CC BY
81
ПЕРВЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ЛАБОРАТОРНОЙ УСТАНОВКЕ ДЛЯ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ И УДАРНО-ВОЛНОВОЙ СОНОПОРАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
Ю.В. Андриянов, А.А. Кубатиев, Т.И. Игнашкова, М.Е. Мещерский, А.А. Московцев, А.А. Соколовская ГНЦ РФ ТРИНИТИ, andryu@gcnet.ru. НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН
В 2007 году в ГНЦ РФ ТРИНИТИ была содана лабораторная установка для проведения медико-биологических исследований и отработке оптимальных режимов электропорации и ударно-волновой сонопорации различных клеточных культур. Эта установка обеспечивает возможности воздействия на клетки импульсными электрическими полями различной длительности и амплитуды, акустическми ударными волнами и комбинированное воздействие. Фотография установки показана на рис. 1.
Рис. 1. Установка для электросонопорации.
Слева на столе размещена . ударно-волновая ванна с тремя излучателями акустических ударных волн, два из которых размещены на боковых стенках ванны
и один на дне ванны. Сверху ванны размещен блок позиционирования кюветы с клеточной культурой в зоне фокуса многопучкового излучателя акустических ударных волн. Рядом с ванной находится блок питания шаговых двигателей и контролеров. Внизу стойки размещены генератор миллисекундных импульсов напряжения и системный блок компьютера. Над ними размещается кабельный генератор высоковольтных импульсов субмикросекундного диапазона. Над монитором размещаются зарядные блоки генераторов и блок осциллографа. На верху стойки размешен многоканальный генератор запускающих импульсов. Два электромагнитных излучателя акустических фокусированных ударных волн размещены на боковых стенках ванны. Они создают две встречные волны, которые одновременно приходят в кювету с клеточной культурой. Один излучатель укреплен на дне ванны, ударная волна от него приходит в кювету через 300 - 400 мкс после прихода боковых волн и предназначена для индуцированного схлопывания микропузырьков, образовавшихся после прохождения первых двух ударно-волновых импульсов. 1. Материалы и методы исследования.
1.1. Исследования проводились in vitro на культурах клеток: 293 (почка эмбриона человека), Jurkat (Т-лимфобластная лейкемия человека).
1.2 Культивирование клеток. Адгезионные клетки 293 культивировали на среде DMEM c 10 % FBS (Gibco™ Invitrogen Corporation) в атмосфере 5% СО2, суспензионные Jurkat - RPMI1640 c 10 % FBS (GibcoTM Invitrogen Corporation) в атмосфере 5% СО2.
1.3. Электропорация клеточных культур. После однократной отмывки в PBS при 4°С готовили стандартные клеточные суспензии линий 293 и Jurkat в PBS - для линий MCF-7, 293 с плотностью 2,0х106 кл/мл, для Jurkat - 4,0х106 кл/мл. Аликвоты клеточных суспензий помещали в охлажденную кювету для электропорации типа Biorad с расстоянием между электродами 4 мм.
1.4. Определение цитотоксичности импульсного электрического поля различных длительности и амплитуды (электропорации) для культур клеток Jurkat с помощью МТТ-теста. После электропорации кювету инкубировали 5 мин при комнатной температуре, после чего суспензию из кюветы и переносили на 96-луночный микропланшет, в каждую лунку которого вносили по 10 мкл раствора МТТ (3[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий). После 4ч инкубации в условиях роста клеток добавляли 100 мкл ДМСО в каждую лунку и регистрировали оптическую плотность при длине волны 540 нм с помощью фотометра Biotek ELx 808.
1.5.Определение эффективности обусловленного электропорацией трансмембранного транспорта флуоресцентных зондов: кальцеин (calcein) и пропидий иодид. В кювету для электропорации после внесения аликвот клеточных суспензий добавляли равный объем PBS с растворенными кальцеином и пропидий йодидом так, что конечная концентрация кальцеина составляла 10-4 М/л, пропидий йодида - 0,1 мг/мл. После электропорирования суспензию клеток анализировали на проточном цитометре. Флуоресценцию зондов регистрировали также с помощью флуоресцентной микроскопии. В качестве контроля использовали стандартные клеточные суспензии, смешанные с равными объемами PBS с растворенными флуоресцентными зондами до идентичных конечных концентраций. 1.6. Проточная цитометрия для анализа трансмембранного транспорта флуоресцентных зондов.
Анализ клеточных суспензий осуществлялся на проточном цитометре Partec Pas. Возбуждение флуоресценции осуществлялось лазером с длиной волны 488 нм. Контрольные клетки без воздействия формировали пик аутофлуоресценции, от конца которого до максимального значения трехдекадной логарифмической шкалы
выставляли линейный гейтинг. Клетки с порами благодаря диффузии зондов приобретают большую интенсивность флуоресценции и располагаются на шкале интенсивности правее пика аутофлуоресценции.
