CC BY
0Ветеринарный врач. 2024. № 5. С. 60- 64
The Veterinarian. 2024; (5): 60- 64
Научная статья
УДК 619.615.2/661.155.3
DOI: 10.33632/1998-698Х 20245 60
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТОВ ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ВАКЦИН
Степан Александрович Васильев, stepanvasilev0451@gmail.com
Кристина Николаевна Царькова, car-cristina@rambler.ru
Мария Игоревна Круглова, vnitibp@mail.ru
Ирина Николаевна Матвеева, доктор биологических наук, профессор, biolog1967@mail.ru
Вера Михайловна Попова, доктор биологических наук, vnitibp@mail.ru
и
Всероссийский
научно-исследовательский
технологический
институт
биологической
промышленности, г/о Лосино-Петровский, Московская область, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Степан Александрович Васильев
Аннотация. На данный момент все большую популярность в ветеринарии приобретают рекомбинантные субъединичные белковые вакцины. Они изготавливаются с использованием определенных белковых антигенов, которые получают в различных системах. Ключевым этапом производства рекомбинантной вакцины является выбор экспрессионной системы. Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris становятся все более распространённой системой-хозяином для производства рекомбинантных субъединичных вакцин, поскольку они обладают хорошими ростовыми характеристиками и не требуют дорогих питательных сред для роста. На базе данных клеток уже разработаны прототипы вакцин не только для таких известных ветеринарных болезней, как кокцидиоз кур, цирковирус свиней второго типа, но также используется для получения бычьего рекомбинантного интерферона, вакцинации против клещей крупного рогатого скота. Тем не менее, к недостаткам Pichia pastoris можно отнести сравнительно меньшую эффективность трансформации и сложность в работе с промоторами и необходимость в использовании метанола в питательной среде для улучшения экспрессии целевого белка. Хотя многие базовые элементы системы экспрессии P. pastoris в настоящее время хорошо изучены, все еще есть возможности для дальнейшей оптимизации производства белка. Смещение кодонов, регуляция фолдинга белка эндоплазматического ретикулума и условия культивирования являются важными факторами для улучшения производства антигенов рекомбинантных вакцин.
Ключевые слова: Pichia pastoris; экспрессионная система; оптимизация; рекомбинантные белки; субъединичные вакцины
Для цитирования: Васильев С.А., Царькова К.Н., Круглова М.И., Матвеева И.Н., Попова В.М. Перспективы применения дрожжей Pichia pastoris в качестве продуцентов для рекомбинантных ветеринарных вакцин // Ветеринарный врач. 2024. № 5. С. 60- 64. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_5_60
PROSPECTS FOR USING PICHIA PASTORIS YEAST AS PRODUCERS FOR RECOMBINANT
VETERINARY VACCINES
Stepan A. Vasiliev, stepanvasilev0451@gmail.com
Kristina N. Tsarkova, car-cristina@rambler.ru
Maria I. Kruglova, vnitibp@mail.ru
Irina N. Matveyeva, doctor of biological sciences, Professor, biolog1967@mail.ru
Vera M. Popova, doctor of biological sciences, vnitibp@mail.ru
All-Russian Research and Technological Institute of Biological Industry, Losino-Petrovsky, Moscow Region, Russian Federation
Corresponding author: Stepan Aleksandrovich Vasiliev.
61
Abstract. Currently, recombinant subunit protein vaccines are becoming increasingly popular in veterinary medicine. They are produced using specific protein antigens obtained in various systems. The key stage in the production of a recombinant vaccine is the choice of an expression system. Methylotrophic yeast Pichia pastoris is becoming an increasingly common host system for the production of recombinant subunit vaccines, since they have good growth characteristics and do not require expensive nutrient media for growth. Based on these cells, vaccine prototypes have already been developed for such common veterinary diseases as chicken coccidiosis, porcine circovirus type 2, is used to produce bovine recombinant interferon, and vaccination against cattle ticks. However, the disadvantages of pichia pastoris include a relatively lower transformation efficiency and difficulty in working with promoters and the need to use methanol in the nutrient medium to improve expression of the target protein. Although many basic elements of the P. pastoris expression system are now well understood, there is still room for further optimization of protein production. Codon bias, regulation of endoplasmic reticulum protein folding, and culture conditions are important factors for improving the production of recombinant vaccine antigens.
Keywords: Pichia pastoris; expression system; optimization; recombinant proteins; subunit vaccines
Введение. На данный момент, одной из ключевых задач для получения рекомбинантной вакцины, является выбор платформы продуцента для его производства. К уже используемым экспресси-онным системам относятся: бактерии, дрожжи, плесневые грибки, млекопитающие, растения и насекомые. Прокариотические клетки, такие как грамотрицательные бактерии, являются одними из первых клеток, используемых в инженерных генетических технологиях. Наиболее широко применяется микроорганизм Escherichia coli, который широко используется для клонирования рекомбинантной ДНК и, впоследствии, для производства гетерологичных белков [1].
