CC BY
0
DOI: https://doi.org/10.17650/1818-8346-2023-18-4-181-195
C«D1
Перспективы применения высокопроизводительного секвенирования у пациентов с фолликулярной лимфомой
Е.О. куневич1, И.С. Мартынкевич1, М.А. Михалева1, А.Н. Богданов2, Е.В. Мотыко1, А.Ю. кувшинов1, С.В. Сидоркевич1, С.В. Волошин1, 3
1ФГБУ«Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»; Россия, 191024 Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16;
2ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»; Россия, 199034 Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7—9;
3ФГБВОУВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Минобороны России; Россия, 194044 Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6
Контакты: Евгений Олегович Куневич kunevich17@gmail.com
Цель исследования - изучить прогностическую значимость мутаций генов и вовлекаемых в лимфомагенез внутриклеточных сигнальных путей у пациентов с фолликулярной лимфомой с применением анализа секвенирования следующего поколения (next generation sequencing, NGS).
Материалы и методы. В проспективное исследование включены 26 пациентов с медианой возраста 51,5 года. Всем пациентам проведен мутационный скрининг с использованием NGS-панели зондов к 118 генам. Анализ обогащения набора генов (gene set enrichment analysis, GSEA) проводили с использованием Metascape. Данные анализировали в SPSS Statistics 26 и R 4.2.2.
Результаты. Наибольшая частота мутаций отмечалась в генах: KMT2C- 50 %, KMT2D - 50 %, CREBBP - 31 %, NOTCH2 -31 %, GNAS - 23 %. Миссенс-мутации встречались с частотой 84,3 %. Мутация гена ARID1A является неблагоприятным фактором прогноза по данным анализа беспрогрессивной (р = 0,014) и бессобытийной (р = 0,029) выживаемости.
Опухолевая мутационная нагрузка (tumor mutational burden, ТМВ) определялась как количество мутаций на 1 мега-базу (Mb) кодирующей последовательности, медиана TMB составила 5,0 (3,3-8,3) мутации/Mb. Пороговое значение ТМВ, равное 6 мутациям/Mb, распределяло пациентов на группы с высокой (44 %) и низкой (56 %) ТМВ. В группе высокой TMB 2-летняя бессобытийная выживаемость составила 27,3 % (95 % доверительный интервал 6,0-61,0), что достоверно ниже, чем в группе низкой ТМВ - 72,7 % (95 % доверительный интервал 41,9-91,6; р = 0,037). По результатам GSEA наиболее обогащенными клеточными процессами являлись пути регуляции клеточной активации (-log^q-значение) = 6,357), ремоделирования хроматина (-log^q-значение) = 5,707) и модификации гистонов (-log^q-значение) = 4,569). Нами также продемонстрированы другие возможности применения GSEA на примере фолликулярной лимфомы.
Заключение. TMB - значимый прогностический фактор у пациентов с фолликулярной лимфомой. Установлено, что мутации в генах MYC, CREBBP, EZH2, KMT2D приводят к дисрегуляции в нескольких внутриклеточных процессах, опосредуя сложные молекулярные изменения. Наиболее обогащенными внутриклеточными путями при фолликулярной лимфоме являются пути ремоделирования хроматина, регуляции клеточной активации и модификации гистонов.
Ключевые слова: фолликулярная лимфома, секвенирование следующего поколения, опухолевая мутационная нагрузка, анализ обогащения набора генов, мутация, эпигенетика, сигнальный путь, прогноз
Для цитирования: Куневич Е.О., Мартынкевич И.С., Михалева М.А. и др. Перспективы применения высокопроизводительного секвенирования у пациентов с фолликулярной лимфомой. Онкогематология 2023;18(4):181-95. DOI: https://doi.org/10.17650/1818-8346-2023-18-4-181-195
со cv
cv
ев
со cv
сч
4
Perspectives for next generation sequencing in patients with follicular lymphoma
E.O. Kunevich', I.S. Martynkevich', M.A. Mikhaleva', A.N. Bogdanov2, E. V. Motyko1, A. Yu. Kuvshinov', S. V. Sidorkevich', S. V. Voloshin', 3
1Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, Federal Medical and Biological Agency; 16 2nd Sovetskaya St., Saint Petersburg 191024, Russia;
" 2Saint Petersburg State University; 7—9 Universitetskaya Naberezhnaya, Saint Petersburg 199034, Russia;
-J 3Military Medical Academy named after S.M. Kirov, Ministry of Defense of Russia; 6 Akademika Lebedeva St.,
s» Saint Petersburg 194044, Russia m
oj Contacts: Evgenii Olegovich Kunevich kunevich17@gmaii.com cv
4
CS
Aim. To study the prognostic significance of gene mutations and intracellular signaling pathways involved in lymphomagenesis in patients with follicular lymphoma using next generation sequencing (NGS).
Materials and methods. The prospective study included 26 patients with a median age of 51.5 years. Mutational screening was performed for cohort using custom NGS Panel of 118 genes. Gene set enrichment analysis (GSEA) was performed using Metascape. The data was analyzed in SPSS Statistics 26 and R 4.2.2.
Results. The highest mutation frequency was noted in the genes: KMT2C - 50 %, KMT2D - 50 %, CREBBP - 31 %, NOTCH2 - 31 %, GNAS - 23 %. Missense mutations occurred with a frequency of 84.3 %. ARID1A gene mutation is an unfavorable prognostic factor according to progressive-free (p = 0.014) and event-free (p = 0.029) survival analysis. Tumor mutation burden (TMB) was defined as the number of mutations per megabase (Mb) of the coding sequence, the median TMB was 5.0 (3.3-8.3) mutations/Mb. The TMB threshold of 6 mutations/Mb divided patients into groups with high (44 %) and low (56 %) TMB. In the high TMB group, 2-year event-free survival was 27.3 % (95 % confidence interval 6.0-61.0), which was significantly lower than in low TMB group - 72.7 % (95 % confidence interval 41.9-91.6; p = 0.037).
The most enriched cellular pathways according to GSEA results were regulation of cell activation (-log10(q-value) = 6.357), chromatin remodeling (-log10(q-value) = 5.707), histone modification (-log10(q-value) = 4.569). We have also demonstrated other possibilities of GSEA using follicular lymphoma as an example.
Conclusion. TMB is a significant prognostic factor in patients with follicular lymphoma. We have shown that mutations ej in the MYC, CREBBP, EZH2, KMT2D genes lead to dysregulation in several intracellular processes, mediating complex mo-
ist lecular changes. The most enriched intracellular pathways in follicular lymphoma are those of chromatin remodeling,
pj regulation of cell activation and histone modification.
Keywords: follicular lymphoma, next generation sequencing, tumor mutation burden, gene set enrichment analysis, 2 mutation, epigenetics, signaling pathway, prognosis
i_ For citation: Kunevich E.O., Martynkevich I.S., Mikhaleva M.A. et al. Perspectives for next generation sequencing in
^ patients with follicular lymphoma. Onkogematologiya = Oncohematology 2023;18(4):181-95. (In Russ.). DOI: https://
doi.org/10.17650/1818-8346-2023-18-4-181-195
со cv
Введение
Идентификация генетических аберраций в контексте изучения измененных сигнальных путей в опухолевых клетках обеспечила более целостное понимание патогенетических механизмов, лежащих в основе генеза, прогрессирования и химиорезистентности лимфом. Как следствие, нарушение функции гена или группы генов необходимо анализировать как часть сложной сети, состоящей из нескольких компонентов, тесно связанных друг с другом. Изучение функционирования подобных сетей, в частности отдельно всех ее компонентов, стало возможным благодаря развитию методов высокопроизводительного секвенирования с применением технологий машинного обучения.
К настоящему времени с помощью методов секве-нирования следующего поколения (next generation sequencing, NGS) расширены наши познания в патогенезе онкологических новообразований, охарактеризованы вовлекаемые в онкогенез сигнальные клеточные пути, получены новые данные о прогностической роли мутаций генов и определены вероятные мишени для таргетной терапии.
