Pf-114, новый ингибитор тирозинкиназы Bcr-Abl, снижает фосфорилирование CrkL и вызывает гибель клеток хронического миелоидного лейкоза Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Клин. онкогематол. 2016; 9(1): 1-5

ОН!

ГЕМАТОЛОГИЯ

Klin. Onkogematol. 2016; 9(1): 1-5

HEMATOLOGY

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

EXPERIMENTAL RESEARCH

PF-114, новый ингибитор тирозинкиназы Bcr-Abl, снижает фосфорилирование CrkL и вызывает гибель клеток хронического миелоидного лейкоза

ЕС. Колотова1, ВВ. Татарский1, АА. Зейфман23, О.В. Строганов23, В.С. Стройлов23, И.Ю. Титов23, ФН. Новиков23, АА. Калинина1, ГГ. Чилов23, АА. Штиль1

1 ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Бло-хина» Минздрава России, Каширское ш., д. 24, Москва, Российская Федерация, 115478

2 ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Ленинский пр-т, д. 47, Москва, Российская Федерация, 119991

3 ООО «Фьюжн Фарма», ул. Генерала Дорохова, д. 18, стр. 2, Москва, Российская Федерация, 119530

РЕФЕРАТ

PF-114, a Novel Inhibitor of Bcr-Abl Chimeric Tyrosine Kinase, Attenuates Intracellular CrkL Phosphorylation and Kills Chronic Myeloid Leukemia Cells

ES. Kolotova1, V.V. Tatarskii1, AA. Zeifman23,

O.V. Stroganov23, V.S. Stroilov23,1.Yu. Titov23, F.N. Novikov23,

AA. Kalinina1, G.G. Chilov23, AA. Shtil'1

1 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, 24 Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478

2 N.D. Zelinskii Institute of Organic Chemistry, 47 Leninskii pr-t, Moscow, Russian Federation, 119991

3 Fusion Pharma, 18 bld. 2 Generala Dorokhova str., Moscow, Russian Federation, 119530

ABSTRACT

Актуальность и цели. Химерная тирозинкиназа Bcr-Abl вызывает злокачественную трансформацию миелоидных клеток посредством фосфорилирования ряда субстратов, важнейшим из которых является адаптерный белок Фармакологическое ингибирование Bcr-Abl-зависимого сигналинга (передача сигнала) — основной современный подход в лечении больных хроническим миелоидным лейкозом. В результате молекулярного моделирования создан новый селективный ингибитор Bcr-Abl (PF-114). В работе определена цитотоксичность PF-114 для клеток хронического миелоидного лейкоза и изучено его влияние на фосфорилирование

Методы. Цитотоксичность определяли с помощью МТТ-теста. Суммарный внутриклеточный пул ^^ (фосфори-лированная и нефосфорилированная формы) определяли методом проточной цитофлюориметрии. Результаты. Инкубация Bcr-Abl-положительных клеток (линия Ю62) с PF-114 приводила к отмене фосфорилирования ^^ и гибели клеток. Фосфорилирование ^^ в Bcr-Abl-негативных линиях лейкозных клеток (HL60, U937 и Jurkat) не выявлено.

Заключение. Отсутствие фосфорилирования ^^ в Bcr-Abl-негативных линиях (HL60, U937 и Jurkat) и гибель клеток HL60 при действии концентраций PF-114, значительно превышающих требуемые для гибели линии Ю62, подтверждают перспективность создания лекарственного препарата для терапии хронического миелоидного лейкоза на основе PF-114.

Background & Aims. The chimeric tyrosine kinase Bcr-Abl triggers malignant transformation of myeloid cells via phosphorylation of a number of substrates including the CrkL adaptor protein. Pharmacological inhibition of Bcr-Abl mediated signaling is a major strategy in treatment of patients with chronic myeloid leukemia (CML). A new specific Bcr-Abl inhibitor (PF-114) was designed using a molecular modeling approach. The paper defines the cytotoxicity of PF-114 against CML cells and its effect on the CrkL phos-phorylation.

Methods. The cytotoxicity was determined using the MTT assay. The total intracellular CrKL pool (phosphorylated and non-phosphorylated forms) was determined by means of flow cytometry.

Results. Exposure of Bcr-Abl-positive, K562 cell line to PF-114 blocked intracellular CrkL phosphorylation and caused cell death. In contrast, virtually no phosphorylated CrkL was detectable in Bcr-Abl-negative HL60, U937 and Jurkat leukemia cell lines.

