолева кислота як ненасичена жирна кислота е структурним компонентом фосфолшвдв мембран, ми виршили застосувати 11 для змши пластичностi мембран ембрiонiв. Крiм того, доведено, що лшолева кислота
© Шаран М. М., Яремчук I. М., Шаловило С. Г., Гримак Х. М., 2011
496
змщнюе кл^инш мембрани i onrnoBÍ оболонки [6]. Заморожування статевих кл^ин викликае втрату мембранами холестеролу [7], що спонукало до використання рiзних форм холестеролу для стабЫзацп спiввiдношення холестерол: фосфолiпiди у мембранах ембрюшв.
Антиоксидантна система ембрюшв включае рiзнi природнi антиоксиданти (в^амши А, Е, аскорбiнова кислота, убiхiнони, каротино!ди) та антиоксидантнi ферменти [8, 9]. Вважають, що головним жиророзчинним антиоксидантом е в^амш Е, який здатний в низьких концентрацiях ефективно виконувати захиснi функцп [9, 10]. Разом з в^амшом А вш виконуе функцiю стабiлiзатора клiтинних мембран, захищаючи !х вiд окиснення [11]. Також встановлено, що фракщя поверхнево-активних фосфолшвдв виявляе антиоксидантну та мембраностабшзуючу дiю [12].
Метою дано! роботи було дослщження ефективностi ди лшолево! кислоти, рiзних форм холестеролу, вододисперсно! форми вiтамiнiв А, D, Е та фосфолшщного препарату «Фшомек» при додаванш !х до середовищ для надшвидкого заморожування ембрiонiв корiв.
Матер1ал i методи. Дослiдження проводили у ТзОВ «Городище» Луцького району Волинсько! область Ембрюни одержували вiд корiв украшсько! чорно-рябо! молочно! породи вжом 4-7 рокiв. Вiдбiр i пщготовку корiв-донорiв проводили за загальноприйнятими методами, полювуляцш iндукували використанням фолiкулостимулюючого гормону «Фолжотротн» (Чехiя) за 4-денною схемою [13]. Яюсть ембрiонiв 7-8-денного в^ визначали за морфологiчними ознаками з врахуванням стади !х розвитку [14].
При заморожуванш ембрiонiв надшвидким методом використовували еквiлiбрацiйне i вiтрифiкацiйне середовища. Ембрiони пiсля промивання в культуральному середовищi вiд механiчного забруднення помщали в еквiлiбрацiйне середовище, яке складалося з 10 % глiцерину (1,4 М; експозищя 7-10 хв). Надалi ембрiони переносили у вiтрифiкацiйне середовище, яке мютило 30 % глщерину i 50 % сахарози на 60 секунд. Поим ембрюни тонкою пшеткою переносили у попередньо заповнену в^рифшацшним середовищем запаяну пайету. Першу половину пайети (з ембрюнами) занурювали у рiдкий азот швидко, а другу повшьно для запобiгання розриву пайети.
Далi провели чотири сери експерименив, у яких вивчали вплив шсолв^, лшолево! кислоти, сполук холестеролу та препарату «Фшомек» на стабЫзацш мембран ембрiонiв. У 1 серп експерименив при заморожуваннi ембрiонiв дослщних груп до вiтрифiкацiйного середовища додавали лшолеву кислоту (Linoleic acid 27908, Serva). У 2 сери експерименив при заморожуванш ембрюшв дослщних груп до в^ифшацшного середовища додавали рiзнi форми холестеролу (Cholesteryl linoleat 17112 , Cholesteryl oleat 17121, Cholesterol stearat 17124, Serva). У 3 сери дослвдв при заморожуванш ембрюшв дослщних груп до в^рифшацшного середовища додавали препарат «1нсолвт> виробництва Кшвського в^амшного заводу, у склад якого входили в^амши: А — 80000 МО, D — 13000 МО, Е — 14 мг. У 4 сери експерименив при заморожуванш ембрюшв дослщних груп до в^рифжацшного середовища
додавали pi3Hi концентраци "Фшомеку" (0,1 %; 0,2 %; 0,3 %). "Фшомек" е природною субстанщею i3 тканин морських opraHi3MiB на 0CH0Bi фосфолiпiдного комплексу, головним компонентом препарату е фосфатидилхолш (70 % лецитину).
Контролем слугували нативш ембрiони, якi зразу пiсля вимивання культивували 24-48 годин при темперaтурi 38°С. Життездатними вважали ембрiони, яю розвинулись в культурi до стадп тзньо! бластоцисти.