Фолликулярная лимфома (ФЛ) — гетерогенное заболевание, характеризующееся большим разнообразием генетических изменений, лежащих в основе его патобиологии. Реципрокная транслокация t(14;18) (q32.3;q21.3), приводящая к гиперэкспрессии гена BCL2,
является отличительной чертой ФЛ [1, 2]. Кроме этого, проведенные молекулярно-генетические исследования позволили идентифицировать большое количество повторяющихся соматических мутаций, изменяющих функционирование множества сигнальных путей, потенциально вовлеченных в патогенез ФЛ, включая гены эпигенетической регуляции транскрипции (KMT2D, СЯЕВВР, EZH2, ЕР300), гены гистонов (НШ1Н1В, НШ1Н1С, НШ1НЮ), компоненты сигнального пути В-клеточного рецептора, гены вакуо-лярной АТФазы, иммунного окружения и др. [2, 3].
Эффективным подходом к определению перспективных диагностических биомаркеров и терапевтических мишеней при лимфопролиферативных новообразованиях является использование методов биоинформатики, которые представляют собой мощный инструмент изучения молекулярных каскадов, лежащих в основе возникновения и прогрессирования заболеваний, на основании накопленных больших данных. Появление биоинформационных технологий предлагает новые подходы к исследованию молекулярной основы заболеваний и идентификации биомаркеров, что способствует развитию молекулярной диагностики опухолей, таргетного и персонифицированного лечения.
Цель исследования — изучение прогностической значимости мутаций генов и вовлекаемых в лимфомагенез
внутриклеточных сигнальных путей у пациентов с ФЛ с применением NGS.
Материалы и методы
В проспективное исследование были включены 26 пациентов (14 (54 %) женщин и 12 (46 %) мужчин; соотношение 1,2:1) с впервые диагностированной ФЛ, получавших лечение в гематологической клинике Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии ФМБА (Санкт-Петербург) в период с 2016 г. по настоящее время. Медиана возраста пациентов составила 51,5 (37,5—70,0) года. Медиана периода наблюдения — 16,3 (8,2—34,0) мес.
Перестройки генов BCL2, BCL6, а также del17p/ ТР53 оценивали с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Интерпретацию патологии карио-типа и полученных результатов проводили в соответствии с Международной номенклатурой ISCN 2020 (International System for Human Cytogenomic Nomenclature) [4].
Анализ NGS проводили на платформе NextSeq (Illumina, США) методом парного концевого чтения. Образцы ДНК выделяли из периферических монону-клеаров крови с применением Ficoll-Paque градиентного метода. Для пробоподготовки использован метод гибридизационного селективного обогащения фрагментами ДНК, относящимися к кодирующим областям 118 исследуемых генов с применением кастомной панели зондов производства Roche (лимфоидная таргетная NGS-панель, табл. 1) согласно протоколу производителя. Обработку данных секвенирования проводили с использованием автоматизированного алгоритма,
включающего выравнивание прочтений на референс-ную последовательность генома человека (hg37), пост-процессинг выравнивания, выявление вариантов нуклеотидной последовательности (здесь и далее «варианты») и фильтрацию вариантов по качеству. Целевая глубина прочтения составила 1000х. При анализе полученных данных применяли 2 % порог частоты встречаемости аллеля. Клиническую значимость выявленных мутаций оценивали с помощью баз данных COSMIC, ClinVar, gnomAD с применением in silico анализа (Cscape, Cancer Genome Interpreter, SNPs&Go). Интерпретацию клинической значимости предположительно соматических вариантов проводили на основании рекомендаций AMP (Association for Molecular Pathology) [5], терминальных вариантов — на основании рекомендаций ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics) [6]. Выявленные варианты нуклеотидной последовательности распределяли на 5 групп: патогенный, вероятно патогенный, неопределенного значения, вероятно доброкачественный, доброкачественный [7]. Попарное сравнение с герми-нальной ДНК не проводили.
Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 26.0.0.0, R версии 4.2.2, Morpheus (https://software. broadinstitute.org/morpheus). Анализ обогащения набора генов (gene set enrichment analysis, GSEA) проводили с помощью Metascape (https://metascape.org/gp/ index. html#/main/step1) [8].
Количественные данные анализировали с помощью U-критерия Манна—Уитни. Независимые категориальные данные сравнивали с использованием
СО
cv
cv
4
CS
со cv
cv
4
Таблица 1. Лимфоидная таргетная панель секвенирования следующего поколения (NGS) Table 1. Lymphoid targeted next generation sequencing (NGS) panel
ABL1 AKT3 ALK APC ARID1A ASXL1 ATM ATRX B2M
BCL2 BCOR BCORL1 BCR BIRC3 BRAF BRCA1 BRCA2 BTK
CALR CARD11 CBL CCND1 CD58 CD79B CDKN2A CDX2 CEBPA
CIITA CREBBP CSF3R CUX1 DDX3X DEK DIS3 DNMT3A EP300
ETV6 EZH2 FAT1 FBXW7 FLT3 GATA1 GATA2 GJB2 GNA13
GNAS H1-1 HRAS ID3 IDH1 IDH2 IKZF1 IKZF3 IRF4
ITPKB JAK2 JAK3 KDM6A KDR KIT KLF2 KMT2A KMT2C
KMT2D KRAS MAP2K1 MEF2B MGA MPL MSN MYC MYD88
NF1 NOTCH1 NOTCH2 NPM1 NRAS NSD2 PDGFRA PHF6 PIK3CB
PIM1 PKHD1 PLCG2 POT1 PRDM1 PTCH1 PTEN PTPN11 PTPRD
RAD21 RB1 RHOA RPS15 RUNX1 RYR1 SAMHD1 SETBP1 SF3B1
SH2B3 SMARCA4 SMC1A SMC3 SOCS1 SRSF2 STAG2 STAT3 STAT6
SUZ12 SYK TENT5C TET2 TNFAIP3 TP53 U2AF1 WT1 XPO1
ZRSR2
со cv
сч
ев
со cv
сч
™ X2- критерия Пирсона, в случае малых выборок — точ-о ного двустороннего теста Фишера. Пороговые значения количественных переменных определяли с помощью ROC-анализа. Парный корреляционный анализ проводили методом Спирмена. В качестве метода классификации применяли иерархический кластерный анализ. Анализ выживаемости проводили с использованием метода Каплана—Майера с применением log-rank-теста для оценки достоверности различий. Зависимость времени дожития от независимых переменных оценивали с помощью регрессионного анализа Кокса.
Количественные данные представлены в виде медианы и 1-го и 3-го квартилей (Ме (Q3—Qj)), частоты — в виде собственных значений с указанием 95 % доверительного интервала (ДИ). Уровень значимости считали равнымp <0,05. В GSEA применяли поправку Бенджамини—Хохберга для множественных сравнений. Общую выживаемость (ОВ) определяли со дня верификации диагноза до даты смерти от любой причины. Точкой отсчета для выживаемости без прогрес-сирования (ВБП) и бессобытийной выживаемости (БСВ) считали дату 1-го дня 1-го цикла терапии, для безрецидивной выживаемости — дату достижения полной ремиссии. В анализе БСВ событием считали прогрессирование, рецидив, трансформацию или смерть от любой причины.
Результаты
краткая характеристика исследуемой группы
Диагноз был морфологически подтвержден у всех 26 пациентов. Поражение костного мозга наблюдалось у 73 % (19/26) больных, экстранодальные поражения выявлены у 27 % (7 /26) пациентов. Медиана концентрации лактатдегидрогеназы (ЛДГ) равнялась 210 (154-310) Ед/л, р2-микроглобулина - 6,2 (3,18,5) мг/л. Распределение пациентов по группам риска в зависимости от Международного прогностического индекса фолликулярной лимфомы (Follicular Lymphoma International Prognostic Index, FLIPI): низкий риск — 8 %, промежуточный риск — 38 %, высокий риск — 54 %; в зависимости от FLIPI-2: низкий риск — 12 %, промежуточный риск — 50 %, высокий риск — 38 %. По результатам первичного обследования II стадия по классификации Ann Arbor верифицирована у 8 % (2/26) пациентов, III стадия — у 11 % (3/26), IV стадия — у 81 % (21/26). Перестройки гена BCL2 отмечались у 50 % (13/26) пациентов, каждое из изменений — перестройка гена BCL6 и делеция del17p/ TP53 — были выявлены у 12 % (3/26) больных.
