CC BY
35
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОЕДИНЕНИЙ С ДЛИТЕЛЬНЫМ ВРЕМЕНЕМ ЗАТУХАНИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ
Осин Н.С., Ивановская Н.П., Сухин Г.М.
ГНЦ ФГУП «Г осударственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения» Федерального медико-биологического агентства, Москва, Россия, niibp@dol.ru
Проведены экспериментальные исследования по изучению аутофлуоресценции и распределению фосфоресцентной метки Pt-копропорфирина в органах и тканях мышей, в том числе в привитых опухолях (саркома) мышечной ткани. Показано, что в режиме временного разрешения с выделением сигнала фосфоресценции с длительностью 40-80 мксек Pt-копропорфирин надежно регистрируется ex vivo в концентрациях менее чем 20 мкг/кг.
Люминесцентные методы диагностики in vivo рассматриваются как необходимый инструмент для обнаружения, идентификации и определения размеров опухолей без хирургического вмешательства. Фотосенсибилизаторы, применяемые для фотодинамической терапии, часто используют и для диагностики опухолей. Однако, они не могут конкурировать по своим характеристикам со специализированными диагностическими реагентами. Принципиальное отличие последних заключается в том, что диагностические реагенты имеют многократно более низкую общую и фототоксичность, имеют высокую тропность к опухолям, которая сочетается с высоким квантовым выходом люминесценции. Как правило, люминесценция диагностических реагентов слабо поглощается биологическими тканями, благодаря тому, что их область излучения расположена в «окне прозрачности» тканей. Важно подчеркнуть, что снижения общей и фототоксичности можно достигнуть снижением концентрации диагностических реагентов. Принципиальным ограничением для этого остается собственная аутофлуоресценция органов и тканей. Как правило, из-за высокого уровня аутофлуоресценции не удается использовать фотосенсибилизаторы для диагностических целей в концентрациях ниже чем 50-100 мкг/кг массы тела.
Известно, что аутофлуоресценция в видимой и ближней инфракрасной области спектра обусловлена достаточно большим набором молекулярных соединений и в основном сосредоточена в наносекундном диапазоне времен затухания.
Наша цель заключалась в том, чтобы оценить возможность снижения концентрации диагностических реагентов за счет использования соединений с длительным временем затухания люминесценции. В качестве люминесцентного маркера опухолей использовали тетракалиевую соль Pt копрпорфирина (Pt-КП) в забуференном физиологическом растворе. При комнатной температуре в водных растворах, освобожденных от кислорода, Pt-КП обладает фосфоресценцией с максимумом 645 нм с постоянной времени затухания около 80 микросекунд.
Опыты проводили на беспородных белых мышах с привитой саркомой мышечной ткани в область бедра. Внутривенно вводили по 0,2 мл раствора с Pt-КП с таким расчетом, чтобы концентрация составляла 20 мкг/ кг массы мыши. Регистрацию сигнала длительной люминесценции от органов и тканей мыши ex vivo осуществляли на специализированном фосфориметре (разработка ФГУП ГосНИИБП) путем сканирования их поверхности при возбуждении светом с длиной волны 532 нм или 380 нм. Регистрацию осуществляли от органов и тканей, помещенных на дно лунок полистиролового микропланшета, в режиме стробоскопирования с задержкой между актом возбуждения и приемом сигнала -40 микросекунд и временем регистрации строба - 80 микросекунд. Собственную (длительную) аутофлуоресценцию органов и тканей мыши оценивали в том же режиме, но на длине волны 615 нм. Предварительные эксперименты показали, что
уровень аутофлуоресценци в режиме временного разрешения на длине волны 615 нм близок уровню аутофлуоресценции на длине волны 645 нм.
На рисунке представлены сводные данные определения ex vivo длительной люминесценции органов и тканей мыши до и после введения раствора Pt-КП ( через 1-4 часа).
Рисунок - Интенсивность люминесценции органов и тканей мышей с саркомой мышцы до (1) и после (2) в/в введения Pt-КП
По уровню накопления Pt-КП органы и ткани мыши различаются весьма существенно.
Минимальный уровень собственной длительной люминесценции до и после введения Pt-КП имеет кровь. Во многом это обусловлено высоким содержанием кислорода и сильным тушащим эффектом от гемоглобина.
Максимальной аутофлуоресценцией обладает желудочно-кишечный тракт. Свечение обусловлено микрофлорой. Специальная очистка желудочно-кишечного тракта приводила к 10-20 кратному снижению сигнала аутофлуоресценции. Максимальный контраст, как соотношение сигналов до и после введения Pt-КП, наблюдался для печени и составил 20-50 раз. Преимущественное накопление Pt-КП в опухоли по отношению к мышечной ткани оказалось достоверным для всех мышей. Превышение сигнала Pt-КП в опухоли над сигналом Pt-КП от мышцы варьировало в диапазоне от 4,8 до 1,5 раз.
Следует особо подчеркнуть, что регистрация Pt-КП в модельной системе ex vivo моджет существенно отличаться от аналогичных экспериментов in vivo. Фосфоресценция Pt-КП тушится растворенным кислородом. Наши исследования постоянной времни затухания в отдельных органах и тканях показали, что Pt-КП имеет длительность затухания около 40-60 микросекунд, что соответствует условиям неглубокой гипокисии с содержанием кислорода на уровне 2-5 %.
Представленные данные однозначно указывают на то, что уровень аутофлуоресценции в режиме временного разрешения существенно ниже, чем уровень сигнала после введения Pt-КП, что позволяет достоверно регистрировать его распределение в концентрации 20 мкг/кг массы и ниже. Pt-КП можно рассматривать в качестве фосфоресцентной метки для маркирования биологически активных соединений обладающих тропностью к опухолям.
Работа выполнена при поддержке проекта МНТЦ 3065.