Conclusion. Absence of CrkL phosphorylation in Bcr-Abl-negative cells (HL60, U937 and Jurkat) and death of HL60 cells under the effect of PF-114 at concentrations exceeding those required to kill K562 cells supports the emergence of PF-114 as a promising drug candidate for CML.

I Ключевые слова: хронический миелоидный лейкоз, тирозинкиназа Bcr-Abl, фосфорилирование белков, проточная цитофлюориметрия, цитотоксичность.

I Keywords: chronic myeloid leukemia, Bcr-Abl tyrosine kinase, protein phosphorylation, flow cytometry, cyto-toxicity.

© 2016 практическая медицина

1

Получено: 15 сентября 2015 г. Принято в печать: 8 октября 2015 г.

Received: September 15, 2015 Accepted: October 8, 2015

Для переписки: Александр Альбертович Штиль, д-р мед. наук, Каширское ш., д. 24, Москва, Российская Федерация, 115478; тел.: + 7(499)612-78-34; e-mail: shtilaa@yahoo.com Для цитирования: Колотова Е.С., Татарский В.В., Зейфман А.А., Строганов О.В., Стройлов В.С., Титов И.Ю., Новиков Ф.Н., Калинина А.А., Чилов Г.Г., Штиль А.А. PF-114, новый ингибитор тирозинкиназы Bcr-Abl, снижает фосфорилирование CrkL и вызывает гибель клеток хронического миелоидного лейкоза. Клин. онкогематол. 2016; 9(1): 1-5.

For correspondence: Aleksandr Al'bertovich Shtil', DSci,

24 Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478;

Tel.: + 7(499)612-78-34; e-mail: shtilaa@yahoo.com

For citation: Kolotova E.S., Tatarskii V.V., Zeifman A.A., Stroganov O.V.,

Stroilov V.S., Titov I.Yu., Novikov F.N., Kalinina A.A., Chilov G.G.,

Shtil' A.A. PF-114, a Novel Inhibitor of Bcr-Abl Chimeric Tyrosine

Kinase, Attenuates Intracellular CrkL Phosphorylation and Kills Chronic

Myeloid Leukemia Cells. Klin. Onkogematol. 2016; 9(1): 1-5

(In Russ.).

ВВЕДЕНИЕ

Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) — клональное миелопролиферативное заболевание, характеризующееся наличием Ph-хромосомы, несущей химерный ген Bcr-Abl. Этот ген образуется в результате транслокации (9;22)(q34;q11) в стволовых кроветворных клетках [1]. В нормальных клетках тирозинкиназа Abl (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1) участвует в регуляции пролиферации, выживания, адгезии, миграции клеток, а также опосредует ответ на генотоксический стресс [2, 3]. Функции белка Bcr (Breakpoint cluster region) в нормальных клетках не вполне ясны. В структуре Bcr выявлены фрагменты, важные для патогенеза ХМЛ [4]. В химерном белке Abl постоянно аутофосфорилирована, что приводит к активации сигнальных каскадов через адаптерные белки Grb2 и CrkL [5] (рис. 1). Фосфорилирование CrkL (Crk-like) по остатку тирозина в положении 207 обнаружено при ХМЛ и не выявлено в нормальных нейтрофилах [6]. Это событие — раннее и важное звено в передаче сигналов в клетках с Bcr-Abl. Фосфорилирование CrkL активирует нижележащие сигнальные молекулы, что вызывает передачу пролиферативных сигналов (см. рис. 1). Активация этих каскадов, а также ограничение апоптотического сигналинга (передача сигнала) позволяют Bcr-Abl-позитивным клеткам выживать и пролифериро-вать независимо от регуляции факторами роста.

Фармакологическое ингибирование Bcr-Abl — основной современный подход в лечении больных ХМЛ, а снижение доли фосфорилированного CrkL в клетках

может служить маркером ответа на действие ингибиторов Bcr-Abl [8]. Ингибитор Bcr-Abl первого поколения, иматиниб, эффективен при отсутствии мутаций в Всг-АЬ1 [9]. Появление вторичных мутаций в киназном домене АЬ1 приводит к резистентности к иматинибу, что требует использования препаратов второго поколения: дазатиниба, нилотиниба или босутиниба [10]. Тем не менее мутации в АЬ1, в частности самая распространенная T315I, обусловливают устойчивость опухолевых клеток и к препаратам второго поколения. Единственный одобренный в настоящее время препарат, эффективный при ХМЛ с мутацией T315I, — понатиниб, ингибитор Bcr-Abl третьего поколения [11]. Однако вследствие недостаточно высокой селективности понатиниба профиль его безопасности неоптимален. Недавно разработанный нами ингибитор Bcr-Abl третьего поколения PF-114 (рис. 2) в доклинических исследованиях показал эффективность при ХМЛ с мутацией T315I и существенно более селективное ингибирование протеинкиназ, а также безопасность [12].

