CC BY
72
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 616:619.995.121:1-07
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ АЛЬВЕОКОККОЗА В КИРОВСКОЙ ОБЛАСТИ
С.П. АШИХМИН1 кандидат медицинских наук
О.Б. ЖДАНОВА2 доктор биологических наук О.В. МАСЛЕННИКОВА2, О.А. ПЕСТРИКОВА2 кандидаты биологических наук Л.Р. МУТОШВИЛИ2
аспирант А.К. МАРТУСЕВИЧ3 П.Г. РАСПУТИН1 доктор медицинских наук Е.С. КЛЮКИНА1 аспирант
1 Кировская государственная медицинская академия, e-mail: nics-vsaa@mail. ru 2Вятская государственная сельскохозяйственная академия 3 Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и
ортопедии
Кристаллографические методы являются индикатором состава и физико-химических свойств жидкой биологической среды, способным отображать метаболический статус организма животного и обладающим большим объемом информации о его состоянии, и могут использоваться для диагностики альвеококкоза у крыс и человека.
Ключевые слова: альвеококкоз, животные, человек, диагностика, кристаллография.
Echinococcus granulosus (Batsch, 1786) и E. multilocularis (Leukart, 1863), ежегодно регистрирующиеся у человека и животных, - наиболее тяжело протекающие гельминтозы. Альвеококкоз широко распространен среди животных Кировской области (13,3 % диких лисиц, 12,5 % волков заражены имаги-нальной стадией гельминта). За 30 лет в зональном центре удельный вес больных с альвеококкозом составил 28,4 % среди больных с очаговыми заболеваниями печени, четверть из них - жители Кировской области. Хотя средний возраст больных составил 42 года, многие из них были неоперабельными. Во многом это обусловлено тем, что иммунологическая диагностика тканевых гельминтозов у человека в Кировской области и близлежащих регионах не имеет широкого применения, особенно среди сельского населения, поэтому можно предположить, что число заболевших несколько выше. Также необходимо отметить, что диагностика альвеококкоза представляет определенные трудности не только для клиницистов, но и для морфологов и хирургов. Сложная диагностика альвеококкоза и поздняя обращаемость больных обусловливает тот факт, что в лечебные учреждения пациенты поступа-
ют на поздних стадиях, с обширными поражениями печени, когда хирургическое вмешательство по поводу альвеококкоза печени, к сожалению, далеко не всегда гарантирует излечение. Обширная резекция печени (ОРП) (с удалением 50-80 % объема органа) - единственный метод, позволяющий добиться радикального излечения или заметного продления жизни у больных с альве-ококкозом. Однако это вмешательство продолжает оставаться операцией высокого риска.
Учитывая проблему возникновения послеоперационных рецидивов аль-веококкоза, необходимо максимально снизить риск возникновения иммунной недостаточности, а также иметь простые и надежные методы послеоперационного контроля.
В настоящее время все больший интерес биологов и медиков привлекают кристаллографические методы исследования биологических субстратов, акцент в настоящее время ставится на изучение кристаллообразования сред человека, тогда как животные исследуются значительно реже. Необходимо углубленное рассмотрение информационной емкости их биоматериала.
В связи с этим целью нашей работы было сравнительное изучение кристал-лоскопической картины биологических субстратов у человека и животных.
Материалы и методы
Были оценены морфологические и физико-химические свойства мочи и разведенного копрофильтрата 135 практически здоровых людей-добровольцев и здоровых 76 лабораторных животных. Изучено 20 дегидратированных образцов мочи крыс, экспериментально зараженных альвеокок-ками (предоставлены ведущим научным сотрудником ИМПи ТМ Ф.П. Коваленко), и фаций слюны и мочи 10 пациентов, страдающих данным заболеванием, полученные из регионального гепатологического центра г. Кирова. В качестве комплекса кристаллографических методов были использованы классическая кристаллоскопия (непосредственная дегидратация биосред) и дифференциальная тезиграфия (оценка влияния биожидкостей на кристаллогенез различных по составу базисных веществ), выполняемые на одном стекле [8, 10].
Интерпретацию кристаллоскопических фаций проводили с помощью идентификационной таблицы кристаллических и аморфных структур, а также дополнительных критериев [5, 10]. Результат тезиграфического теста оценивали с привлечением системы основных и дополнительных параметров [3, 5, 6, 10].