Медиана времени наблюдения (с момента постановки диагноза до начала терапии 1-й линии) составила 2,6 (1,4—4,7) мес. В качестве 1-й линии иммуно-химиотерапия по протоколу R-CHOP (ритуксимаб, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, пред-низолон) была проведена 27 % (7/26) пациентов, RB (ритуксимаб, бендамустин) — 35 % (9/26), GB (обину-
тузумаб, бендамустин) — 23 % (6/26), ритуксимаб в монорежиме — 15 % (4/26). Поддерживающая терапия применялась у 35 % (9/26) пациентов: у 6 — ритукси-мабом, у 3 — обинутузумабом. Полный ответ был достигнут у 46 % (12/26) пациентов, частичный — у 35 % (9/26), частота общих ответов составила 69 % (18/26). Частота прогрессирований составила 23 % (6/26), рецидивов — 4 % (1/26), трансформаций — также 4 % (1/26). Терапия 2-й линии была проведена 27 % (7/26) пациентов: использовались режимы GB (2/ 7), R-DHAP (ритуксимаб, цисплатин, цитарабин, дексаметазон) с последующей аутологичной трансплантацией стволовых клеток (2/7), RB (1/7), R-CHOP (1/7) и R-GDP (ритуксимаб, цисплатин, гемцитабин, дексаметазон) (1/7).
Мутационный профиль пациентов с фолликулярной
лимфомой
Генетические аберрации отмечались у всех обследуемых пациентов. В 88 из 118 генов было выявлено 638 аллельных вариантов. Мутации в 1 гене встречались в количестве от 1 до 47, медиана количества мутаций в 1 гене равнялась 2 (2—9). Всего выявлено 134 мутации, имеющие клиническое значение, в 51 гене. Наибольшая частота мутаций отмечалась в генах: КМТ2С - 50 %, KMT2D - 50 %, СЯЕВВР - 31 %, ЖТСШ - 31 %, GNAS - 23 %, ГАТ1,1ТРКВ и -по 19 %, АТМ- 15 %, ШD1A - 12 % (рис. 1).
Миссенс-мутации встречались с частотой 84,3 %, нонсенс-мутации - 5,2 %, синонимичные - 4,5 %, мутации со сдвигом рамки считывания - 3,8 %, другие - 2,2 %. Медиана частоты встречаемости аллеля составила 8,96 (3,94-35,64) %.
Среди мутаций гена ARID1A были выявлены 2 вероятно патогенных варианта нуклеотидной последовательности, в обоих случаях приводящих к преждевременной терминации синтеза белка и потере его функции. Это мутация c.5548dupG (p.D1850fsX4) со сдвигом рамки считывания и вариант c.1650dup (p.Y551Lfs*72), приводящий к образованию стоп-ко-дона. В настоящий момент известно, что АЯШ1А участвует в различных биологических процессах в клетке, связанных с регуляцией клеточного цикла, генов-мишеней ТР53 и репарацией повреждений ДНК [9, 10]. По нашим данным, мутации гена ARID1A с потерей функции ассоциированы с достоверно меньшей 5-летней ВБП, а также с 2- и 5-летней БСВ. Пятилетняя ВБП у пациентов с мутацией гена АЯШ1А составила 0 % (медиана 2,4 мес), у пациентов с вариантом гена «дикого» типа - 29,1 % (95 % ДИ 13,2-52,9; медиана 23,5 мес; р = 0,014). У больных ФЛ с мутацией гена ARID1A 2-летняя БСВ составила 0 % (медиана 3,7 мес), что значимо ниже, чем в группе «дикого» типа - 51,8 % (95 % ДИ 30,6-73,2; медиана 20,4 мес; р = 0,029). Аналогичные результаты были получены в отношении 5-летней БСВ (р = 0,029) (рис. 2). По результатам одно-факторного регрессионного анализа относительный
ARID1A
АТМ
KDR
ITPKB
FAT1
GNAS
NOTCH2
CREBBP
KMT2D
KMT2C
CO
cv
cv
4
ев
10
20
30
%
40
50
60
Рис. 1. Гистограмма относительных частот мутаций генов у пациентов с фолликулярной лимфомой Fig. 1. Histogram ofgene mutations relative frequencies in patients with follicular lymphoma
1,0
0,75
0,50
Ж 0,25
Мутации гена ARID1A / ARID1A gene mutation
—|— «Дикий» тип / Wild type
р = 0,014
Мутации гена ARID1A / ARID1A gene mutation
—|— «Дикий» тип / Wild type
р = 0,029
СО
cv
cv
20 40
Время, мес / Time, months
60
5 10 15 20
Время, мес / Time, months
25
0
б
а
0
0
0
Рис. 2. Пятилетняя выживаемость без прогрессирования (а) и 2-летняя бессобытийная выживаемость (б) у пациентов с фолликулярной лимфомой в зависимости от мутационного статуса гена ARID1A
Fig. 2. Five-year progression-free survival (а) and 2-year event-free survival (б) in patients with follicular lymphoma depending on ARID1A gene mutation status
риск (ОР) для мутации гена ARID1A в анализе 5-летней ВБП и БСВ составил 4,630 (95 % ДИ 1,205-17,793; р = 0,026) и 3,940 (95 % ДИ 1,045-14,856; р = 0,043) соответственно.
Частота мутаций гена CREBBP составила 30,8 %, среди них чаще всего встречались миссенс-мутации, приводящие к замене функциональной группы аминокислотного остатка в НАТ-домене белка, ответственном за связывание с гистонами, что может указывать на изменение функциональных свойств продукта гена. У пациента FL158 с крайне неблагоприятным прогнозом (IV стадия, высокие уровни р2-микрогло-булина (6,28 мг/л) и ЛДГ (428 Ед/л), лейкемический состав крови - 103,5 х 109/л, ^14;18), мутация генов ARID1A, В^2, высокий риск FLIPI, резистентность к полихимиотерапии) была выявлена делеция с.5039_504Ые! (p.S1680del) в НАТ-домене. Примеча-
тельно, что объективный ответ был достигнут только в 4-й линии терапии с применением Р13К-ингибитора дувелисиба. У пациента FL141 был обнаружен вероятно патогенный вариант нуклеотидной последовательности c.2123delT (p.L708fsX5) гена CREBBP, приводящий к сдвигу рамки считывания, преждевременной терминации синтеза белка и потере его функции. Большинство описываемых мутаций в гене CREBBP приводят к полной дисфункции НАТ-домена, однако есть сведения, что точечные замены ключевых аминокислот могут иметь схожий негативный эффект [11]. Проведенный анализ выживаемости в зависимости от мутационного статуса гена CREBBP не выявил статистически значимых различий между группами (р >0,1).
В гене KMT2D, частота мутаций которого равнялась 50 %, наиболее часто обнаруживались нонсенс-мутации, приводящие к образованию стоп-кодона,
со cv
сч
4
ев
со cv
сч
4
-г-
0,2 0,4 0,6 0,8
1 - Специфичность / 1 - Specificity
1,0
1,0
0,8
0,6
ш 0,4
0,2
0,2 0,4 0,6 0,8 1 - Специфичность / 1 - Specificity
Рис. 3. ROC-кривые, полученные в отношении 2-летней общей выживаемости (а) и 2-летней бессобытийной выживаемости (б). AUC — площадь под кривой
Fig. 3. ROC curves obtained for 2-year overall survival (а) and 2-year event-free survival (б). AUC — area under the curve
обрыву синтеза белка MLL2 (KMT2D) и потере его функции. У пациента FL141, помимо ранее описанных мутаций генов ARID1A, CREBBP, были обнаружены 2 патогенные мутации в гене KMT2D, одна из которых представляет собой вариант нуклеотидной последовательности с.8366+Ю>А, приводящий к исчезновению сайта сплайсинга, появлению аберрантного транскрипта и потере функции белка. Пациенту FL141 с IV стадией и высоким риском FLIPI и FLIPI-2 была инициирована монотерапия ритуксимабом, достигнут частичный ответ, после чего пациент умер в связи с прогрессией лимфомы. Белок MLL2 участвует в диф-ференцировке клеток, регуляции метаболизма и подавлении развития опухолей, а также необходим для эмбрионального развития. Инактивирующие белок мутации гена KMT2D чаще всего обнаруживаются при В-клеточных лимфомах, происходящих из клеток герминальных центров лимфатических фолликулов [12, 13]. Анализ выживаемости не обнаружил достоверных различий у пациентов в зависимости от мутационного статуса гена KMT2D (р >0,1).