В настоящей работе исследованы важные свойства PF-114 как прототипа лекарственного препарата: ци-тотоксичность для Bcr-Abl-позитивных и -негативных клеток, а также ингибирование киназной активности Bcr-Abl в линии клеток ХМЛ по снижению фосфорили-рования белка

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

PF-114 растворяли в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 10 ммоль/л и хранили при температуре

BCR

RAS-GDP -"RAS-GTP

I

MAPK

I

ERK1/2

I

C-Myc

\ /

PI3K

I

Akt

/ V

mTOR FOXO \ /

Киназный домен Abl

STAT5

Пролиферация Ограничение апоптоза Регуляция транскрипции

Рис. 1. Пути передачи сигналов в Bcr-Abl-позитивных клетках (цит. по [7])

Fig. 1. Signal transmission pathways in Bcr-Abl-positive cells (cited according to [7])

H3C

Рис. 2. Структура PF-114

Fig. 2. Structure of PF-114

F

— 20 °С. В день эксперимента готовили водные растворы для внесения в культуру клеток. Реагенты приобретены в компании Sigma (США), кроме особо оговоренных случаев. Цитотоксичность PF-114 определяли в МТТ-тесте. Клетки линий K562 (ХМЛ) и HL60 (острый промиелоци-тарный лейкоз) вносили в 96-луночные планшеты (Costar, США) в концентрации 5 х 103 в 190 мкл культуральной среды RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Австрия), 2 ммоль/л L-глутамина и 5% раствора пенициллин-стрептомицина («ПанЭко», Россия). В лунки вносили PF-114 до конечных концентраций 0,01 — 12,5 нмоль/л. Каждую концентрацию тестировали трижды. Клетки инкубировали при 37 °С и 5% СО2 в течение 72 ч. По окончании инкубации в лунки вносили 20 мкл водного раствора бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) и инкубировали 2 ч. О жизнеспособности клеток судили по цветной реакции, развивающейся при восстановлении МТТ в формазан. Окраску регистрировали на спектрофотометре (Bio-Rad Benchmark Plus, США) при длине волны возбуждения 570 нм. При вычислении процента выживших клеток при той или иной концентрации PF-114 оптическую плотность в лунках, где клетки инкубированы в отсутствие PF-114, принимали за 100 %.

Суммарный внутриклеточный пул CrkL (фосфорили-рованная и нефосфорилированная формы) определяли методом проточной цитофлюориметрии [13]. Клетки линии K562 инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 °С в отсутствие (контроль) или в присутствии PF-114 (концентрации указаны на рис. 3), фиксировали 2% параформаль-дегидом (10 мин, 37 °С), дважды отмывали однократным фосфатно-солевым буфером и помещали на лед. Клетки пермеабилизировали (делали проницаемыми) 30 мин метанолом, отмывали в том же буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и ресуспендиро-вали в 100 мкл 10% сыворотки крови человека (30 мин,

Концентрация PF-114 (нмоль/л), lg

Рис. 3. Выживаемость клеток линий К562 (хронический миелолей-коз) и -^60 (острый промиелоцитарный лейкоз) при действии PF-114. Каждое значение на графиках — среднее 3-х независимых измерений с погрешностью < 10 %

МТТ — бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетра-золий.

Fig. 3. Survival of K562 cell lines (chronic myeloid leukemia) and HL60 (acute promyelocytic leukemia) under exposure to lg nmol PF-114. Each value in the plots represents a mean of three independent measurements with < 10 % error

MTT — 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide.