1.7. Флуоресцентная микроскопия для анализа трансмембранного транспорта флуоресцентных зондов.
Детекцию флуоресценции зондов проводили на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TE 2000, оснащенном контрастом Хоффмана и конфокальным модулем C1 с лазерами 488 и 543 нм. Использовался фильтр возбуждения (450-490 нм) и эмиссии (>515 нм) флуоресценции 1.9 Статистическая обработка результатов
Производилась с помощью программного обеспечения Statistica ver.6.0 (StatSoft Inc, U.S.A.), а также Microsoft Excel. Использовались однофакторный дисперсионный анализ и критерий Крускала-Уоллиса. Различия считались достоверными при p<0,05
Результаты
1.1. Цитотоксичность электропорации.
Цитотоксичность систем переноса генетического материала, белков и наночастиц в клетку является существенным фактором, ограничивающим применение методов, основанных на трансфекции. Определение цитотоксичности является важным этапом характеристики векторных систем (Uchida et al., 2002).
При выборе метода оценки цитотоксичности электропорации исходили из предположения, что действие импульсным электрическим полем на клетку может быть обусловлено не только прямым мембранотропным эффектом, но и иметь отсроченный эффект. Для определения общей цитотоксичности был использован МТТ-тест, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый МТТ в окрашенный формазан, который кристаллизуется внутри клетки.
На основе полученных данных мы можем заключить, что общая цитотоксичность режимов электропорации в диапазоне (600-700 V; 3100-3700 мкс) является приемлемой для культуры клеток Jurkat, что делает возможным, учитывая данные трансмембранного транспорта, применение этого режима работы установки для обеспечения эффективной трансфекции и переноса различных соединений в клетки.
1.2. Определение эффективности обусловленного электропорацией трансмембранного транспорта флуоресцентных зондов: кальцеин (calcein) и пропидий иодид.
Флуоресцентные зонды: кальцеин (calcein) и пропидий иодид - не способны проникать через плазматическую мембрану жизнеспособной клетки (без повреждений плазматической мембраны). При электропорации диффузия зондов в цитоплазму становится возможной благодаря индукции временных пор в мембране под действием кратковременного электрического поля. По диффузии флуоресцентных зондов, присутствующих во внеклеточной среде, можно судить об эффективности индукции пор в мембране.
Данные проточной цитометрии (рис.2 а,в) свидетельствуют об увеличении эффективности проникновении кальцеина при амплитуде импульса 600 V с ростом продолжительности импульса с максимумом 3700 мкс, при котором процент клеток с флуоресценцией выше порогового значения (гейтированных клеток) превышает 40% (канал Fl1). Учитывая оптимальную токсичность, этот режим можно считать оптимальным. По каналу Fl3, соответствующему флуоресценции интеркалирующего пропидия йодида, наблюдается статистически значимый крайне незначительный рост процента гейтированных клеток, что может
свидетельствовать о затрудненной диффузии пропидий йодида через ядерную мембрану.
Эффективность трансмембранного транспорта при электропорации 300 V, клетки Jurkat
%fl1 g %fl3 g
700 1300 1900 2500 3100 3700 Длительность импульса, мкс
Эффективность трансмембранного транспорта при электропорации 300 V, клетки Jurkat
Mean-: Mean-:
700 1300 1900 2500 3100 Длительность импульса, мкс
б
а
50
45
40
35
30
30
25
25
а 20
15
10
0
Эффективность трансмембранного транспорта при 50 электропорации 600 V, клетки Jurkat
~2те224 0
%fl1 gate %fl3 gate
700 1300 1900 2500 3100 Длительность импульса, мкс
Эффективность трансмембранного транспорта при электропорации 300 V, клетки Jurkat
SMean-x f ■ Mean-x f
700 1300 1900 2500 3100 Длительность импульса, мкс
в
г
0
Рис. 2. Определение эффективности обусловленного электропорацией трансмембранного транспорта флуоресцентных зондов: кальцеин (са1сещ) и пропидий иодид с помощью проточной
цитометрии.
Статистически достоверная разница (рис.2 б, г) между медианой флуоресценции для амплитуды 600 V по сравнению с 300 V, причем роста ее не происходит при увеличении длительности импульса, может говорить о том, что для высокоамплитудных импульсов общая флуоресценция, а следовательно, эффективность диффузии в среднем для клеток под воздействием импульса 600 V выше.
1.3. Ударно-волновое акустическое поле.
Анализ действия на клетки ударно-волнового акустического поля, проведенный на установке при максимально достижимой мощности импульсов при зарядном напряжении на емкости 9,5 кВ и числе импульсов от 10 до 100 показал статистически достоверное по сравнению с контролем увеличение эффективности трансмембранного транспорта флуоресцентных зондов, обусловленного сонопорацией. При данной экспериментальной схеме процент гейтированных клеток был невысок ( около 6% при 100 ударах), в связи с чем планируется оптимизация условий эксперимента, в частности, обеспечение более эффективной кавитации.