Все выявленные мутации гена Е2Н2 были сконцентрированы в экзоне 16 и представляют собой мис-сенс-мутации замены тирозина на другую аминокислоту. Данные вероятно патогенные варианты нуклеотидной последовательности приводят к усилению ферментативной функции белка EZH2 и изменению экспрессии генов в В-клетках [14]. Анализ выживаемости не выявил статистически значимых различий у пациентов с ФЛ в зависимости от мутационного статуса гена Е2Н2 (р >0,1) как по причине малой выборки, так и в связи с тем, что только 1 пациент (FL012) с мутацией гена Е2Н2 умер из-за возникших осложнений инфекции СОУГО-19,
в то время как у других больных с данной мутацией отмечалось благоприятное течение лимфомы.
Наиболее значимые выявленные варианты патогенных и вероятно патогенных мутаций в генах, ассоциированных с патогенезом и прогнозом ФЛ, представлены в табл. 2.
Метод определения и прогностическая роль опухолевой мутационной нагрузки у пациентов с фолликулярной лимфомой
Для определения прогностической значимости всех выявленных мутаций у каждого пациента была рассчитана опухолевая мутационная нагрузка (tumor mutational burden, ТМВ), которая определялась как количество мутаций на 1 мегабазу (Mb) кодирующей последовательности. Длина экзонов всех 118 исследуемых генов составила 602 917 пар оснований, или 0,603 Mb. Медиана TMB равнялась 5,0 (3,3-8,3) мута-ции/МЬ. В целях определения порогового значения опухолевой нагрузки в отношении предсказания исходов 2-летней ОВ и БСВ (в отношении безрецидивной выживаемости расчеты не проводились по причине малой выборки и низкой частоты событий) выполнен ROC-анализ (рис. 3). Площадь под кривой (AUC) в анализе прогнозирования ОВ равнялась 0,735 (95 % ДИ 0,516-0,947; р = 0,035). Чувствительность модели при значении ТМВ, равном 5,8 мутации/Mb, составила 75,0 %, специфичность — 70,6 %. По данным одно-факторного регрессионного анализа (параметры модели: х2 = 2,744, р = 0,098) ОР для фактора высокой ТМВ составил 5,2 (95 % ДИ 0,6—46,9; р = 0,138). В отношении 2-летней БСВ были получены аналогичные результаты: AUC 0,727 (95 % ДИ 0,518—0,936; р = 0,033),
б
а
0
0
Таблица 2. Наиболее значимые выявленные варианты патогенных и вероятно патогенных мутаций в генах, достоверно ассоциированных с патогенезом и прогнозом фолликулярной лимфомы
Table 2. The most significant identified variants of pathogenic and likely pathogenic mutations in genes reliably associated with the pathogenesis and prognosis offollicular lymphoma
Ген Gene Позиция hg19 Position hg19 комплементарная дНк Белок Частота встречаемости аллеля,% Variant allele frequency, rsm (dbSNP)
complementary DNA Protein
%
ARIDlA chr1:27105930T>TG c.5548dupG p.D1850fs 29,71 rs758608743
ARIDlA chr1:27057936G>GC c.1650dup p.Y551Lfs*72 11,03 rs1415146710
BCR chr22:23653975T>TCCGG c.3275_3278dupCCGG p.V1094fs 16,67 rs372013175
CREBBP chr16:3786704A>G c.4507T>C p.Y1503H 39,53
CREBBP chr16:3788657A>T c.4297T>A p.Y1433N 10,75
CREBBP chr16:3827648CA>C c.2123delT p.L708fs 26,79
CREBBP chr16:3788617C>T c.4337G>A p.R1446H 14,79 rs1057519884
CREBBP chr16:3781323AAGG>A c.5039_5041del p.S1680del 42,71 rs587783502
CREBBP chr16:3786748G>A c.4463C>T p.P1488L 25,00
EZH2 chr7:148508727T>A c.1937A>T p.Y646F 5,58 rs267601394
EZH2 chr7:148508728A>T c.1936T>A p.Y646N 13,56
EZH2 chr7:148508727T>G c.1937A>C p.Y646S 8,30 rs267601394
KMT2C chr7:151962296T>C c.1013-2A>G 5,93 rs751158858
KMT2C chr7:151945349T>A c.2170A>T p.K724* 2,38 rs201039690
KMT2D chr12:49445440C>A c.2026G>T p.Glu676* 24,74
KMT2D chr12:49426798A>T c.11690T>A p.L3897* 3,15
KMT2D chr12:49424741G>A c.13606C>T R4536* 31,58 rs587783692
KMT2D chr12:49433004C>T c.8366+1G>A 29,13 rs1057518149
KMT2D chr12:49439958C>T c.4584-1G>A 9,68
KMT2D chr12:49433247G>A c.8200C>T p.R2734* 27,80
CÏ
cv
cv
4
CS
со cv
cv
4
Примечание. rsID — идентификатор эталонного кластера SNP (однонуклеотидного полиморфизма); dbSNP — база данных однонуклеотидных полиморфизмов.
Note. rsID — reference SNP (single nucleotide polymorphism) cluster ID; dbSNP — the single nucleotide polymorphism database.
чувствительность при значении ТМВ 5,8 мута-ции/МЬ - 72,7 %, специфичность - 78,6 % (в отношении 5-летней БСВ получены аналогичные результаты). В однофакторном регрессионном анализе (параметры модели: х2 = 4,336, р = 0,037) ОР для высокой ТМВ составил 3,8 (95 % ДИ 1,0-14,2; р = 0,052). При удовлетворительных показателях чувствительности и специфичности обе модели имели сравнительно одинаковую предсказательную ценность. Таким образом, с помощью ROC-анализа было определено пороговое значение ТМВ, в соответствии с которым все пациенты были разделены на 2 группы: низкой ТМВ (до 5 мутаций включительно на 1 МЬ) (14 (56 %) боль-
ных) и высокой ТМВ (6 и более мутаций на 1 МЬ) (12 (44 %) больных).
Обе группы достоверно не отличались во возрасту (р = 0,236) и по лимфома-ассоциированным параметрам: количеству лимфоцитов (р = 0,607), ЛДГ (р = 0,589), р2-микроглобулину (р = 0,607). Длительность наблюдения и вариант проводимой терапии также были одинаковыми в обеих выборках (р = 0,217 и р = 0,120 соответственно). Объем опухолевой массы, оцененный по сумме произведений перпендикулярных диаметров 6 таргетных очагов, в дебюте заболевания не отличался в исследуемых группах (р = 0,150) и не коррелировал с ТМВ, коэффициент корреляции г составил -0,222
со cv
сч
4
CS
со cv
сч
4
1,0
§ 0,75
'5
Б 0,50 о
1 0,25
ч
—I— ТМВ высокая / ТМВ high -+- ТМВ низкая / ТМВ low р = 0,098
1,0
0,75
0,50
Ъ 0,25
0
ТМВ высокая / ТМВ high ТМВ низкая / ТМВ low
р = 0,037
10 15 20
Время, мес / Time, months
25
10 15 20
Время, мес / Time, months
25
Рис. 4. Двухлетняя общая (а) и бессобытийная (б) выживаемость у пациентов с фолликулярной лимфомой в зависимости от размера опухолевой мутационной нагрузки (ТМВ)
Fig. 4. Two-year overall (а) and event-free (б) survival in patients with follicular lymphoma depending on the tumor mutational burden (ТМВ)
Клеточная активация / Cell activation
В-клеточная активация / B cell activation
Рост / Growth Клеточный цикл / Cell cycle Сигнальные пути в опухоли / Pathways in cancer МикроРНК в опухоли / MicroRNAs in cancer Ремоделирование хроматина/ Chromatin remodeling Модификация гистонов / Histone modification Организация хроматина / Chromatin organization JAK-STAT-сигнальный путь / JAK-STATsignaling pathway MAPK-каскад / MAPKcascade Передача сигнала NOTCH / Signaling by NOTCH Сигнальный путь МАРК / MAPK signaling pathway Передача сигнала WNT / Signaling by WNT РВК-А^-сигнальный путь / PI3K-Akt signaling pathway
Апоптоз/ пролиферация/ Apoptosis/ proliferation
Онкологические процессы / Cancer
Передача сигнала / Signaling
5 10 15
Количество / Counts
10 8 6 4 -1од10(р-значение) / -logjp-value)
Рис. 5. Анализ функционального обогащения набора генов. По оси абсцисс — количество мутировавших генов, принадлежащих конкретному клеточному процессу; по оси ординат — название клеточных путей, сгруппированных по функциональной принадлежности: апоптоз/про-лиферация, общие онкологические процессы, эпигенетика/транскрип-ция, передача сигнала. Здесь и на рис. 6: -logjfp-значение) — отрицательный логарифм от значения p с основанием 10 Fig. 5. Gene set enrichment analysis. On the abscissa axis — the number of mutated genes belonging to a specific cellular process; on the ordinate axis — the name of cellular pathways grouped by functionality: apoptosis/ proliferation, general oncological processes, epigenetics/transcription, signal transduction. Here and infig. 6: -log0(p-value) — negative logarithm of thep-va-lue to base 10
(р = 0,275). Таким образом, можно констатировать, что обе группы являются однородными.