4 °С) для предотвращения неспецифического связывания антител с клетками. Затем клетки центрифугировали (5 мин, 5000 об./мин), к осадку добавляли кроличьи антитела к нефосфорилированному CrkL (SantaCruz, США; 1:50) и мышиные антитела к фосфорилированному CrkL, конъюгированные с фикоэритрином (ФЭ) (BD Biosciences, США; 1:5). Клетки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и отмывали от несвя-завшихся антител. К осадку добавляли вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные AlexaFluor488 (Invitrogen, США; 1:1000) в буфере c 1% БСА, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, отмывали и анализировали в проточном цитофлюориметре FACSCanto II (Becton Dickinson, США). Все процедуры с антителами (инкубации, отмывка) проводили в буфере c 1% БСА. Для каждого образца накапливали 20 000 флюоресцентных «событий». Указанные условия экспериментов соответствовали рекомендациям производителей антител и оптимизированы нами. По этой же методике определяли общий и фосфорилированный &kL в линиях Bcr-Abl-негативных лейкозов: HL60, U937 (монобластный) и Jurkat (Т-лимфобластный). Обработка результатов осуществлялась в программе FacsDiva (BD, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Соединение PF-114 высокоактивно в отношении Bcr-Abl-позитивных клеток. Гибель клеток линии K562 отмечена при действии наномолярных или даже субнаномолярных концентраций PF-114. Диапазон концентраций, вызывающих гибель 50 % клеток (IC50), составил 0,4—6 нмоль/л (по результатам 5 экспериментов). Изучение зависимости гибели клеток от времени инкубации с PF-114 показало, что цитотоксический эффект развивается относительно медленно. На рис. 3 представлены результаты типичного эксперимента, показывающие, что и через 72 ч инкубации сохраняется около 30 % жизнеспособных (метаболизи-рующих МТТ) клеток. Гибель всей клеточной популяции наступает через 4—5 дней; этому предшествует задержка клеточного цикла.

Клетки Bcr-Abl-негативного лейкоза (линия HL60) выживали при действии значительно более высоких концентраций PF-114 (см. рис. 3), что свидетельствует о высокой специфичности соединения к основной внутриклеточной мишени — тирозинкиназе Bcr-Abl.

Для ответа на вопрос о связи цитотоксичности PF-114 с его способностью ингибировать фосфорилирование CrkL клетки линии K562 инкубировали с PF-114 в течение 2 ч и исследовали долю клеток, несущих фосфо-CrkL, по отношению к общему пулу белка. Результаты проточной цитофлюориметрии показали, что относительное содержание клеток с фосфо-CrkL снижалось с увеличением концентрации соединения. В необработанных клетках выявлено 92 % фосфо-^^-позитивных клеток (рис. 4, А, правый верхний квадрант). При действии 10 нмоль/л PF-114 количество таких клеток почти не изменилось. Существенное снижение отмечено только при более высоких концентрациях PF-114: 30 нмоль/л — до 32 %, 100 нмоль/л — до 4 %. В линиях HL60, U937 и Jurkat фосфо-CrkL-позитивные клетки не выявлены, т. е. в Bcr-Abl-негативных линиях белок CrkL нефосфори-лирован. Таким образом, для определения активности новых ингибиторов химерной тирозинкиназы указанная

А

я &

Б

105

104'

103'

102,

4 oj 92 % f

Q3 Q4

10s-;

104-

103"

102"

1 91 % (Г

Q3 Q4

102

ii 32 % f q2

] Q3 Q4

104 ■

103-

102

m 4 % > Q2

1 Q3 1 IIH'H-Г-Г Q4 Тгтпт—г i | ii ни—liii »Iii—r*

102 103 1 04 105 0

102 1 03 1 04 105 10

102 1 03 1 04 105 30

102 1 03 1 04 105

100 нмоль/л

100

80

60

40

20

0

100

Концентрация PF-114, нмоль/л

Флюоресценция ФЭ

Рис. 4. Снижение фосфорилирования CrkL при увеличении концентрации PF-114. (Л) Гистограммы распределения флюоресцентных «событий» (типичный эксперимент). (Б) Доля CrkL-позитивных клеток (данные 3 экспериментов; средние величины ± средние квадратичные отклонения). Фикоэритрин (ФЭ) и AlexaFluor488 — флюоресцентные красители. Их химически конъюгируют к первичным или вторичным антителам для многоцветной детекции белков в проточной цитофлюориметрии либо иммуноцито(гисто)химии. Концентрация PF-114 в нмоль/л (0, 10, 30, 100) указана не на оси Х, а под отдельными квадратами. На осях Х и Y — флюоресценция клеток в детекторах прибора, определяющих свечение ФЭ (ось Х) или AlexaFluor488 (ось Y). Единицы измерения для ФЭ и AlexaFluor488 — так называемые каналы флюоресценции, т. е. условные величины яркости (или интенсивности флюоресценции). Эти величины отражают количество клеток, присоединивших то или иное антитело с флюоресцентным красителем. Яркость клеток пропорциональна количеству присоединенного антитела с соответствующим красителем и определяется положением светящихся клеток относительно осей координат (на панели Л — «облака» зеленого цвета)