Бактериальная экспрессионная система обладает рядом преимуществ, включая быстрый рост, простые и недорогие требования к питательным средам, высокий уровень экспрессии и быстрый и легкий процесс трансформации. Однако эта клеточная фабрика имеет некоторые ограничения, такие как внутриклеточная агрегация и неправильное сворачивание гетерологичных белков, выработка липополисахаридов, отсутствие посттрансляционных модификаций и деградация белка под действием протеаз [2].
Другой частью экспрессионных систем являются эукариотические клетки, которые включают клетки млекопитающих и дрожжей. Наиболее распространенными клеточными линиями млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (CHO). В настоящее время клетки CHO используются для производства биофармацевтических соединений, моноклональных антител и Fc-слитых белков. Значительные преимущества этой системы включают надлежащее сворачивание белка, посттрансляционные модификации и гликозилирование рекомбинантных белков в правильных сайтах, что важно для стабильности белка. Ключевыми недостатками данной системы являются дорогостоящие питательные среды и высокий риск контоминации [3].
Дрожжи также широко используются для экспрессии нескольких ряда белков в производстве вакцин и фармацевтических препаратов. Механизм экспрессии белка в этих микроорганизмах близок к механизму экспрессии белка в клетках млекопитающих. По сравнению с бактериями дрожжевые клетки обладают значительными преимуществами, включая скорость роста, секреторную экспрессию и простоту генетических манипуляций. Более того, линеаризованная чужеродная ДНК может быть с высокой эффективностью введена в хромосому с помощью феномена перекрестной рекомбинации для создания стабильных клеточных линий [4].
Весьма широко в промышленности используются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, например, для производства вакцин против гепатита В и вируса папилломы человека, обе из которых получили широкое распространение. Однако, их недостатком является то, что экспрессируемые в S. cerevisiae белки часто N и O-гипергликозилированы, что может влиять на иммуногенные свойства белка [5].
Из-за этого недостатка, вид дрожжей P. pastoris становится все более популярным продуцентом. Этот микроорганизм может продуцировать высокие выходы рекомбинантных белков с высоким сходством процесса гликозилирования с клетками млекопитающих, обладает хорошими ростовыми качествами и не требует использования дорогостоящих питательных сред [6].
На базе клеток Pichia pastoris уже разработаны прототипы вакцин для таких распространенных ветеринарных заболеваний, как кокцидиоз кур [7], Цирковирус свиней второго типа [8], используется для получения бычьего рекомбинантного интерферона [9], вакцинации против клещей крупного рогатого скота [10].
62
Целью данной работы является разбор основных особенностей данной экспрессионной системы, выявление ее достоинств и недостатков и оценка ее перспектив при разработки ветеринарных вакцин.
Swal
Swal
касета
Ib-hrI р fooiT
Тип промотора: “Конститутивный -Индуцируемый
Тип селекции:
-отбор клонов с антибиотическим маркером на селективной среде
-отбор ауксотрофных муганто!
Рисунок 1 - Общие сведенья по системе гетерологичной экспрессии генов в P. pastoris. Экс-прессионные плазмиды, несущие гены интереса, линеаризуются с помощью эндонуклеаз рестрикции перед трансформацией. Для наработки плазмиды в клетках E. coli требуются селективные маркеры (например, AmpR) и ориджин начала репликации (Ori). Уровень экспрессии интересующего белка может зависеть от (i) локуса хромосомной интеграции, на который нацелены 5‘ и 3‘ гомологичные области (5′HR и 3′HR), и от числа копий гена. Сигнальные последовательности пептидов будут влиять на внутриклеточный или секреторный путь экспрессии экспрессии, что важно для выбора стратегии очистки [6].
/Экспресснонная
ТТ
Интеграция генетического материала может происходить &виде гомо/югическойи>еком-оинэции, эктопической интеграции или одиночной/мульт. вставкой в геном
Секреция внутр!^' белка
Преимущества и недостатки экпрессионной системы P. pastoris. Одним из преимуществ системы Pichia является ее высокое сходство с передовыми эукариотическими экспрессионными системами, такими как клеточные линии CHO. Эта дрожжевая система недорогая, у нее также относительно быстрое время экспрессии, котрансляционный и посттрансляционный процессинг.С помощью промышленных биореакторов интересующие белки могут быть получены в больших масштабах из небольших объемов культивирования. В экспрессионной системе P. pastoris из-за ограниченной продукции эндогенных секреторных белков очистка рекомбинантного белка проста [11].