Двухлетняя ОВ была ниже в группе высокой TMB и составила 62,3 % (95 % ДИ 30,8-89,1) по сравнению с 90,9 % (95 % ДИ 66,1-99,8) у пациентов с низкой ТМВ (р = 0,098). Также группа высокой TMB характеризовалась более низкой 2-летней ВБП — 36,4 % (95 % ДИ 10,9—69,2; медиана 11,0 мес) и 2-летней БСВ — 27,3 % (95 % ДИ 6,0—61,0; медиана 11,0 мес) по сравнению с пациентами с низкой ТМВ — 72,7 % (95 % ДИ 41,9—91,6; р = 0,071) и 72,7 % (95 % ДИ 41,9—91,6; р = 0,037) соответственно (рис. 4).
Частота прогрессирования ФЛ была выше у пациентов с высокой ТМВ и составила 33 % (95 % ДИ 10—65) по сравнению с больными из группы низкой ТМВ — 14 % (95 % ДИ 2—43), однако различия недостоверны (р = 0,250). C учетом низкой частоты рецидивов (1/26) и трансформаций (1/26), которые наблюдались исключительно у пациентов с высокой TMB, межгрупповой анализ по данным параметрам не проводился. Таким образом, обе группы статистически значимо различались по частоте неблагоприятных событий (прогрессирование, рецидив, трансформация), которая в группе высокой ТМВ составила 50 % (95 % ДИ 21—79), а в группе низкой ТМВ — 2 % (95 % ДИ 2—43; р = 0,049).
Возможности изучения функционального профиля генетических мутаций на примере анализа обогащения набора генов
Для идентификации биологических клеточных процессов, вовлеченных в лимфомагенез, у исследуемой выборки пациентов (n = 26) в отношении генов (n = 23), мутации которых наблюдались у 2 и более пациентов (из анализа исключались мутации, выявленные только у 1 пациента, в связи с большой вероятностью случайности события), проводили GSEA
б
а
0
0
5
0
5
0
с использованием следующих источников онтологий: Gene Ontology (GO) Biological Processes, KEGG Pathway, Reactome Gene Sets, Canonical Pathways и WikiPathways. Гены всего генома были использованы в качестве фона обогащения. Три и более гена со значением p <0,01 и коэффициентом обогащения >1,5 (коэффициент обогащения представляет собой отношение между наблюдаемыми и ожидаемыми частотами распределения) собирают и группируют в кластеры на основе сходства их функциональной принадлежности. В частности, значения p вычисляют на основе кумулятивного гипергеометрического распределения [15], а значения q определяют с использованием поправки Бенджамини—Хохберга на множественные сравнения [16]. Суммарно GSEA выявил 271 возможный аннотируемый биологический процесс с вовлечением 3 и более генов при уровне значимостир <0,05. Наиболее обогащенными путями, связанными с он-когенезом, по результатам GSEA явились: регуляция клеточной активации (—log^q-значение) = 6,357), ремоделирование хроматина (—log^q-значение) = 5,707), модификация гистонов (—log^q-значение) = 4,569),
общие пути в опухоли (-^10^-значение) = 4,099), регуляция микроРНК в опухоли (-^10^-значение) = 2,960), JAK-STAT-сигнальный путь (-^10^-значе-ние) = 2,674), МАРК-каскад (-^10^-значение) = 2,335), регуляция клеточного цикла (-^10^-значе-ние) = 1,542) и др. (рис. 5).
Для визуализации ассоциаций между мутировавшими генами и клеточными путями мы построили диаграмму Sankey (рис. 6), на которой размер каждого узла и ширина каждой дуги представляют определенное количество объектов. Например, узел (расположены вертикально и представляют собой разноцветные прямоугольники), состоящий из 5 элементов, будет вдвое меньше, чем узел с 10 элементами. Дуга (серые линии, соединяющие узлы на графике), проходящая через 20 объектов, будет пропорционально шире/толще дуги, проходящей через 10 объектов. В нашем случае размер дуг одинаковый, так как каждый клеточный путь состоит из набора неповторяющихся генов. Наибольший размер узлов левой половины графика имеют гены MYC, СШВВР, Е1Н2, ЖT2D. Ген MYC представляет собой транскрипционный фактор, являющийся
ео cv
сч
4
ев
со cv
сч
4
NF1
KDR
ITPKB MPL
JAK3 NOTCH2 ATM KMT2C ARID1A KMT2D DEK
ж
PiBK-Akt-сигнальный путь / П ___ PI3K-Akt signaling pathwayш
Передача сигнала WNT / Signaling by WNT
Сигнальный путь МАРК / MAPK signaling pathway Передача сигнала NOTCH / '.-<:■ Signaling by NOTCH И
Клеточный цикл / Cell cycle
MAPK-каскад / MAPK cascade \
MYC
KMT2A EZH2
CREBBP BRCA2
и ■
<n:
■4Г
JAK-STAT-сигнальный путь /1 ^П.AK-STSLflgnaiing pathway I
МикроРНК в опухоли / MicroRNAs in cancer
Организация хроматина Chromatin organizatk
I
ion
Модификация гистонов / Histone modification
Ремоделирование хроматина Chromatin remodeling
а / а /
ing
-1од10(р-значение) / -log10(p-value)
Количество / Counts
• 5
ф 3
0,010 0,015 0,020 0,025 Gene.Ratio
Рис. 6. Диаграмма Sankey, демонстрирующая вовлеченность мутировавших генов в основные онкогенные пути. На правом графике размер точки определяется количеством генов в конкретном клеточном пути, цвет точки представляет собой диапазон значений -log^p-значение), рассчитанный в анализе обогащения набора генов (GSEA). Gene.Ratio — доля мутировавших генов из списка (n = 23) от общего числа генов, вовлеченных в онкогенный путь, согласно базе данных аннотаций
Fig. 6. Sankey diagram showing the involvement of mutated genes in major oncogenic pathways. In the right plot, the size of the point is determined by the number of genes in a particular cellular pathway, the color of the point represents the range of -log10(p-value) values calculated in the gene set enrichment analysis (GSEA). Gene.Ratio is the proportion of mutated genes from the list (n = 23) of the total number of genes involved in the oncogenic pathway, according to the annotation database
8
6
4
со cv
сч
4
CS
со cv
сч
4
протоонкогеном и регулирующим процессы прогрес-сирования клеточного цикла, апоптоза и клеточной трансформации. Изменения гена MYC характерны для большинства онкологических новообразований (около 70 % всех известных форм рака) [17, 18], а его повышенная экспрессия наблюдается при вовлечении в онкогенез большого количества сигнальных клеточных путей. Гены CREBBP, EZH2 и KMT2D являются ключевыми генами, вовлеченными в патогенез ФЛ и, как показано нами ранее, одними из наиболее часто мутирующих. Таким образом, мутации в генах MYC, CREBBP, EZH2 и KMT2D могут приводить к дисрегу-ляции в нескольких внутриклеточных процессах, опосредуя более сложные молекулярные изменения при ФЛ. Размер узлов, описывающих клеточные пути (прямоугольники правой половины графика), также пропорционален степени вовлеченности в патологический процесс и соответствует ранее представленным результатам (см. рис. 5).