Fig. 4. Decreased CrkL phosphorylation with increased PF-114 concentration. (Л) Histograms of distribution of fluorescent events (typical experiment). (Б) Portion of CrkL-positive cells (data from 3 experiments; mean values ± standard deviations). Phycoery-thrin (ФЭ) and AlexaFluor488 are fluorescent dye. They are conjugated chemically to primary and secondary antibodies for multicolored protein detection in flow cytometry or immunocyto(histo)chemistry. The PF-114 concentrations (in nmol/l; 0, 10, 30, 100) are indicated not on the X axis, but under individual squares. Х and Y axes: fluorescence of cells in instrument detectors demonstrating luminescence of ФЭ (Х axis) or AlexaFluor488 (Y axis). Measuring units for ФЭ and AlexaFluor488: so called fluorescent channels, i.e. conditional brightness values (or fluorescence intensity). These values reflect the number of cells which have attached this or that antibody with the fluorescent dye. Cell brightness is proportional to the amount of attached antibody with a corresponding stain and is determined by the location of fluorescent cells relative to the axis (on Л panel: green 'clouds')

0

тест-система пригодна, т. к. специфична только для Всг-АЬ1-позитивных клеток и адекватна для количественной характеристики функциональной активности Всг-АЬ1.

Сопоставление экспериментальных условий реализации гибели Всг-АЬ1-позитивных клеток и ин-гибирования в них фосфорилирования СгкЬ важно для установления механизмов противоопухолевого действия PF-114. Если гибель клеток К562 развивается в течение нескольких суток, то для ингибирования Всг-АЬ1-опосредованного фосфорилирования СгкЬ достаточно относительно кратковременного (2 ч) воздействия. Цито-токсический эффект проявляется при более низких концентрациях PF-114, чем требуемые для ингибирования фосфорилирования СгкЬ. Действительно, снижение доли клеток с фосфо-СгкЬ наблюдается при использовании высоких (сверхлетальных) концентраций PF-114. Даже 10 нмоль/л — концентрация, превышающая 1С50 (см. рис. 3), оказалась недостаточной для ингибирования Всг-АЬ1-зависимого фосфорилирования в использованных нами экспериментальных условиях. Вероятно, для достижения гибели клеток необязательно блокирование

фосфорилирования именно белка CrkL. Кроме CrkL другие белки-партнеры Bcr-Abl (см. рис. 1) могут принимать участие в индукции и реализации цитотоксичности PF-114. Ресурс www.kinasource.co.uk [14] приводит перечень из 18 белков, фосфорилируемых химерной тирозин-киназой, среди которых каспаза 9, РНК-полимераза II, ДНК-зависимая протеинкиназа, протеинкиназа D и др. Требуется установить роль LASP1 (LIM and SH3 domain protein) — белка, ассоциированного с цитоскелетом и фосфорилируемого Bcr-Abl [15, 16]. Интересна и возможность ингибирования аутофосфорилирования самой тирозинкиназы, показанная для иматиниба [17]: в этом случае прерываются разные Bcr-Abl-зависимые сигнальные пути.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для установления связи механизмов цитотоксич-ности PF-114 с ингибированием фосфорилирования белков-партнеров требуется детальное исследование зависимости указанных феноменов от концентрации

соединения и времени воздействия. Важно, что высокая специфичность к внутриклеточной мишени, преимущественная цитотоксичность для клеток ХМЛ, способность подавлять функцию химерной тирозинкиназы как результат клинически важной мутации, а также благоприятные фармакологические свойства [12] обусловливают перспективность нового препарата для лечения ХМЛ на основе соединения PF-114.

КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов. А.А. Штиль, член редакционной коллегии журнала «Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика», не участвовал в рецензировании рукописи.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование не имело спонсорской поддержки.

ВКЛАД АВТОРОВ

Концепция и дизайн: А.А. Штиль, Г.Г. Чилов. Сбор и обработка данных: Е.С. Колотова, В.В. Татарский, А.А. Калинина.

Предоставление материалов исследования: Г.Г. Чилов, А.А. Зейфман, О.В. Строганов, В.С. Стройлов, И.Ю. Титов, Ф.Н. Новиков.

Анализ и интерпретация данных: все авторы. Подготовка рукописи: А.А. Штиль, Г.Г. Чилов, Е.С. Колотова, В.В. Татарский.