Полученные данные обрабатывали статистически при помощи программы Microsoft Excel 2003, программных пакетов SPSS 11.0 и Primer of biostatis-tics 4.03. Достоверность определяли по t-критерию Стъюдента (для сравнения «паттернов» крыс) и U-критерию Манна-Уитни (относительно фаций биологических жидкостей людей).
Результаты и обсуждение
Диагностика альвеококкоза представляет определенные трудности для морфологов и клиницистов, в результате чего происходят ошибки в постановке диагноза. Этому способствуют объективные и субъективные причины:
Объективные причины
1. Недостаточная разрешающая способность имеющихся в наличии методов обследования больных и сложность дифференциальной диагностики;
2. Недостаточная оснащенность медицинских учереждений диагностической аппаратурой, особенно в сельской местности, где возможность заражения тканевыми гельминтозами проявляется в большей степени.
Субъективные пр ичины
1. Гипердиагностика аллергических реакций;
2. Неполное обследование больного, недостаточное использование диагностических методов, в том числе гистологических;
3. Постановка диагноза на основании результатов одного малоинформативного метода исследования;
4. Отсутствие или недостаточно полная история болезни;
5. Постановка диагноза только на основании клинической картины;
6. Чрезмерная самоуверенность врача, переоценка собственных возможностей и возможностей лечебного учреждения;
7. Недостаточная специализация, например, при диагностике паразитарных болезней печени;
8. При вскрытии умерших в сельской местности людей также допускаются ошибки в постановке диагноза.
Из проведенного анализа следует, что причины клинических и морфологических ошибок чаще носят субъективный характер. С целью нивелирования субъективных факторов вполне возможно по аналогии с другими областями медицины применить многоступенчатую диагностику. Используемые при этом методики, как правило, многовариантны и включают не менее 2 этапов: первичную диагностику и уточняющую.
На первом этапе используются качественные, либо качественно-количественные тесты, получившие название «просеивающие», которые позволяют из большого числа пациентов отобрать подозрительных на наличие альвеококкоза. На втором этапе эти больные подвергаются более углубленному и точному обследованию, позволяющему либо отвергнуть предполагаемый диагноз альвеококкоза, либо его утвердить [1, 2, 4, 7, 11].
Нами предпринята попытка разработать экспресс-тест на основе неинва-зивной методики, основанной на кристаллографии. Исследование образцов высушенных биологических субстратов продемонстрировало существенные различия в фациях человека и животных. Так, если одиночно-кристаллический компонент картины мочи у практически здоровых людей представлен сравнительно небольшим количеством структур в незначительном количестве, состав мочи у крыс был несколько беднее.
Сформированный кристаллоскопический «паттерн» высушенных образцов мочи здоровой крысы оказался достаточно своеобразным, качественно и количественно отличающимся от морфологии дегидратированной биожидкости человека(табл. 1).
При изучении микропрепаратов биосубстрата крыс, зараженных альвео-кокками, обнаружено, что они имеют как объединяющие здоровых и больных животных черты, так и дифференцирующие их характеристики. К параметрам, по которым возможна идентификация образца биосреды (микропрепарата мочи грызунов), относятся преобладание в кристаллической составляющей одиночных прямоугольников, суммарно занимающих до трети площади поля зрения; отсутствие фигур типа «мох», «лук», «комета», характерных для морфологии дегидратированной мочи человека, а также размер аморфных тел. По нашему мнению, вышеуказанные критерии должны расцениваться как специфичные для фаций мочи крыс.
Установлено выраженное повышение «ассортимента» и количества кристаллических и аморфных образований (кристаллизуемости, что служит, с наших позиций, основным количественным показателем кристаллогенеза биологической жидкости) высушенной оцениваемой биожидкости крыс, зараженных альвеококками. Этот факт может быть объяснен существенным ростом ренального выделения минеральных веществ у больных животных. В образцах мочи исследуемых больных крыс нами обнаружены все известные на данный момент виды одиночных кристаллов, причем в значительном количестве. Дендритный компонент также включал различные поликристаллические морфотипы, наиболее постоянными из которых были линейчатые кристаллы, пластинчатые прямоугольники и крупные по размеру фигуры типа «хвощ», не встречаемые в фациях мочи людей. Эти особенности могут
быть связаны с присутствием эхинококка в организме животного. Аморфная картина имела лишь количественные отличия в сторону повышения по сравнению со здоровыми крысами.