Нами также проводился анализ обогащения белок-белковых взаимодействий с использованием следующих баз данных: STRING, BioGrid, OmniPath, InWeb_IM. Начальная сеть содержит подмножество белков, которые образуют физические взаимодействия по крайней мере с одним из членов в списке. Если сеть содержит от 3 до 500 белков, для идентификации связи между компонентами сети применяется алгоритм обнаружения молекулярных комплексов (MCODE) [19]. Итоговая сеть представлена на рис. 7. Можно заметить, что в функциональном плане продукты генов MYC, CREBBP и EZH2 имеют наибольшую степень взаимодействия с другими белками и, тем самым, при изменении их функции (усиление или снижение активности, потеря функции) отмечается более выраженный по своей интенсивности эффект.
В целях определения взаимосвязи между генетическими событиями нами была построена матрица парных корреляций 23 наиболее часто мутировавших генов, которые ранее исследовались в GSEA. К полученной матрице применялся иерархический кластерный анализ для идентификации кластеров ассоциированных генетических изменений. По результатам анализа было выделено 5 основных кластеров генетических мутаций, возникающих совместно, а также показано, мутации каких генов не могут сочетаться друг с другом (рис. 8).
Первый кластер (n = 2) составили гены ARID1A и CREBBP, относящиеся к группе генов, участвующих в организации хроматина. Ассоциации мутаций в генах 2-го и 3-го кластеров не имеют общей функциональной принадлежности и, вероятно, сочетание данных генетических событий носит случайный характер. Третий кластер (n = 12) в соответствии с результатами GSEA наиболее обогащен мутациями в генах, участвующих в гемопоэзе (n = 6; — log^-значение) = 7,01), общих онкологических процессах (n = 4; — ^^-значение) = 4,38) и ремоделировании хроматина (n = 3; — ^^^-зна-
Рис. 7. Радиальная сеть белок-белковых взаимодействий Fig. 7. Radial network of protein-protein interactions
чение) = 2,81). Примечательно, что 75 % 5-го кластера (п = 4) также составляют гены, участвующие в модификации гистонов: EZH2, КМТ2А, KMT2D - метилирование гистонов (—^10(р-значение) = 7,77); и только ген KDR, кодирующий сосудистый эндотелиальный фактор роста, участвует в процессах трансдукции сигналов ростовых факторов (совместно с генами BCR, СПХ1, МУС), МАРК-каскаде и регуляции клеточной пролиферации. Закономерно, что гены 4-го и 5-го кластеров имеет общую функциональную принадлежность, что говорит об относительно высокой степени корреляции между ними.
И наконец, обладая данным о генетических мутациях конкретного больного, с помощью GSEA можно проводить дифференциальную диагностику, сопоставляя мутационный профиль пациента с известным генетическим ландшафтом заболеваний. Обогащение списка генов проводилось с использованием базы данных DisGeNET [20], содержащей более 1 млн ассоциаций генов и заболеваний (GDA) (табл. 3).
Так, например, у первого пациента из исследуемой выборки (FL005) были выявлены мутации в генах BRAF, CREBBP, DEK, EZH2, ¥АТ1, ЮН1,1АК3, KDR, КМТ2А, КМТ2С, KMT2D, ЖТСН2, всего 12 мутаций. По результатам GSEA наличие ассоциаций мутаций в указанных генах наиболее характерно для диффузной В-клеточной крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) (п = 9; — ^10(р-значение) = 14,00), в то время как для ФЛ такой мутационный профиль менее характерен, но, тем не менее, высоковероятен (п = 7; — ^10(р-зна-чение) = 9,80). Таким образом, NGS (предпочтительнее полногеномное, а не таргетное) с последующим GSEA может помочь в вопросе дифференциальной диагностики и принятия решения о лечении.
-1,0
1,0
Дендрограмма_разрез / Dendrogram_cut j_
П
s cq Э S
cc cc
О
1
^F^b I rfnD
^ N 5
3§ §E
О cc
cS^Sg Ь oQSi? ?
a
l—l— О >< —
г2оаиг
я-1 ^ & р-
ifí
D
З^ОС
N§9
1 -й кластер / 1st cluster
2-й кластер / 2nd cluster
3-й кластер / 3rd cluster
4-й кластер / 4th cluster
5-й кластер / 5th cluster
ш ' ■
■I
J- ■ ■ ü
н ■
Ï
-I
[Í
■
■
■
со cv
ev
4
es
ARID1A CREBBP
BCR MYC IKZF3
GNAS RYR1
DEK
IDH1
JAK3
ATM
FAT1
NOTCH2
KMT2C
BRCA2
CUX1
NF1
MPL
ITPKB
EZH2 KMT2D KDR KMT2A
Дендрограмма_разрез / Dendrogram_cut
I
I
CO
cv
cv
4
I
Рис. 8. Матрица парных корреляций генетических мутаций с иерархическим кластерным анализом. Красный цвет обозначает наличие ассоциированных мутаций, синий — взаимоисключающие мутации; нумерация кластеров по порядку (слева направо)
Fig. 8. Matrix ofpairwise correlations ofgenetic mutations with hierarchical cluster analysis. Red indicates the presence of associated mutations, blue indicates mutually exclusive mutations; numbering of clusters in order (from left to right)
0
Обсуждение
Наше исследование не выявило каких-либо аномалий в мутационном профиле и частоте мутаций у пациентов с ФЛ согласно ранее представленным данным. Недавно был опубликован отчет HMRN (the Haematological Malignancy Research Network, Сеть исследований гематологических злокачественных новообразований Соединенного Королевства) с включением 852 пациентов с ФЛ в период с 2004 по 2012 г., 548 (64,3 %) из которых было выполнено таргетное секвенирование с использованием панели, содержащей 293 гена. Наибольшая частота мутаций отмечалась в генах KMT2D, CREBBP, TNFRSF14, EZH2 (Y646X), STAT6. Авторы также продемонстрировали, что пациенты с ФЛ могут быть разделены на подгруппы в соответствии с выявленными мутациями подобно ДВККЛ [21]. Мы показали, что мутации в гене ARID1A сопряжены с худшим прогнозом в отношении ВБП и БСВ по сравнению с группой «дикого» типа, а ОР составил 4,630 (95 % ДИ 1,205-17,793; р = 0,026) и 3,940 (95 % ДИ 1,045-14,856; р = 0,043) соответственно. Однако в исследовании по m7-FLIPI с включением
154 пациентов с ФЛ, которым было выполнено NGS с панелью, содержащей 74 гена, ОР мутации гена АЛШ1А составил 0,40 (95 % ДИ 0,16-0,996;р = 0,049) [22]. Подобное расхождение в результатах, вероятно, может быть обусловлено малым размером выборки (п = 26). С другой стороны, известно, что ген ARID1A действует как супрессор опухоли, регулирует транскрипцию генов, участвует в реакции на повреждение ДНК и оказывает влияние на иммунное опухолевое микроокружение. Мутации с потерей функции гена АВ.Ш1А ассоциированы с онкогенезом, включая процессы пролиферации, инвазивности и метастазирова-ния [23]. В другом исследовании с включением 113 пациентов с ФЛ авторы показали, что наличие мутации в гене ARID1A не влияет на ВБП, в то время как мутации гена CREBBP достоверно ухудшают прогноз согласно анализу 2-летней ВБП (ОР 2,68; р = 0,0344) [1]. В нашем исследовании не выявлено межгрупповых статистически значимых различий в зависимости от мутационного статуса гена CREBBP. Таким образом, высокая частота мутаций в генах, участвующих в модификации гистонов (в том числе EZH2, КМТ2С, ЕР300
Таблица 3. Результаты анализа обогащения согласно данным базы DisGeNET Table 3. Results of enrichment analysis according to DisGeNET
код code Заболевание Disease n % log^-значение) log10(p-value) log^q-значение) log10(q-value)
C0278876 Медуллобластома Medulloblastoma 14 61 —17,00 —15,00
C0278510 Медуллобластома у детей Pediatric medulloblastoma 14 61 —17,00 —12,00
C0023470 Острый миелоидный лейкоз Acute myeloid leukemia 11 48 —15,00 —11,00
C1961099 Т-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma 12 52 —14,00 —10,00
C0024301 Фолликулярная лимфома Follicular lymphoma 11 48 —14,00 —10,00
C0079772 Т-клеточная лимфома T-cell lymphoma 11 48 —14,00 —10,00
C1332201 Диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома у взрослых Adults diffuse large B-cell lymphoma 11 48 —14,00 —9,90
CO
cv
cv
ев
со cv
cv
Примечание. Код — кодирование заболевания согласно унифицированному языку медицинских систем (UMLS); n — количество генов из изучаемого списка, ассоциированных с заболеванием; % — доля генов, связанных с заболеванием, от общего количества генов из изучаемого списка.