При зaморожувaннi ембрiонiв велико! рогато! худоби дослiдних груп до вiтрифiкaцiйного середовища додавали шсолвщ «Фшомек», лiнолеву кислоту, холестеролу олеат, лшолеат i стеарат у концентращях, якi проявили високий вiдсоток збереження ембрюшв мишей (0,1, 0,2 i 0,3 %) у наших попередшх дослiдженнях. Контрольну групу ембрiонiв велико! рогато! худоби заморожували методом в^рифшаци без додавання вказаних речовин.
Розморожування ембрiонiв мишей проводили на повiтрi при темперaтурi 18-22°С i розмщали в 0,5 М розчин сахарози на 10 хвилин. Шсля 24-48-годинного культивування ембрiони, якi досягли стади пiзньо! бластоцисти, вважали життездатними.
Виведення крiопротекторiв з деконсервованих ембрюшв велико! рогато! худоби проводили в двох розчинах по 5 хвилин. Перший розчин мштив 5 % глщерину i 0,5 М сахарозу. Для його виготовлення брали: води бщистильовано! — 2 мл, маточного розчину — 7 мл, глщерину — 1 мл, середовища МЕМ — 10 мл. Друге середовище складалося з 0,25 М сахарози i мктило: води бщистильовано! — 1,5 мл, маточний розчин — 3,5 мл, середовище МЕМ — 15 мл.
До вищенаведених розчишв у дослщних групах додавали дослщжуваш речовини у концентращях, яю проявили високу ефективнiсть. Нaдaлi ембрюни багаторазово промивали в культуральному середовищ^ яке складалося з ФБС Дюльбекко та 0,4 % БСА i заправляли в пайети для трансплантаци.
Життездaтнiсть деконсервованих ембрiонiв велико! рогато! худоби визначали за результатами !х приживлення ректальним дослiдженням реципiентiв через 2 мюящ пiсля трaнсплaнтaцi!.
Результати дослщження. При вивченнi крiозaхисних властивостей iнсолвiту на ембрiонaх велико! рогато! худоби встановлено пщвищення вiдсоткa збереження деконсервованих ембрюшв у вЫх дослщних групах, а, особливо, в 3 дослщнш груш з концентращею шсолв^ 0,4 мл, де вiн становив 88,9 %, що майже на 10,0 % вище вiд контролю (рис. 1).
З отриманих даних можна зробити припущення, що шсолв^ при додаванш його у середовища для заморожування ембрiонiв корiв методом в^рифшаци, починаючи з концентрaцi! 0,2 мл, значно «пом'якшуе» вплив надшвидкого охолодження на ембрiони, про що свщчить високий показник збереження деконсервованих ембрюшв, який був на рiвнi 80 вщсотюв. Це можна пояснити захисною дiею вiтaмiну Е у вщношенш до полiненaсичених жирних кислот фосфолшвдв клiтинних мембран. Крiм цього, вш взaемодiе також з штегральними бiлкaми лiпопроте!нових комплексiв. Отже, в^амш Е,
взаемодшчи з лшщами i бшками в кл^инних мембранах, стабшзуе та забезпечуе 1х нормальне функцiонування [11].
iнсолвiт лiнолева холестерол холестерол холестерол Фтомек кислота лЫолеат олеат стеарат
□ контроль □ 1 дослiдна □ 2 дослщна □ 3 дослiдна Рис. 1. Життездатшсть деконсервованих ембр1он1в велико? рогато'1 худоби
Введення лшолево! кислоти у в^ифжацшне середовище пiдвищило збереженiсть деконсервованих ембрюшв у всiх дослiдних групах, а, особливо, у 2 i 3 дослiдних групах з концентращею лшолево! кислоти 0,2 % i 0,3 %, де вона становила вщповщно 83,3 % i 80,0 %, що на 13,3 % i 10,0 % бiльше вщ контролю.
Пiдвищення збереженостi ембрiонiв очевидно пов'язано iз тим, що лiнолева кислота, як одна з ненасичених жирних кислот, е структурним елементом фосфолшвдв мембран i додавання 11 до в^рифжацшного середовища дозволяе змiнити стввщношення фосфолiпiди:холестерол в сторону перших. А це у свою чергу призводить до змши композици мембран (вони стають еластичнiшими), що дозволяе 1м лабiльнiше реагувати на дiю низьких температур. На думку ряду дослщниюв стввщношення фосфолшщи:холестерол визначае текучiсть, проникшсть i термотропну поведiнку мембран. Оскшьки швидке охолодження мiнiмiзуе час дп критичних температур на клiтину, необх1дно змiнити композицiю мембран i оптимiзувати крiоконсервування [4, 5].