Еще одним преимуществом P. pastoris в качестве хозяина-продуцента белка является его способность выполнять посттрансляционные модификации- такие как О- и N-связанное гликозилирование и образование дисульфидных связей. Многие терапевтические белки представляют собой гликопротеины и требуют присоединения углеводных структур к белковому каркасу (гликозилирование) для обеспечения правильного сворачивания, растворимости, стабильности и надлежащей биологической активности [12]. В дрожжевых клетках существует два основных типа гликозилирования (N-связанное и O-связанное гликозилирование), которое происходит в эндоплазматическом ретикулуме или аппарате Гольджи.
Однако, как и другие системы экспрессии, данная экспрессионная система имеет ряд недостатков. На стадии трансформации, в отличие от бактериальной системы, компетентным клеткам требуется большое количество плазмидной ДНК. Количество трансформантов также несколько ниже, чем у организмов в других экспрессонных системах Продукция рекомбинантного белка в этой системе регулируется двумя промоторами: промотором глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Pgap) и промотором AOX (Paoxi) [13].
Производство рекомбинантного белка в дрожжевых системах зависит от потребления метанола, в среднем около 2-3% в составе среды. Обычно концентрация метанола до 5% допустима для организмов, но высокие уровни концентрации метанола (выше 5%) очень токсичны для жизнеспособности клеток и могут остановить процесс производства [14], однако стоит отметить, что ряд современных штаммов оптимизированы под условия без присутствия этанола.
63
Ветеринарные вакцины, получаемые в системе Pichia pastoris. Рекомбинантные белковые терапевтические средства - растущий рынок в индустрии медицинской биотехнологии человека. Большинство всех одобренных биофармацевтических препаратов основаны на белках и включают факторы крови, антикоагулянты, гормоны, гемопоэтические факторы роста, интерфероны, интерлейкины, вакцины и моноклональные антитела. Производство вакцин является одной из основных стратегий защиты от инфекционных заболеваний.
Производство вакцин на основе клеток P. pastoris требует оптимизации экспресионной конструкции и подбора индивидуальных условий роста. На базе P. pastoris была разработана вакцина против кокцидиоза кур для создания которых нарабатывали белок EtMIC2 из штамма Eimeria tenella дикого типа SD-01 [7], на основе cap-белка разработано несколько вариантов вакцин против цирковируса свиней второго типа[8], также разработаны платформы для коммерческой наработки рекомбинантного интерферона [9] и вакцины «Гавак» для иммунизации против клещей крупного рогатого скота [10]. На основе белка F был разработан прототип вакцины против вируса Ньюкасла [15].
Заключение. Получение рекомбинантных ветеринарных вакцин, требует все большей оптимизации систем экспрессии и P. pastoris является одним из самых популярных и стандартных инструментов для получения рекомбинантного белка в молекулярной биологии.
Хотя системы экспрессии P. pastoris впечатляют и просты в использовании благодаря четко определенным технологическим протоколам, требуется определенная степень оптимизации процесса для достижения максимальной продукции целевых белков. В целом, можно сказать перспективы использования данной экспрессионной системы многообещающие, однако опыт разработки ветеринарных вакцин, показывает что разработка каждой отдельной вакцины требует процесса оптимизации.
Список источников
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 1999 Oct;10(5):411-21.
Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014 Apr 17;5:172.
Picango-Castro, V., Cristina Correa de Freitas, M., Bomfim, A., & Maria de Sousa Russo, E. (2014). Patents in therapeutic recombinant protein production using mammalian cells. Recent Patents on Biotechnology, 8(2), 165-171.
Wang M, Jiang S, Wang Y. Recent advances in the production of recombinant subunit vaccines in Pichia pastoris. Bioengineered. 2016 Apr;7(3):155-65.
Rasala, B. A. , & Mayfield, S. P. (2015). Photosynthetic biomanufacturing in green algae; production of recombinant proteins for industrial, nutritional, and medical uses. Photosynthesis Research, 123(3), 227239.
Ahmad, M. , Hirz, M. , Pichler, H. , & Schwab, H. (2014). Protein expression in Pichia pastoris: Recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Applied Microbiology and Biotechnology, 98(12), 5301-5317.
Zhang J, Chen P, Sun H, Liu Q, Wang L, Wang T, Shi W, Li H, Xiao Y, Wang P, Wang F, Zhao X. Pichia pastoris expressed EtMic2 protein as a potential vaccine against chicken coccidiosis. Vet Parasitol. 2014 Sep 15;205(1-2):62-9. doi: 10.1016/j.vetpar.2014.06.029. Epub 2014 Jul 7.
Silva JG, Coimbra EC, Jesus AL, Mariz FC, Silva KM, Lobato ZI, Campos AC, Coutinho LC, Castro RS, Freitas AC. Secretory expression of Porcine Circovirus Type 2 capsid protein in Pichia pastoris. J Virol Methods. 2014 Oct;207:226-31. doi: 10.1016/j.jviromet.2014.07.021. Epub 2014 Jul 24.