Note. Code — disease coding according to the Unified Language of Medical Systems (UMLS); n — number of genes from the studied list associated with the disease; % — the proportion of genes associated with the disease from the total number of genes from the studied list.
и др.) при ФЛ является существенным доказательством того, что эпигенетическая дисрегуляция в В-клетках герминальных центров представляет собой ключевой аспект патогенеза ФЛ, однако прогностическая роль некоторых генов требует дальнейших уточнений.
С внедрением NGS в клиническую практику появилась потребность в поиске унифицированного показателя, отражающего прогностическую совокупность всех мутаций, возникающих в опухоли. Одним из таких параметров является ТМВ. Так, в 2015 г. впервые у пациентов с немелкоклеточным раком легкого было продемонстрировано, что у больных с высокой мутационной нагрузкой наблюдается лучший ответ на терапию ингибиторами иммунных контрольных точек по сравнению с пациентами с низкой ТМВ [24]. Позже было установлено, что экспрессия неоантигенов положительно коррелирует с ТМВ, объясняя лучшую эффективность ингибиторов иммунных контрольных точек у пациентов с высокой ТМВ [25]. В настоящий момент не определен алгоритм оценки ТМВ. При различных видах опухолей применяются разные методы: от расчета количества всех выявленных мутаций до определения удельного веса соматических мутаций (отношение количества мутаций к длине кодирующей последовательности). К настоящему времени опубликовано только 1 исследование с включением 300 пациентов с различными неходжкинскими лимфомами, в том числе 29 пациентов с ФЛ [26], у которых была оценена ТМВ с использованием панели из 405 генов,
высокоспецифичных для различных типов неходж-кинских лимфом. В исследовании рассчитывалось общее количество однонуклеотидных вариантов и (инсерции и делеции), медиана которых у пациентов с ФЛ составила 18 (диапазон 8—35). Авторами было показано, что ФЛ цитологических типов 3А—3В характеризуется более высокой ТМВ (р = 0,013) по сравнению с ФЛ цитологических типов 1—2 и по данному показателю соответствует таковой при ДВККЛ (р = 0,973).
В нашем исследовании оценка ТМВ проводилась в расчете на длину кодирующей последовательности исследуемых генов. Мы использовали панель из 118 генов, мутации которых высокоспецифичны для лимфопролиферативных новообразований. Длина всех экзонов исследуемых генов равнялась 602 917 пар оснований, или 0,603 МЬ. Медиана ТМВ составила 5,0 му-тации/МЬ. С помощью ROC-анализа мы определяли классификационный порог для ТМВ, распределяющий пациентов на 2 группы: с низкой (п = 14) и высокой (п = 12) ТМВ. Нами было показано, что пациенты с высокой ТМВ характеризуются статистически значимо более худшим прогнозом в соответствии с результатами анализа 2-летней БСВ (р = 0,037). Также отмечалась аналогичная тенденция в анализе 2-летней ОВ и ВБП, однако различия статистически незначимы (р = 0,098 и р = 0,071 соответственно). Таким образом, нами был определен алгоритм расчета ТМВ у пациентов с ФЛ и доказана ее прогностическая значимость. В отличие от ранее опубликованных исследований [27, 28],
в которых порог количества мутаций определялся в соответствии со средним значением, медианой или с риском, в нашем исследовании использовался ROC-анализ, который является общепризнанным инструментом бинарной классификации, что исключает субъективизм исследователя (так как нет оснований полагать, что средняя или медиана реально могут отражать пороговое значение ТМВ). И в то же время наше исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, это малый размер выборки (n = 26), во-вторых — использование таргетной панели, содержащей всего 118 генов вместо полногеномного секвенирова-ния. Применение таргетных панелей может не отражать реальную мутационную нагрузку, так как в анализ включаются гены, мутации в которых будут характерны для конкретной нозологии. Также в настоящее время отсутствует консенсус в отношении алгоритма расчета ТМВ при таргетном секвенировании: различные наборы генов и методы определения порога мутаций. Однако, несмотря на указанные ограничения, нами, а также другими исследователями однозначно показано, что высокая TMB является значимым прогностическим фактором, в том числе при ФЛ.
Первое исследование, в котором был описан метод GSEA на основании данных полноэкзомного секвенирования, было опубликовано в 2005 г. [29]. С тех пор технология секвенирования стала значительно эффективнее и доступнее, что инициировало работы по поиску наиболее вовлеченных клеточных путей в патогенез различных онкологических заболеваний, в том числе при лимфомах. Несмотря на небольшой объем выборки (n = 26), на основании данных о мутациях 23 генов нами было определено более 200 различных клеточных процессов (базы данных Gene Ontology (GO) Biological Processes, KEGG Pathway, Reactome Gene Sets, Canonical Pathways и WikiPathways) с вовлечением 3 и более генов, что имело статистическую значимость с учетом поправки на множественные сравнения (поправка Бенджамини—Хохберга). Мы
показали, что у пациентов с ФЛ наиболее часто наблюдаются аберрации в пути регуляции клеточной активации и экспрессии генов, а также в общих сигнальных путях в опухоли. Мутации в генах MYC, СШВВР, Е1Н2 и KMT2D при ФЛ имеют наибольшую патогенетическую значимость, так как указанные аберрации могут приводить к нарушению передачи сигнала в большинстве внутриклеточных сигнальных путей. Таким образом, изучение данных аспектов расширяет наши представления о патогенетических механизмах, лежащих в основе биологии лимфом, а поиск новых молекулярных мишеней может привести к разработке более эффективных таргетных методов лечения.
Заключение
Исследования последнего десятилетия пролили свет на сложный патогенез ФЛ, в частности на концептуальную взаимосвязь между генетикой, эпигенетикой и микроокружением как критическую движущую силу этого заболевания. Понимание (эпи)генетического ландшафта открывает возможности для поиска новых способов таргетного и персонифицированного лечения. Кроме этого, ФЛ не является биологически статичным заболеванием, и наши будущие подходы к определению прогноза и лечения должны быть адаптированы в соответствии с биологической эволюцией опухоли.
Результаты, представленные в настоящей работе, демонстрируют, что ТМВ как интегральный показатель, отражающий мутационный профиль опухоли, является статистически значимым прогностическим фактором у пациентов с ФЛ. Более того, мы показали, что мутации в генах МТС, СШВВР, Е1Н2, ЖT2D вносят значительный вклад в патофизиологию ФЛ, приводя к дисрегуляции в нескольких внутриклеточных процессах и опосредуя более сложные молекулярные изменения. Наиболее обогащенными внутриклеточными путями при ФЛ являются пути ремоделирования хроматина, регуляции клеточной активации и модификации гистонов.
СО
cv
сч
4
CS
со cv
сч
4
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Krysiak K., Gomez F., White B.S. et al. Recurrent somatic mutations affecting B-cell receptor signaling pathway genes in follicular lymphoma. Blood 2017;129(4):473-83. DOI: 10.1182/blood-2016-07-729954
2. Taylor J., Xiao W., Abdel-Wahab O. Diagnosis and classification of hematologic malignancies on the basis of genetics. Blood 2017;130(4):410-23. DOI: 10.1182/blood-2017-02-734541
3. Balasubramanian S., Hodkinson B., Schuster S.J. et al. Identification of a genetic signature enriching for response to ibrutinib in relapsed/refractory follicular lymphoma
in the DAWN phase 2 trial. Cancer Med 2022;11(1):61—73. DOI: 10.1002/cam4.4422
4. McGowan-Jordan J., Hastings R.J., Moore S. ISCN 2020 - An International System for Human Cytogenomic Nomenclature (2020). Basel: Karger, 2020. Pp. 170. DOI: 10.1159/isbn.978-3-318-06867-2
5. Li M.M., Datto M., Duncavage E.J. et al. Standards and guidelines for the interpretation and reporting of sequence variants in cancer.