Найвищi показники збереження деконсервованих ембрiонiв корiв отримали при застосуваннi холестеролу лiнолеату 1,0 мг/мл — 90,0 %. Дещо нижчий вщсоток збереження розморожених ембрюшв (83,3 %) одержали при використанш 1,5 мг/мл холестеролу олеату. При застосуванш стеарату холестеролу збереженiсть вщталих ембрiонiв майже не вiдрiзнялася вщ контролю.
Отже, додавання лiнолеату i олеату холестеролу в оптимальних дозах у в^рифжацшне середовище пiдвищуе збереженiсть деконсервованих ембрюшв на 13,3-18,2 %. Очевидно, це пов'язано iз тим, що додаткове введення
499
холестеролу зменшуе його втрати мембранами ембрюшв протягом крюконсервування, i тим самим знижуе крюпошкодження та пiдвищуе виживанiсть ембрiонiв шсля розморожування. Аналогiчнi данi отриманi вченими при крюконсервуванш сперми [7].
Найвищий вiдсоток виживання ембрiонiв (91,6 %) був у другш дослiднiй груш, де у середовище для культивування було введено 0,2 % препарату "Фшомек".
Вища якiсть деконсервованих ембрюшв, обумовлена використанням мембрано стабiлiзуючих речовин у складi середовищ для в^ифшацл та розморожування, забезпечила пiдвищення результативност трансплантацп ембрiонiв. Результати нехiрурriчно! пересадки ембрюшв свщчать про досить високий рiвень приживлення деконсервованих ембрiонiв. Так, при застосуванш iнсолвiту у вЫх дослiдних групах вiн був на рiвнi 50 %, а в 2-й груш становив 54,5 %, що на 17 вщсотюв вище вiд контролю (рис. 2).
60 50 40 30 20 10 0
зШ
iнсолвiт лiнолева холестерол холестерол холестерол Фтомек кислота лiнолеат олеат стеарат
□ контроль □ 1 дослщна □ 2 дослiдна □ 3 дослiдна
Рис.2. Приживлюванiсть деконсервованих ембрюшв велико? рогато?' худоби
Використання лшолево! кислоти у складi середовищ для в^рифшаци та розморожування забезпечило пiдвищення приживлюваностi ембрiонiв у 2 i 3 дослiдних групах на 7,2 % порiвняно з контрольними рецитентами.
При застосуваннi лiнолеату холестеролу в дозi 1,0 мг/мл приживлювашсть трансплантованих ембрiонiв становила 55,5 %, що на 12,7 % бшьше порiвняно з контрольними реципiентами. Аналопчно використання холестеролу олеату в дозi 1,5 мг/мл пiдвищило приживлюванiсть ембрюшв у телиць-рецишенив на 7,2 %. В той же час застосування оптимально! концентраци холестеролу стеарату (0,5 мг/мл) дещо знизило рiвень приживлення ембрюшв — на 5,3 %.
Короткотривале культивування деконсервованих ембрюшв, заморожених надшвидким методом, у середовищi з фосфолшщним комплексом
сприяло вщновленню фiзiологiчних властивостей ембрюшв та пщвищило !х приживлення пiсля трансплантацп на 13,6 %.
Пщсумовуючи вищенаведенi данi, можна зробити висновок, що введення вказаних мембраностабшзуючих речовин у середовище для заморожування ембрiонiв методом в^рифжацп в оптимальних концентрацiях знижуе кiлькiсть морфолопчно пошкоджених клiтин пiсля деконсервування, що пщтверджуеться високим показником збереження деконсервованих ембрюшв (понад 80,0 %), а також пщвищуе !х приживлюванiсть на 7,2-17,0 %.
Висновки.
1. Введення мембраностабiлiзуючих речовин (iнсолвiт, препарат «Фшомек», лiнолева кислота, лiнолеат та олеат холестеролу) у вiтрифiкацiйнi середовища для заморожування ембрюшв велико! рогато! худоби надшвидким методом значно знизило кшьюсть морфологiчно пошкоджених клiтин пiсля !х деконсервування, що зумовило краще !х збереження (до 90 %) за дп низьких температур.