Окончательное одобрение рукописи: А.А. Штиль. Административная поддержка: А.А. Штиль.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Mace ML, Dahl J, Jabbour EJ. Which tyrosine-kinase inhibitor to use first in chronic phase chronic myelogenous leukemia? Expert Opin Pharmacother. 2015;16(7):999-1007. doi: 10.1517/14656566.2015.1031107.

2. Grover P, Shi H, Baumgartner M, Camacho CJ, Smithgall TE. Fluorescence polarization screening assays for small molecule allosteric modulators

of ABL kinase function. PLoS One. 2015;10(7):e0133590. doi: 10.1371/journal. pone.0133590.

3. Panjarian S, lacob RE, Chen S, Engen JR, Smithgall TE. Structure and dynamic regulation of Abl kinases. J Biol Chem. 2013;288(8):5443-50. doi: 10.1074/jbc.r112.438382.

4. Клиническая онкогематология: Руководство для врачей. Под ред. М.А. Волковой. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 2007. С. 555.

[Volkova MA, ed. Klinicheskaya onkogematologiya: Rukovodstvo dlya vrachei. (Clinical oncohematology: guidelines for doctors.) 2nd revised edition. Moscow: Meditsina Publ.; 2007. p. 555 (In Russ)]

5. Panigrahi S, Stetefeld J, Jangamreddy JR, et al. Modeling of molecular interaction between apoptin, BCR-Abl and CrkL - an alternative approach to conventional rational drug design. PLoS One. 2012;7(1):e28395. doi: 10.1371/ journal.pone.0028395.

6. Nichols GL, Raines MA, Vera JC, et al. Identification of CRKL as the consti-tutively phosphorylated 39-kD tyrosine phosphoprotein in chronic myelogenous leukemia cells. Blood. 1994;84(9):2912-8.

7. Jangamreddy JR, Panigrahi S, Lotfi K, et al. Mapping of apoptin-interaction with BCR-ABL1, and development of apoptin-based targeted therapy. Onco-target. 2014;5(16):7198-211. doi: 10.18632/oncotarget.2278.

8. Lucas CM, Harris RJ, Giannoudis A, et al. BCR-ABL1 tyrosine kinase activity at diagnosis, as determined via the pCrkL/CrkL ratio, is predictive of clinical outcome in chronic myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2010;149(3):458-60. doi: 10.1111/j.1365-2141.2009.08066.x.

9. O'Brien SG, Guilhot F, Larson RA, et al. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia. N Engl J Med. 2003;348(11):994-1004. doi: 10.1056/nejmoa022457.

10. Baccarani M, Deininger MW, Rosti G, et al. European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013. Blood. 2013;122(6):872-84. doi: 10.1182/blood-2013-05-501569.

11. Cortes JE, Kantarjian H, Shah NP, et al. Ponatinib in refractory Philadelphia chromosome-positive leukemias. N Engl J Med. 2012;367(22):2075-88. doi: 10.1056/nejmoa1205127.

12. Mian AA, Rafiei A, Haberbosch I, et al. PF-114, a potent and selective inhibitor of native and mutated BCR/ABL is active against Philadelphia chromosome-positive (Ph+) leukemias harboring the T315I mutation. Leukemia. 2015;29(5):1104-14. doi: 10.1038/leu.2014.326.

13. Hamilton A, Elrick L, Myssina S, et al. BCR-ABL activity and its response to drugs can be determined in CD34+ CML stem cells by CrkL phosphorylation status using flow cytometry. Leukemia. 2006;20(6):1035-9. doi: 10.1038/ sj.leu.2404189.

14. Knebel A. Kinasource protein kinase substrate screen KESTREL. Available from: http://www.kinasource.co.uk/ (accessed 21.03.2016).

15. Lin YH, Park ZY, Lin D, et al. Regulation of cell migration and survival by focal adhesion targeting of Lasp-1. J Cell Biol. 2004;165(3):421-32. doi: 10.1083/jcb.200311045.

16. Frietsch JJ, Kastner C, Grunewald TG, et al. LASP1 is a novel BCR-ABL substrate and a phosphorylation-dependent binding partner of CRKL in chronic myeloid leukemia. Oncotarget. 2014;5(14):5257-71. doi: 10.18632/ oncotarget.2072.

17. Liang X, Hajivandi M, Veach D, et al. Quantification of change in phosphorylation of BCR-ABL kinase and its substrates in response to Imatinib treatment in human chronic myelogenous leukemia cells. Proteomics. 2006;6(16):4554-64. doi: 10.1002/pmic.200600109.