1. Результаты исследования свободного кристаллогенеза смешанной слюны и _мочи у здоровых и больных испытуемых_
Параметр Моча Слюна
Крысы Люди Люди
1 2 1 2 1 2
Одиночные кристаллы
Прямоугольники да да 1 3 4 2
Призмы 0 1 0-1 1 2 0
Пирамиды 1 2-3 0 2 1 1
Октаэдры 0 до 10 2 0 0 0
Дендритные структуры
Линейчатые 2 4 0-1 2 1 0
Прямоугольники 3 2 0-1 2 0-1 3
«Мох», «лук», «комета» 0 0 2-3 0 2-3 10
«Кресты» 2 0-1 0 0 0-1 2
«Хвощ» 0 1-2 0 0 0 0
«Розетки» 0 0 0 0 0 0
Аморфные образования
Размер мелкие мелкие крупные мелкие средние средние
Количество среднее много мало среднее среднее много
Тип взаимодействия оттеснение оттеснение оттеснение оттеснение налипание налипание
Дополнительные критерии
Равномерность плотности 4,1±0,5 2,3±0,3* 4,3±0,4 1,5±0,1* 3,8±0,4 2,1±0,2*
Ячеистость (I) 1,3±0,3 2,4±0,3* 1,2±0,3 3,4±0,4* 0,8±0,3 2,6±0,4*
Степень деструкции фации 0,2±0,4 1,7±0,4* 0,4±0,3 2,0±0,2* 0,5±0,3 1,9±0,2*
Выраженность краевой зоны (К,) 0,4±0,1 0,3±0,2 0,3±0,4 1,8±0,2* 2,4±0,5 3,7±0,4*
Примечание. 1 - здоровые испытуемые, 2 - больные или зараженные альвеокок-ками; * - достоверность различий между здоровыми и больными (зараженными) испытуемыми Р < 0,05.
При альвеококкозе у человека фациях мочи обнаружено появление фигур типа «пирамида», сопровождающееся исчезновением «октаэдров». В дендритной картине наблюдали тенденцию к уменьшению размеров структур, в аморфной - дробление элементов (увеличение количества при меньших габаритах).
В образцах слюны пациентов по сравнению с практически здоровыми лицами установлено обеднение одиночно-кристаллического компонента за счет «призм» и «октаэдров», укрупнение дендритов при увеличении доли аморфных образований.
При анализе дополнительных критериев обнаружено достоверное снижение равномерности распределения элементов по текстуре фации у больных
крыс и людей по сравнению со здоровыми (Р < 0,05), сопровождаемое выраженным ростом степени деструкции фации (Р < 0,05), что указывает на хао-тизацию результата свободного кристаллогенеза. В образцах мочи и слюны пациентов отмечали повышение содержания белковой составляющей (по критерию Кз).
В целях получения интегральных представлений о физико-химических характеристиках исследуемой биосреды нами было введено понятие инициа-торного потенциала биосубстрата, определяемое как его способность влиять на кристаллогенез различных базисных веществ (инициируемого ряда). Инициаторный потенциал практически реализуется в форме инициаторного профиля, четко ассоциированного с определенным функциональным статусом (физиологическим или патологическим) организма человека или животного и представляющего совокупность значений и тенденций (в частности, по шкале «инициация - ингибирование»).
Обнаруженное соотношение коэффициентов Q и Р указывает на то, что трансформация свойств биологических жидкостей, а, следовательно, и их инициаторного потенциала, вследствие наличия альвеококкоза демонстрирует сходные тенденции (установленные по параметру Q) при существенно различающемся компонентом составе (косвенно оцениваемом по показателю Р). Данный факт свидетельствует об общности метаболических перестроек, происходящих в жидкой ткани организма больных с рассматриваемой патологией, несмотря на ее структурную неоднородность. Это подтверждается практически полным соответствием между инициаторным потенциалом смешанной слюны и мочи пациентов в отношении всего ряда базисных веществ (по коэффициенту Q). Коэффициент Р, указывающий на дисперсию молекулярных масс компонентов анализируемого биосубстрата, существенно варьирует по абсолютному большинству кристаллообразователей, что, в частности, ассоциировано с дифференцированностью биосред по балансу между органическими и минеральными составляющими. Это предопределило установление контрольного уровня Р, равного 2, при котором имеет место баланс между ними. При меньшем значении Р преобладает минеральный компонент, при большем - органический.