J Mol Diagn 2017;19(1):4—23. DOI: 10.1016/j.jmoldx.2016.10.002
6. Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med 2015;17(5):405-24. DOI: 10.1038/gim.2015.30
7. Рыжкова О.П., Кардымон О.Л., Прохорчук Е.Б. и др. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). Медицинская генетика 2019;18(2):3-23. DOI: 10.25557/2073-7998.2019.02.3-23 Ryzhkova O.P., Kardymon O.L., Prokhorchuk E.B. et al. Guide
to the interpretation of human DNA sequence data obtained
со cv
сч
4
CS
со cv
сч
4
by massively parallel sequencing (MPS) methods (edition 2018, version 2). Meditsinskaya genetika = Medical Genetics 2019;18(2): 3-23. (In Russ.). DOI: 10.25557/2073-7998.2019.02.3-23
8. Zhou Y., Zhou B., Pache L. et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nat Commun 2019;10(1):1523. DOI: 10.1038/s41467-019-09234-6
9. Pasqualucci L., Khiabanian H., Fangazio M. et al. Genetics
of follicular lymphoma transformation. Cell Rep 2014;6(1):130-40. DOI: 10.1016/j.celrep.2013.12.027
10. Xu S., Tang C. The Role of ARID1A in tumors: tumor initiation or tumor suppression? Front Oncol 2021;11:745187.
DOI: 10.3389/fonc.2021.745187
11. Pasqualucci L., Dominguez-Sola D., Chiarenza A. et al. Inactivating mutations of acetyltransferase genes in B-cell lymphoma. Nature 2011;471(7337):189-95. DOI: 10.1038/nature09730
12. Ortega-Molina A., Boss I., Canela A. et al. The histone lysine methyltransferase KMT2D sustains a gene expression program that represses B cell lymphoma development. Nat Med 2015;21(10):1199-208. DOI: 10.1038/nm.3943
13. Zhang J., Dominguez-Sola D., Hussein S. et al. Disruption of KMT2D perturbs germinal center B cell development and promotes lymphomagenesis. Nat Med 2015;21(10):1190-8. DOI: 10.1038/nm.3940
14. Bodor C., Grossmann V., Popov N. et al. EZH2 mutations
are frequent and represent an early event in follicular lymphoma. Blood 2013;122(18):3165-8. DOI: 10.1182/blood-2013-04-496893
15. Zar J.H. Biostatistical analysis. 4th edn. NJ Prentice Hall, 1999. Pp. 523.
16. Hochberg Y., Benjamini Y. More powerful procedures for multiple significance testing. Stat Med 1990;9(7):811-8.
DOI: 10.1002/sim.4780090710
17. Cotterman R., Jin V.X., Krig S.R. et al. N-Myc regulates a widespread euchromatic program in the human genome partially independent of its role as a classical transcription factor. Cancer Res 2008;68(23):9654-62. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-08-1961
18. Posternak V., Colea M.D. Strategically targeting MYC in cancer. F1000Res 2016;5:408. DOI: 10.12688/f1000research.7879.1
19. Bader G.D., Hogue C.W.V. An automated method for finding molecular complexes in large protein interaction networks. BMC Bioinformatics 2003;4:2. DOI: 10.1186/1471-2105-4-2
20. Pinero J., Bravo A., Queralt-Rosinach N. et al. DisGeNET: a comprehensive platform integrating information on human
disease-associated genes and variants. Nucleic Acids Res 2017;45(D1):D833-9. DOI: 10.1093/nar/gkw943
21. Crouch S., Painter D., Barrans S.L. et al. Molecular subclusters of follicular lymphoma: a report from the United Kingdom's Haematological Malignancy Research Network.
Blood Adv 2022;6(21):5716-31. DOI: 10.1182/bloodadvances.2021005284
22. Pastore A., Jurinovic V., Kridel R. et al. Integration of gene mutations in risk prognostication for patients receiving first-line immunochemotherapy for follicular lymphoma: a retrospective analysis of a prospective clinical trial and validation in a population-based registry. Lancet Oncol 2015;16(9):1U1-22.
DOI: 10.1016/S1470-2045(15)00169-2
23. Zhang X., Zhang Y., Zhao J. et al. ARID1A mutations in cancer development: mechanism and therapy. Carcinogenesis 2023;44(3):197-208. DOI: 10.1093/carcin/bgad011
24. Rizvi N.A., Hellmann M.D., Snyder A. et al. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science 2015;348(6230):124-8.DOI: 10.1126/science. aaa1348
25. Goodman A.M., Kato S., Bazhenova L. et al. Tumor mutational burden as an independent predictor of response to immunotherapy in diverse cancers. Mol Cancer Ther 2017;16(11):2598-608. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-17-0386
26. Cho J., Yoon S.E., Kim S.J. et al. Comparison of tumor mutation burden of 300 various non-Hodgkin lymphomas using panel based massively parallel sequencing. BMC Cancer 2021;21:972.
DOI: 10.1186/s12885-021-08695-7
27. De Padua Covas Lage L.A., Culler H.F., Barreto G.C. et al. Tumor mutation burden involving epigenetic regulatory genes and the RhoA GTPase predicts overall survival in nodal mature T-cell lymphomas. Clin Epigenetics 2022;14:180.
DOI: 10.1186/s13148-022-01395-4
28. Devarakonda S., Rotolo F., Tsao M.S. et al. Tumor mutation burden as a biomarker in resected non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2018;36(30):2995-3006. DOI: 10.1200/JCO.2018.78.1963
29. Subramanian A., Tamayo P., Mootha V.K. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(43):15545-50. DOI: 10.1073/pnas.0506580102
Вклад авторов
Е.О. Куневич: разработка концепции и дизайна, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка статьи;
И.С. Мартынкевич: разработка концепции и дизайна, подготовка статьи, окончательное одобрение статьи;
М.А. Михалева: предоставление материалов исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка статьи;
А.Н. Богданов: подготовка статьи, окончательное одобрение статьи;
Е.В. Мотыко: предоставление материалов исследования, подготовка статьи;
А.Ю. Кувшинов, С.В. Сидоркевич: подготовка статьи, окончательное одобрение статьи, административная поддержка;
С.В. Волошин: разработка концепции и дизайна, подготовка статьи, окончательное одобрение статьи, административная поддержка.
Authors' contributions
E.O. Kunevich: concept and design development, data collection, analysis and interpretation, article writing;
I.S. Martynkevich: concept and design development, article writing, final article approval;
M.A. Mikhaleva: provision of research materials, data collection, analysis and interpretation, article writing;
A.N. Bogdanov: article writing, final article approval;
E.V. Motyko: provision of research materials, article writing;
A.Yu. Kuvshinov, S.V. Sidorkevich: article writing, final article approval, administrative support;
S.V. Voloshin: concept and design development, article writing, final article approval, administrative support.
ORcID авторов / ORcID of authors
Е.О. Куневич / E.O. Kunevich: https://orcid.org/0000-0002-1706-6642 И.С. Мартынкевич / I.S. Martynkevich: https://orcid.org/0000-0001-5958-0490 М.А. Михалева / M.A. Mikhaleva: https://orcid.org/0000-0002-2135-2051 А.Н. Богданов / A.N. Bogdanov: https://orcid.org/0000-0003-1964-3690 Е.В. Мотыко / E.V. Motyko: https://orcid.org/0000-0002-6052-6472 А.Ю. Кувшинов / A.Yu. Kuvshinov: https://orcid.org/0000-0002-0381-9041 С.В. Сидоркевич / S.V. Sidorkevich: https://orcid.org/0000-0001-9931-9406 С.В. Волошин / S.V. Voloshin: https://orcid.org/0000-0003-1784-0375
конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. _j
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. ®
CO
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. CV
CV
Funding. The study was performed without external funding. Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики
Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства».
Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. ^
compliance with patient rights and principles of bioethics i_
The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, Federal Medical ^ and Biological Agency. ®
All patients gave written informed consent to participate in the study. s
со cv
cv
4
Статья поступила: 13.09.2023. Принята к публикации: 07.11.2023. Article submitted: 13.09.2023. Accepted for publication: 07.11.2023.