2. Застосування шсолв^, препарату «Фiломек»лiнолево! кислоти, лiнолеату та олеату холестеролу в оптимальних дозах у складi вiтрифiкацiйного середовища пщвищуе приживлювашсть трансплантованих ембрiонiв велико! рогато! худоби на 7,2-17,0 %.
3. Використання стеарату холестеролу у складi в^рифжацшного середовища не покращуе життездатшсть i приживлюванiсть деконсервованих ембрiонiв, а тому недоцшьне для практики.
Л1тература
1.Кривохарченко А. С. Сверхбыстрое замораживание мышиных эмбрионов, хранившихся при 4°С в течении суток /Кривохарченко А. С., Вильянович А. И., Рябых В. П./ Онтогенез. — 1992. — Т. 23. — № 2. — С. 146149.
2.Грищенко В. И. Сверхбыстрые скорости охлаждения и витрифицирующие растворы в криобиологии /Грищенко В. И., Калугин Ю. В./ Проблемы криобиологии. —1993. —№ 3. — С. 3-13.
3.Zeron Y. Seasonal changes in bovine fertility: relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles /Zeron Y., Ocheretny A., Kedar O., Borochov A., Sklan D., Arav A./ Reproduction — 2001. — V. 121 — P. 447-454.
4.Arav A. Does lipid profile explain chilling sensitivity and membrane lipid phase transition of spermatozoa and oocytes? /Arav A., Pearl M., Zeron Y./ Cryoletters — 2000. — V. 21 —P. 179-186.
5.Zeron Y. Effect of polyunsaturated fatty acid supplementation on biophysical parameters and chilling sensitivity of ewe oocytes /Zeron Y., Sklan D., Arav A./ Mol. Reprod. Dev. — 2002. — V. 61 — P. 271-278.
6. Казимирко В. К. Функция ненасыщенных жирных кислот в организме /Казимирко В. К., Мальцев В. И./ Новости медицины — 2004. — № 95 — С. 3539.
7.Cormier N. A differential mechanism is involved during heparin- and cry opreservati on-induced capacitation. /Cormier N., Bailey J. l./ Biol. Reprod. 69 (2003) 177-185.
8.Кривохарченко А.С. Влияние способа оттаивания эмбрионов мышей, замороженных сверхбыстрым методом или на программном замораживателе, на их жизнеспособность /Кривохарченко А.С., Бахитов К.И., Рябых В.П./ Онтогенез.—1992 а.— т. 23.—№ 1.—С. 67-70.
9.Armbryst T.A. Effect of cryoprotectant and genetic selection for body fat content on embryonic cryosurvival in mice /Armbryst T.A., Eisen E.J./ Treor. Ahhl. Cenet.—1994.—Vol. 88.—№ 3-4. —P. 479-485.
10. Agca Y. Effects of developmental stage on bovine oocyte plasma membrane water and cryoprotectant permeability characteristics /Agca Y., Lin J., Peter A.T., Crister E.S., Crister J.K./ Molecular Reproduction and Development.— 1998. —Vol. 49 (4). — P. 408-415.
11. Янович В.Г. Жиророзчинш в^амши у ветеринарнш медициш i твариннищта /Янович В.Г., Куртяк Б.М./ - Львiв. - 2004. - 425 с.
12. Wolfe J, Bryant G. Freezing, drying, and/or vitrification of membranesolute-water systems // Cryobiology. - 1999;39. - Р. 103-29.
13. Довщник з репродуктивно! бютехнологп велико! рогато! худоби довщник /За редакщею Шаловила С. Г. — Львiв. — 2004. — 150 с.
14. Кауффольд П. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого скота /Кауффольд П., Тамм И., Шихов И. Я. и др./ М.: Агропромиздат. — 1990 — 56 с.
Summary
M. Sharan, I. Yaremchuk, S. Shalowylo, H. Grymak INCREASE THE VIABILITY EMBRYOS IN COWS AT THE SUPERFAST
TO FREEZING
Data are resulted about crioprotective properties of insolvit, phospholipids preparation "Filomek" linoleic acids, holesterol of linoleat, oleat and stearat at addition of her on medium for the ultrafreezing of embryos of mice and cows. It is set, that introduction of the indicated membrano stabilizing matters to the environment for freezing of embryos by the method of vitrification in optimum concentrations lowers the quantity of the morphologically damaged cells after deconservation, that is confirmed by the high index of saving of deconservation embryos (over 80,0 %), and also promoted them implantation on 7,2-17,0 %.
Стаття надшшла до редакцИ 12.04.2011