Заключение
Сложная диагностика альвеококкоза и поздняя обращаемость больных обусловливают тот факт, что в лечебные учреждения пациенты поступают на поздних стадиях, с обширными поражениями печени, в связи с чем целесообразно разработать и внедрить скрининговые программы, для отбора подозрительных на альвеококкоз пациентов. Простым и доступным «просеивающим» методом может быть кристаллоскопическая диагностика. Это обусловлено тем, что:
• присутствие в организме человека и крысы альвеококка способствует формированию специфических изменений свободного и инициированного кристаллогенеза слюны и мочи, а, следовательно, сдвигу физических свойств и химического состава последних;
• рассматриваемые биосреды человека при альвеококкозе (смешанная слюна, моча) обладают вариабельным модулирующим эффектом на изученные базисные вещества (инициаторный профиль);
• для фаций мочи крыс характерны особые, отличающиеся от свойственных человеку, кристаллоскопические и тезиграфические картины мочи, но их оценка возможна по унифицированной схеме;
• кристаллографические методы являются индикатором состава и физико-химических свойств жидкой биологической среды, способным отображать метаболический статус организма животного и обладающим большим объемом информации о его состоянии, и могут использоваться для диагностики альвеококкоза у крыс и человека.
Литература
1. Баллад Н.Е., Гаврилова Е.М., Зорихина В.И. Эффективность применения иммуноферментного метода в диагностике эхинококкоза и альвеококко-за в зависимости от степени очистки антигена // Мед. паразитол. и паразит. бол. - 1979. - № 2. - C. 70-76.
2. Белозеров С.Н. Иммунологическая диагностика гельминтозов: Авто-реф. дис. ... д-ра вет. наук. - М., 1990. - 44 с.
3. Громова И.П. Кристаллоскопический способ изучения сыворотки крови в токсиколого-гигиеническом эксперименте методом «открытая капля» // Гигиена и санитария. - 2005. - № 2. - С. 66-69.
4. Каликштейн Д.Б., Мороз Л.А., Квитко Н.Н. и др. Кристаллографическое исследование биологических субстратов // Клин. мед. - 1990. - № 4. - С. 28-31.
5. Камакин Н.Ф., Мартусевич А.К. Современные подходы к кристалло-скопической идентификации состава биологических жидкостей // Экология человека. - 2003. - № 5. - С. 23-25.
6. Камакин Н.Ф., Мартусевич А.К. Характеристика тезиокристаллоско-пического портрета биологических жидкостей организма человека в норме и при патологии // Вестн. новых мед. технол. - 2003. - Т. X, № 4. - С. 57-59.
7. Обухов А.А. Использование новых методов диагностики и прогнозирования в ветеринарной медицине // Сб. науч. тр. 2-й Всерос. науч.-практ. конф. «Морфология биологических жидкостей в диагностике и контроле эффективности лечения». - М., 2001. - С. 79-80.
8. Плаксина Г.В., Римарчук Г.В., Бутенко С.В. и др. Клиническое значение кристаллографического и кристаллоскопического метода исследования мочи // Клин. лаб. диагностика. - 1999. - № 10. - С. 34.
9. Рапис Е.Г. Микрокристаллооптический способ исследования стекловидного тела человека и животных // Здравоохранение Туркменистана. -1978. - № 9. - С. 17-20.
10. Камакин Н.Ф., Мартусевич А.К. Тезиокристаллоскопическое исследование биологических субстратов: Методические рекомендации. - Киров, 2005. - 34 с.
11. Capron A., Dugimont J.C., Fruit S. Application of immunoenzyme methods in diagnosis of human parasitic diseases // Ann. N. - Y. Acad. Sci. - 1975. -V. 254. - Р. 331.
The prospects of application of crystallographic methods of diagnostics of al-
veococcosis in Kirov area
S.P. Ashihmin, O.B. Zhdanova, O.V. Maslennikova, O.A. Pestrikova, L.R.
Mutoshvili, A.K. Martusevich, P.G. Rasputin, E.S. Kljukina
Crystallographic methods are the indicator of the structure and physical and chemical properties of the liquid biological environment, capable to display the metabolic status of the organism and having big volume of the information on its condition, and can be used for diagnostics of alveococcosis of rats and people.
Keywords: alveococcosis, animals, people, diagnostics, crystallography.