An R, Zhang R, Guo Y, Geng J, Si M, Wang S, Gao M, Wang J. Biological Activity of Optimized Codon Bovine Type III Interferon Expressed in Pichia pastoris. Viruses. 2023 Apr 30;15(5): 1101.
Canales M, Enr^quez A, Ramos E, Cabrera D, Dandie H, Soto A, Falcon V, Rodriguez M, de la Fuente J. Large-scale production in Pichia pastoris of the recombinant vaccine Gavac against cattle tick. Vaccine. 1997 Mar;15(4):414-22.
11. Tachioka, M., Sugimoto, N., Nakamura, A. et al. Development of simple random mutagenesis protocol for the protein expression system in Pichia pastoris . Biotechnol Biofuels 9, 199 (2016).
12. Cereghino, G. P. L., Cereghino, J. L., Ilgen, C., & Cregg, J. M. (2002). Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichiapastoris . Current Opinion in Biotechnology, 13(4), 329-332.
13. Rajamanickam, V, Metzger, K, Schmid, C, & Spadiut, O. (2017). A novel bi-directional promoter system allows tunable recombinant protein production in Pichiapastoris . Microbial Cell Factories, 16(1), 152.
64
14. Santoso, A. , Herawati, N. , & Rubiana, Y. (2012). Effect of methanol induction and incubation time on expression of human erythropoietin in methylotropic yeast Pichia pastoris . Makara Journal of Technology , 16(1), 29-34.
References
1. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 1999 Oct;10(5):411-21.
2. Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014 Apr 17;5:172.
3. Picango-Castro, V., Cristina Correa de Freitas, M. , Bomfim, A. , & Maria de Sousa Russo, E. (2014). Patents in therapeutic recombinant protein production using mammalian cells. Recent Patents on Biotechnology , 8(2), 165-171.
4. Wang M, Jiang S, Wang Y. Recent advances in the production of recombinant subunit vaccines in Pichia pastoris. Bioengineered. 2016 Apr;7(3):155-65.
5. Rasala, B. A., & Mayfield, S. P. (2015). Photosynthetic biomanufacturing in green algae; production of recombinant proteins for industrial, nutritional, and medical uses. Photosynthesis Research, 123(3), 227239.
6. Ahmad, M., Hirz, M., Pichler, H., & Schwab, H. (2014). Protein expression in Pichia pastoris: Recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Applied Microbiology and Biotechnology , 98(12), 5301-5317.
7. Zhang J, Chen P, Sun H, Liu Q, Wang L, Wang T, Shi W, Li H, Xiao Y, Wang P, Wang F, Zhao X. Pichia pastoris expressed EtMic2 protein as a potential vaccine against chicken coccidiosis. Vet Parasitol. 2014 Sep 15;205(1-2):62-9.
8. Silva JG, Coimbra EC, Jesus AL, Mariz FC, Silva KM, Lobato ZI, Campos AC, Coutinho LC, Castro RS,
Freitas AC. Secretory expression of Porcine Circovirus Type 2 capsid protein in Pichia pastoris. J Virol Methods. 2014 Oct;207:226-31. doi: 10.1016/j.jviromet.2014.07.021. Epub 2014 Jul 24. PMID:
25066279.
9. An R, Zhang R, Guo Y, Geng J, Si M, Wang S, Gao M, Wang J. Biological Activity of Optimized Codon Bovine Type III Interferon Expressed in Pichiapastoris. Viruses. 2023 Apr 30;15(5): 1101.
10. Canales M, Enr^quez A, Ramos E, Cabrera D, Dandie H, Soto A, Falcon V, Rodriguez M, de la Fuente J. Large-scale production in Pichia pastoris of the recombinant vaccine Gavac against cattle tick. Vaccine. 1997 Mar;15(4):414-22.
11. Tachioka, M., Sugimoto, N., Nakamura, A. et al. Development of simple random mutagenesis protocol for the protein expression system in Pichia pastoris . Biotechnol Biofuels 9, 199 (2016).
12. Cereghino, G. P. L, Cereghino, J. L., Ilgen, C., & Cregg, J. M. (2002). Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichiapastoris . Current Opinion in Biotechnology, 13(4), 329-332.
13. Rajamanickam, V., Metzger, K., Schmid, C., & Spadiut, O. (2017). A novel bi-directional promoter system allows tunable recombinant protein production in Pichia pastoris . Microbial Cell Factories, 16(1), 152.
14. Santoso, A., Herawati, N., & Rubiana, Y. (2012). Effect of methanol induction and incubation time on expression of human erythropoietin in methylotropic yeast Pichia pastoris . Makara Journal of Technology, 16(1), 29-34.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 16.09.2024;
© Васильев С.А., Царькова К.Н., Круглова М.И., Матвеева И.Н., Попова В.М. 2024
